纳米药物控释体系的制备方法及其产品与应用

摘要

本发明公开了一种纳米药物控释体系的制备方法，包括以下步骤：(1)制备纳米级红细胞膜囊泡；(2)制备具有光敏性的载药氧化石墨烯；(3)制备靶向分子；(4)制备纳米药物控释体系。本发明通过红细胞囊泡的包埋可避免纳米载体被体内某些蛋白包被形成所谓的“蛋白冠”，保证靶向分子的活性；其次红细胞囊膜泡为人体内存在的生物相容性好，无毒副作用，不会引起排异反应；再次红细胞的包埋囊泡可有效降低氧化石墨烯的表面自由能，增加纳米药物控释体系的分散性；而且在氧化石墨烯上吸附了光敏剂吲哚菁绿，可结合光热治疗，进一步增强了纳米药物控释体系的抗肿瘤效果。

权利要求

1.一种纳米药物控释体系的制备方法，包括以下步骤：（1）制备纳米级红细胞膜囊泡：

取人抗凝新鲜全血，进行离心和裂解细胞，得到红细胞膜；将红细胞膜进行超声和抽提后，获得纳米级红细胞膜囊泡；

（2）制备具有光敏性的载药氧化石墨烯：将氧化石墨烯、吲哚菁绿和药物进行混合，得到混合物，接着向混合物中加入PBS缓冲液，避光搅拌反应，然后将产物进行透析，除去未与氧化石墨烯结合的吲哚菁绿和药物，得到具有光敏性的载药氧化石墨烯；

（3）制备靶向分子：将叶酸溶于二甲基亚砜中，加入磷脂聚乙二醇氨基，避光搅拌反应，将产物进行透析，除去未与磷脂聚乙二醇氨基结合的叶酸，得到靶向分子；

（4）制备纳米药物控释体系：将步骤（1）中纳米红细胞膜囊泡与步骤（3）中的靶向分子混合后加入PBS，进行搅拌反应，得到具有靶向性的红细胞膜囊泡；然后将具有靶向性的红细胞膜囊泡与步骤（2）中的具有光敏性的载药氧化石墨烯混合，超声后进行第二次搅拌反应，反应完成后，得到纳米药物控释体系；

所述步骤（ 2）中，药物为阿霉素，氧化石墨烯、吲哚菁绿和药物的质量比为1:(0.25~

1):(0.5 2)；

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所述步骤（3）中，所述叶酸与磷脂聚乙二醇氨基的质量比为1:(3 5)，叶酸与二甲基亚~砜的质量体积比为(12 15):1mg/ml；搅拌反应时间为6 24h；透析时间为12 24h；

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所述步骤（4）中，靶向分子与纳米红细胞膜囊泡的质量比为(5 10):1；靶向性的红细胞~膜囊泡与具有光敏性的载药氧化石墨烯的质量比为(1 4):1。

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2.根据权利要求1所述的纳米药物控释体系的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中，超声时间为10 50 min；所采用的抽提装置为针头滤器，其孔径为200 400nm。

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3.根据权利要求1所述的纳米药物控释体系的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中，搅拌反应时间为6 24h；超声时间为 30 60min；第二次搅拌反应时间为6 24h。

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4.根据权利要求1所述的纳米药物控释体系的制备方法，其特征在于，所述步骤（ 2）中，混合物与PBS溶液的质量体积比为(1.75 4):1 mg/ml。

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5.根据权利要求1 4中任意一项所述的纳米药物控释体系的制备方法制备得到纳米药~物控释体系。

说明书

纳米药物控释体系的制备方法及其产品与应用

技术领域

[0001] 本发明属于医药技术领域，具体涉及一种纳米药物控释体系及其制备方法与应用。

背景技术

[0002] 纳米药物缓控释体系可有效的提高药物的利用率，降低药物的毒副作用，是现代医药发展的突破口。靶向性的纳米药物控释体系是在纳米药物载体上进行靶向性基团修饰，达到提高药物输送的选择性和疾病治疗的有效性的目的。但是常规纳米载体颗粒的表面自由能较高，因而其在生物基质(如血浆)中容易被免疫球蛋白等快速包被形成所谓的“蛋白冠”，不仅促进网状内皮系统对其清除，而且还会遮蔽纳米粒子表面修饰的靶向分子，失去靶向性，从而导致药物的循环半衰期短，生物利用度低，有效到达病灶部位的药物量较低，治疗效果差的缺陷。目前为降低纳米药物载体的表面自由能，通常采用聚乙二醇(PEG)、聚乙烯亚胺(PEI)等对纳米药物载体进行修饰增强其分散性及生物相容性，但这些材料作为外源物质仍具有一定的毒副作用，难以避免内皮系统对药物载体的清除，导致靶向性降低的缺陷。

