3-O-去甲基-4-N-去甲基-4-N-乙酰基星孢菌素及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种3‑O‑去甲基‑4‑N‑去甲基‑4‑N‑乙酰基星孢菌素及其制备方法和应用，该化合物具有抗肿瘤活性和蛋白激酶抑制作用，可用于制备在蛋白激酶抑制剂类药物和抗肿瘤药物。该制备方法用大米发酵方法从放线菌Streptomyces sp.CICC 11026的发酵产物中制备得到，通过对发酵产物进行乙酸乙酯萃取后，再用凝胶色谱和高效制备液相色谱分离纯化得到，易于操作和实施。

权利要求

1.一种3-O-去甲基-4-N-去甲基-4-N-乙酰基星孢菌素的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将放线菌Streptomyces sp.CICC 11026接种于高氏一号液体培养基中，摇床培养，得到接种有放线菌的发酵培养基；

所述的摇床培养的条件为：25～30℃、150rpm～210rpm摇床培养3～4天；

2)取步骤1)中接种有放线菌的发酵培养基，接种于大米发酵培养基中，静置培养，得到固体发酵产物；

所述的静置培养的条件为：25～30℃静置培养68～73天；

3)将固体发酵产物分离纯化得到3-O-去甲基-4-N-去甲基-4-N-乙酰基星孢菌素；

所述的分离纯化包括：将固体发酵产物用乙酸乙酯萃取，萃取液浓缩后常压凝胶色谱粗分离，得到混合组分；将混合组分通过中压制备液相分离，高效制备液相色谱分离纯化，得到式Ⅰ结构的3-O-去甲基-4-N-去甲基-4-N-乙酰基星孢菌素；

所述的常压凝胶色谱粗分离的条件：采用的填料为羟丙基葡聚糖凝胶，采用的洗脱剂为体积百分数20％-100％的甲醇-水体系；

所述的中压制备液相分离的条件：采用的填料为十八烷基硅烷键合硅胶，采用的流动相为体积百分数40％-100％的甲醇-水溶液；

所述的高效制备液相色谱分离纯化的条件：采用的填料为十八烷基硅烷键合硅胶，采用的流动相为体积百分数40％-48％的乙腈-水溶液；

2.根据权利要求1所述的3-O-去甲基-4-N-去甲基-4-N-乙酰基星孢菌素的制备方法，其特征在于，步骤2)中，所述的大米发酵培养基由大米、水和海盐组成，所述的大米、水与海盐之比为：40g：40mL～80mL：0.5g～3g。

说明书

3-O-去甲基-4-N-去甲基-4-N-乙酰基星孢菌素及其制备方法

和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及放线菌培养制备化合物技术领域，具体涉及一种抗肿瘤活性3-O-去甲基-4-N-去甲基-4-N-乙酰基星孢菌素及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 十字孢碱(STA)早于1977年从土壤中的放线菌的培养基中分离出来的一种吲哚咔唑类生物碱，此后的大量研究表明，其具有多种药理活性如抗肿瘤活性、抗菌作用、抑制血小板聚集等。最重要的是其具有广谱的蛋白激酶抑制活性，如对蛋白激酶C(PKC)、酪氨酸激酶(TPK)，细胞周期依赖性激酶蛋白等。但是由于其对于蛋白激酶的选择性差，而限制了对其的进一步研究。而随后发现的衍生物则呈现一定的抗肿瘤和蛋白激酶抑制活性，并且有多个进入临床试验阶段。如天然来源十字孢碱类衍生物UCN-01已完成和氟二氧嘧啶合用治疗转移性胰腺癌的临床Ⅱ期试验，其半合成得到的衍生物Midostaurin则在治疗FTL3突变急性髓性白血病(AML)临床研究取得了重大突破,并已经成功上市。合成十字孢碱类似物CEP-2563已经完成了治疗实体瘤的Ⅰ期临床研究，Enzastaurin作为选择性蛋白激酶β(PKCβ)抑制剂，正处于治疗淋巴瘤的Ⅲ期临床研究。从已经进入临床试验的十字孢碱类衍生物来看，该类化合物仍然具有进一步开发的前景，挖掘十字孢碱类衍生物，筛选出选择性较优的蛋白激酶抑制剂对于抗肿瘤如急性髓系白血病、结肠癌、非小细胞肺癌、肝癌等以及激酶相关的肿瘤疾病，免疫类疾病如系统性红斑狼疮，眼部疾病如青光眼，神经性变性疾病如阿尔兹海默等新药研发具有重要的社会和经济意义。

发明内容

[0003] 本发明提供了一种3-O-去甲基-4-N-去甲基-4-N-乙酰基星孢菌素及其制备方法和应用，用大米发酵方法从放线菌Streptomyces sp.CICC 11026的发酵产物中制备得到，该化合物具有抗肿瘤活性和蛋白激酶抑制作用，可用于制备在蛋白激酶抑制剂类药物和抗肿瘤药物。

[0004] 一种3-O-去甲基-4-N-去甲基-4-N-乙酰基星孢菌素，为式Ⅰ结构：

[0005]

[0006] 本发明式Ⅰ结构，提供一种具有抗肿瘤活性的3-O-去甲基-4-N-去甲基-4-N-乙酰基星孢菌素的制备方法，由放线菌Streptomyces sp.CICC 11026经大米发酵产生，再通过分离纯化得到，易于操作和实施。