发明内容

[0003] 本发明的目的是提供一种靶向性好、无毒副作用的纳米药物控释体系的制备方法及其产品与应用。

[0004] 本发明提供的纳米药物控释体系的制备方法，包括以下步骤：

[0005] (1)制备纳米级红细胞膜囊泡；

[0006] (2)制备具有光敏性的载药氧化石墨烯；

[0007] (3)制备靶向分子；

[0008] (4)制备纳米药物控释体系：

[0009] 将步骤(1)中纳米红细胞膜囊泡与步骤(3)中的靶向分子混合后加入PBS，进行搅拌反应，得到具有靶向性的红细胞膜囊泡；然后将具有靶向性的红细胞膜囊泡与步骤(2)中的具有光敏性的载药氧化石墨烯混合，超声后进行第二次搅拌反应，反应完成后，得到纳米药物控释体系。

[0010] 所述步骤(1)中，纳米级红细胞膜囊泡的制备，包括以下步骤：

[0011] 取人抗凝新鲜全血，进行离心和裂解细胞，得到红细胞膜；将红细胞膜进行超声和抽提后，获得纳米级红细胞膜囊泡；其中超声时间为10～50min；所采用的抽提装置为针头滤器，其孔径为200～400nm。

[0012] 所述步骤(2)中，载药氧化石墨烯的制备，包括以下步骤：将氧化石墨烯、吲哚菁绿和药物进行混合，得到混合物，接着向混合物中加入PBS缓冲液，避光搅拌反应，然后将产物进行透析，除去未与氧化石墨烯结合的吲哚菁绿和药物，得到具有光敏性的载药氧化石墨烯。所述混合物中氧化石墨烯、吲哚菁绿和药物的质量比为1:(0.25～1):(0.5～2)；混合物与PBS溶液的质量体积比为(1.75～4):1mg/ml。所述药物为治疗癌症药物中的一种。

[0013] 所述步骤(3)中，靶向分子的制备，包括以下步骤：将叶酸溶于二甲基亚砜中，加入磷脂聚乙二醇氨基，避光搅拌反应，将产物进行透析，除去未与磷脂聚乙二醇氨基结合的叶酸，得到靶向分子。所述叶酸与磷脂聚乙二醇氨基的质量比为1:(3～5)，叶酸与二甲基亚砜的质量体积比为(12～15):1mg/ml；搅拌反应时间为6～24h；透析时间为12～24h。

[0014] 所述步骤(4)中，靶向分子与纳米红细胞膜囊泡的质量比为(5～10):1；靶向性的红细胞膜囊泡与具有光敏性的载药氧化石墨烯的质量比为(1～4):1；搅拌反应时间为6～24h；超声时间为30～60min；第二次搅拌反应时间为6～24h。

[0015] 所述的纳米药物控释体系的制备方法制备得到纳米药物控释体系。

[0016] 本发明的有益效果：

[0017] 本发明通过采用红细胞膜囊泡结合靶向分子将载药的氧化石墨烯包埋形成了一个新的纳米药物控释体系，通过红细胞囊泡的包埋可避免纳米载体被体内某些蛋白包被形成所谓的“蛋白冠”，保证靶向分子的活性；其次红细胞囊膜泡为人体内存在的生物相容性好，无毒副作用，不会引起排异反应；再次红细胞的包埋可有效降低氧化石墨烯的表面自由能，增加纳米药物控释体系的分散性；而且在氧化石墨烯上吸附了光敏剂吲哚菁绿，可结合光热治疗，进一步增强了纳米药物控释体系的抗肿瘤效果。

附图说明

[0018] 图1实施例1的制备流程图；

[0019] 图2实施例2中纳米粒子的平均尺寸；

[0020] 图3实施例2中纳米粒子的TEM图；(a)GID，(b)RM,(c)F-RGID；

[0021] 图4实施例2中不同浓度的GID，RGID，F-RGID的溶血率；

[0022] 图5实施例2中(A)小鼠腹腔巨噬细胞对GID，RGID，F-RGID的吞噬情况；(B)荧光仪定量检测巨噬细胞吞噬后荧光强度；

[0023] 图6实施例3中纳米药物控释体系在治疗小鼠肿瘤的示意流程图；

[0024] 图7实施例3中靶向性研究效果图：(A)活体动物成像检测GID，RGID，F-RGID在小鼠体内分布.(B)GID，RGID，F-RGID在心、肝、脾、肺、肾及肿瘤内分布；(C)GID，RGID，F-RGID在组织内分布定量分析；

[0025] 图8实施例3中光热效应研究效果图：(A)红外成像图；(B)近红外光照后不同材料组肿瘤部位温度变化；

[0026] 图9实施例3中纳米药物控释体系在治疗大鼠肿瘤的效果图(A)体重变化，(B)肿瘤体积变化，(C)肿瘤实物图。

具体实施方式

[0027] 实施例1

[0028] 本实施例的制备流程图如图1所示，其具体制备步骤如下：

[0029] (1)制备纳米级红细胞膜囊泡(RM)

[0030] 取健康人抗凝新鲜全血，3000rpm离心5min，弃去上层血浆及白细胞血小板；加入30倍体积的0.25×PBS低渗液裂解红细胞，释放出血红蛋白，接着14000rpm离心10min，弃去上层血红蛋白，收集底部红细胞膜，再次加入低渗液PBS清洗红细胞膜，至上层清液无色，收集底部淡红色的红细胞膜溶液。取50ul红细胞膜溶液加1mlPBS，置于超声清洗仪超声10min(350W)，然后将超声后的红细胞膜置于400nm针头滤器来回抽提，获得纳米级红细胞膜囊泡(RM)。

[0031] (2)制备具有光敏性的载药氧化石墨烯(GID)

[0032] 将4mg氧化石墨烯、2mg吲哚菁绿和5mg阿霉素(DOX)按照进行混合，加入PBS 4ml，避光搅拌24h，然后将反应后的产物加入到透析袋内，进行透析24h，去除将未与氧化石墨烯的吲哚菁绿和阿霉素，透析完成后，得到载药氧化石墨烯(GID)，其药物负载率为46.1％，包封率为95.3％。

[0033] (3)制备靶向分子(F)

[0034] 取6.25mg叶酸(Folic acid，F)溶于0.5ml DMSO中，接着加入25mg磷脂聚乙二醇氨基(DSPE-PEG2000-NH2)，避光搅拌24h，反应完成后，将产物置于透析袋中透析24h，去除未与DSPE-PEG2000-NH2结合的叶酸，透析完成后，得到靶向分子(F)。

[0035] (4)制备纳米药物控释体系(F-RGID)

[0036] 将5mg靶向分子(F)与1mg红细胞膜囊泡(RM)进行混合，加入PBS 1ml，并避光搅拌反应24h，得到具有靶向性的红细胞膜囊泡(F-R)；然后将6mgF-R与6mg GID进行混合，加入PBS 1ml，超声20min后，进行第二次避光搅拌反应24h，反应完成后，得到纳米药物控释体系(F-RGID)。

[0037] 对比例1

[0038] 采用实施例1制备的纳米级红细胞膜囊泡(RM)和载药氧化石墨烯(GID)。将2mg GID与2mg RM进行混合，加入PBS 1ml，超声20min后，进行第二次避光搅拌反应24h，反应完成后，得到纳米药物控释体系(RGID)。

[0039] 实施例2

[0040] (1)粒子尺寸与微观测试

[0041] 对实施例1制备的纳米级红细胞膜囊泡(RM)、载药氧化石墨烯(GID)、纳米药物控释体系(F-RGID)和对比例1中的纳米药物控释体系(RGID)的尺寸进行检测，其结果如图2所示，GID粒径：167±11nm；RM粒径：143±5nm；RGID粒径：144±9nm；F-RGID粒径：145±7nm。

[0042] 实施例1制备的载药氧化石墨烯(GID)、纳米级红细胞膜囊泡(RM)、纳米药物控释体系(F-RGID)的微观形貌如图3所示，GID呈片状结构，RM粒径大小均一，GID被RM成功包裹。

[0043] (2)生物相容性测试

[0044] 对实施例1制备的载药氧化石墨烯(GID)、纳米药物控释体系(F-RGID)以及对比例1制备的纳米药物控释体系(RGID)的溶血率进行测试。取健康人新鲜红细胞，用PBS稀释为
5％，分别将GID、RGID及F-RGID(终浓度为0、25、50、100、200μg/ml)加入红细胞稀释液中，37℃孵育1h，其结果如图4所示，在最高浓度(200μg/ml)时，GID、RGID及F-RGID溶血率分别为
0.63％、0.55％及0.37％，均低于纳米材料溶血率国际值5％，并且红细胞膜包裹后，溶血率降低。

[0045] 对实施例1制备的载药氧化石墨烯(GID)、纳米药物控释体系(F-RGID)以及对比例1制备的纳米药物控释体系(RGID)对巨噬细胞吞噬情况进行测试。大鼠提前3天腹腔注射淀粉肉汤2ml/只，引颈处死后，腹腔分别注入10ml PBS，抽出细胞悬液，洗涤后加入培养基分于6孔板中，贴壁提纯；然后加入GID、RGID及F-RGID(20μg/ml)处理巨噬细胞30min，在激光共聚焦显微镜下观察拍照。其结果如图5所示，GID被巨噬细胞大量吞噬，而红细胞膜包裹的RGID和F-RGID仅少量吞噬，证明红细胞膜包裹后能逃避网状内皮系统的吞噬清除。

[0046] 实施例3纳米药物控释系统在治疗肿瘤中的应用

[0047] 纳米药物控释体系在治疗大鼠肿瘤的示意流程图如图6所示，其具体步骤如下：

[0048] (1)靶向性研究

[0049] 对实施例1制备的载药氧化石墨烯(GID)、纳米药物控释体系(F-RGID)以及对比例1制备的纳米药物控释体系(RGID)对靶向性进行研究。BALB/c雌性裸鼠(20g左右)，在背外侧通过皮下注射Hela细胞(1×106)。肿瘤体积＝长×宽2/2；当肿瘤体积达到100mm3时，裸鼠随机分为以上3组。通过尾静脉注射GID、RGID、F-RGID的PBS溶液100μl(按照载体中DOX的浓度为1mg/L进行配制)。利用阿霉素的红色荧光，通过小动物多模式成像系统检测药物在体内分布情况。其分布情况如图7A所示，在注射48h内，GID仅少量聚集于肿瘤部位；RGID虽聚集于肿瘤部位，但同时也分散于身体其他部位；F-RGID逐渐聚集于肿瘤部位，身体其他部位聚集较少。其在脏器内的分布情况如图7B，GID主要分布于肝、肺、肾中；RGID虽聚集于肿瘤部位，但是在肝和肾中的含量较大；F-RGID主要集中于肿瘤部位，在肝和肾中仅有少量存在。其在脏器内的定量分布情况如图7C所示，其结果跟7B结果一致。从图7可知，F-RGID能够更好的集中于肿瘤部位，对肿瘤具有很好的靶向效果。

[0050] (2)光热效应研究

[0051] 对实施例1制备的载药氧化石墨烯(GID)、纳米药物控释体系(F-RGID)以及对比例1制备的纳米药物控释体系(RGID)对光热效应进行研究。荷瘤裸鼠分别通过尾静脉注射GID、RGID、F-RGID的PBS溶液100μl(按照载体中DOX的浓度为1mg/L进行配制)，对照组注射
100μl PBS。注射24h后，用激光(808nm，2W/cm2)照射肿瘤5min，分别在0，1，3，5min时用红外成像仪拍照，检测肿瘤温度变化。其结果如图8所示，F-RGID光热效应最佳，这是由于F-RGID靶向定位于肿瘤部位(小动物活体成像证实)，聚集于肿瘤部位多，并且在100s左右温度即可达到42℃，达到杀伤肿瘤细胞所需温度。

[0052] (3)抗肿瘤作用

[0053] 裸鼠荷瘤成功，通过尾静脉注射药物、注射GID、RGID、F-RGID的PBS溶液100μl(按照载体中DOX的浓度为1mg/L进行配制)，并增加激光照射后，每天测量裸鼠体重及肿瘤大小，在第18d进行安乐死处理。取肿瘤组织测量大小及实物拍照。其结果如图9A所示，裸鼠的体重在给药后前4天有一定的降低，特别是单纯DOX用药组裸鼠体重降低最明显，可能为单次大剂量化疗药物应用出现毒副作用，而红细胞膜包裹的RGID和F-RGID组体重变化不明显，可能为DOX包被在细胞膜内，主要定位于肿瘤部位，在正常组织器官内不易释放，毒副作用低。从图9B肿瘤相对体积变化折线图和图9C肿瘤实物图看，PBS组与PBS+激光组肿瘤体积显著增加，两组之间无显著性差异，说明单纯光照不能降低肿瘤体积；DOX组在注射后6天肿瘤体积明显减小，而此后8天肿瘤体积又明显回升，单纯的DOX生物半衰期短，抗肿瘤作用强但时效短；GID与GID+激光组由于GID分散性较差，容易出现聚集，到达肿瘤部位较少，抗肿瘤效果差于DOX组；RGID与RGID+激光组中RGID分散性好，在体内各器官均有分布，但由于在肿瘤部位存在渗透滞留效应，到达肿瘤部位较多，抗肿瘤效果优于DOX组和GID组；F-RGID与F-RGID+激光组中F-RGID分散性好，靶向定位于肿瘤部位，联合激光光热治疗抗肿瘤作用最佳。

[0054] 实施例4

[0055] (1)制备纳米级红细胞膜囊泡(RM)

[0056] 取健康人抗凝新鲜全血，3000rpm离心5min，弃去上层血浆及白细胞血小板；加入30倍体积的0.25×PBS低渗液裂解红细胞，释放出血红蛋白，接着14000rpm离心10min，弃去上层血红蛋白，收集底部红细胞膜，再次加入低渗PBS清洗红细胞膜，至上层清液无色，收集底部淡红色的红细胞膜溶液。取50ul红细胞膜溶液加1mlPBS，置于超声清洗仪超声30min(350W)，然后将超声后的红细胞膜置于300nm针头滤器来回抽提，获得纳米级红细胞膜囊泡(RM)。

[0057] (2)制备具有光敏性的载药氧化石墨烯(GIM)

[0058] 将4mg氧化石墨烯(GO)、1mg吲哚菁绿(ICG)和8mg米妥蒽醌(Mitoxantrone,M)进行混合，加入PBS 3.5ml，避光搅拌12h，然后将反应后的产物加入到透析袋内，进行透析16h，去除将未与氧化石墨烯的吲哚菁绿和米妥蒽醌，透析完成后，得到载药氧化石墨烯(GIM)，其药物负载率为49.1％，包封率为94.3％。

[0059] (3)制备靶向分子(F)

[0060] 取6mg叶酸(Folic acid，F)溶于0.5ml DMSO中，接着加入24mg磷脂聚乙二醇氨基(DSPE-PEG2000-NH2)，避光搅拌6h，反应完成后，将产物置于透析袋中透析12h，去除未与DSPE-PEG2000-NH2结合的叶酸，透析完成后，得到靶向分子(F)。

[0061] (4)制备纳米药物控释体系(F-RGIM)

[0062] 将10mg靶向分子(F)与1mg红细胞膜囊泡(RM)进行混合，加入PBS 1ml，并避光搅拌反应24h，得到具有靶向性的红细胞膜囊泡(F-R)；然后将10mgF-R与2.5mg GIM进行混合，加入PBS 1ml，超声40min后，进行第二次避光搅拌反应12h，反应完成后，得到纳米药物控释体系(F-RGIM)。

[0063] 实施例5

[0064] (1)制备纳米级红细胞膜囊泡(RM)

[0065] 取健康人抗凝新鲜全血，3000rpm离心5min，弃去上层血浆及白细胞血小板；加入30倍体积的0.25×PBS低渗液裂解红细胞，释放出血红蛋白，接着14000rpm离心10min，弃去上层血红蛋白，收集底部红细胞膜，再次加入低渗液PBS清洗红细胞膜至上清液无色，收集底部淡红色的红细胞膜溶液。取50ul红细胞膜溶液加1mlPBS，置于超声清洗仪超声50min(350W)，然后将超声后的红细胞膜置于200nm针头滤器来回抽提，获得纳米级红细胞膜囊泡(RM)。

[0066] (2)制备载药氧化石墨烯(GIP)的

[0067] 将4mg氧化石墨烯(GO)、4mg吲哚菁绿(ICG)和6mg紫杉醇(Paclitaxel,P)进行混合，加入PBS 5.5ml，避光搅拌6h，然后将反应后的产物加入到透析袋内，进行透析12h，去除将未与氧化石墨烯的吲哚菁绿和紫杉醇，透析完成后，得到载药氧化石墨烯(GIP)，其药物负载率为39.1％，包封率为98.3％。

[0068] (3)靶向分子(F)的制备

[0069] 取6mg叶酸(Folic acid，F)溶于0.4ml DMSO中，接着加入26mg磷脂聚乙二醇氨基(DSPE-PEG2000-NH2)，避光搅拌12h，反应完成后，将产物置于透析袋中透析16h，去除未与DSPE-PEG2000-NH2结合的叶酸，透析完成后，得到靶向分子(F)。

[0070] (4)纳米药物控释体系(F-RGIP)的制备

[0071] 将7.5mg靶向分子(F)与1mg红细胞膜囊泡(RM)进行混合，加入PBS 1ml，并避光搅拌反应6h，得到具有靶向性的红细胞膜囊泡(F-R)；然后将8mgF-R与4mg GIP进行混合，加入PBS 1ml，超声60min后，进行第二次避光搅拌反应16h，反应完成后，得到纳米药物控释体系(F-RGIP)