[0007] 一种3-O-去甲基-4-N-去甲基-4-N-乙酰基星孢菌素的制备方法，包括以下步骤：

[0008] 1)将放线菌Streptomyces sp.CICC 11026接种于高氏一号液体培养基中，摇床培养，得到接种有放线菌的发酵培养基；

[0009] 2)取步骤1)中接种有放线菌的发酵培养基，接种于大米发酵培养基中，静置培养，得到固体发酵产物；

[0010] 3)将固体发酵产物分离纯化得到3-O-去甲基-4-N-去甲基-4-N-乙酰基星孢菌素。

[0011] 步骤1)中，放线菌Streptomyces sp.CICC 11026采用中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)市售菌种，编号为11026，选购网址：http://www.china-cicc.org/。

[0012] 所述的摇床培养的条件为：20～35℃、100rpm～300rpm摇床培养2～5天；进一步，所述的摇床培养的条件为：25～30℃、150rpm～210rpm摇床培养3～4天。

[0013] 步骤2)中，所述的大米发酵培养基由大米、水和海盐组成，所述的大米、水与海盐之比为：40g：40mL～80mL：0.5g～3g。

[0014] 所述的静置培养的条件为：23～33℃静置培养60～80天；进一步，所述的静置培养的条件为：25～30℃静置培养68～73天。

[0015] 步骤3)中，所述的分离纯化包括：将固体发酵产物用乙酸乙酯萃取，萃取液浓缩后常压凝胶色谱粗分离，得到混合组分；将混合组分通过中压制备液相分离，高效制备液相色谱分离纯化，得到本发明式Ⅰ结构的化合物。

[0016] 所述的常压凝胶色谱粗分离的条件：采用的填料为羟丙基葡聚糖凝胶(LH-20)，采用的洗脱剂为体积百分数20％-100％的甲醇-水体系，体积百分数20％甲醇-水体系是指甲醇和水的体积比为20：80，体积百分数100％甲醇-水体系是指甲醇和水的体积比为100：0；

[0017] 所述的中压制备液相分离的条件：采用的填料为十八烷基硅烷键合硅胶，采用的流动相为体积百分数40％-100％的甲醇-水溶液，体积百分数40％的甲醇-水溶液是指甲醇和水的体积比为40：60，体积百分数100％的甲醇-水溶液是指甲醇和水的体积比为100：0；

[0018] 所述的高效制备液相色谱分离纯化的条件：采用的填料为十八烷基硅烷键合硅胶，采用的流动相为体积百分数40％-48％的乙腈-水溶液，体积百分数40％的乙腈-水溶液是指乙腈和水的体积比为40：60，体积百分数48％的乙腈-水溶液是指乙腈和水的体积比为48：52。

[0019] 对本发明式Ⅰ结构采用人前列腺癌细胞株PC3细胞进行活性评价试验，显示较强的细胞毒性，在激酶抑制实验中，也显示抑制活性。说明本发明式Ⅰ结构的化合物可用于制备在蛋白激酶抑制剂类药物和抗肿瘤药物。本发明提供的化合物可用于制备治疗与细胞增殖过度或异常相关的如血癌、乳腺癌以及胰腺癌等疾病的药物，本发明提供的化合物在激酶相关的神经性变性疾病如阿尔兹海默、亨廷顿，免疫系统疾病如系统性红斑狼疮等新药研发也同样具有重要的社会和经济意义

[0020] 与现有技术相比，本发明具有如下优点：

[0021] 本发明式Ⅰ结构其进行活性实验，发现其具有良好的蛋白激酶抑制活性，尤其显示较强的抗肿瘤活性，可在抗肿瘤方面有很重要的应用价值，如治疗急性髓系白血病、非小细胞肺癌、肝癌、肾癌、甲状腺癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌等。同样也可应用于蛋白激酶相关的神经性变性疾病如阿尔兹海默、亨廷顿，眼部疾病如青光眼，老年黄斑病的新药研发。

具体实施方式

[0022] 实施例1

[0023] 一、化合物的发酵

[0024] 放线菌采用中国工业微生物菌种保藏管理中心出售的链霉菌Streptomyces sp.CICC 11026；

[0025] 1)将放线菌Streptomyces sp.CICC 11026接种于500mL锥形瓶中，每瓶含250mL高氏一号液体培养基，培养条件为28℃、180rpm的摇床中培养3天，获得可发酵培养的种子液；

[0026] 2)将步骤1)所得的种子液接种至大米培养基(大米培养基，由以下组分制成：大米40g，水60mL，海盐1.5g)，接种体积为12mL，培养条件为28℃下恒温静置培养70天，得到含有本发明具有抗肿瘤活性的化合物的固体发酵产物。

[0027] 二、化合物的制备及鉴定

[0028] 将含有本发明具有抗肿瘤活性的化合物的固体发酵产物用乙酸乙酯浸泡萃取3次，溶剂回收浓缩，将所得乙酸乙酯部位进行常压凝胶色谱(采用的填料为羟丙基葡聚糖凝胶LH-20)粗分离，洗脱剂为体积百分数20％-100％的甲醇-水体系梯度洗脱，每1/4柱体积为一个馏分，TLC分析合并含有目标化合物的馏分。对目标组分采用中压制备色谱分离(Sepax Amethyst C-18(10μm,30×400mm)色谱柱，检测波长295nm)，流动相为体积百分数40％-100％的甲醇-水溶液以10mL/min梯度洗脱，TLC分析合并含该化合物的馏分。

[0029] 所得含该化合物的馏分采用高效制备液相色谱分离(Agilent Pursuit C-18(10μm,21.2×250mm)色谱柱，检测波长292nm)，采用的流动相为体积百分数40％-48％(40min)乙腈/水体系以10mL/min梯度洗脱，收集20-21min的色谱峰，回收溶剂，得到化合物A61-31A，其结构如下所示，为式Ⅰ结构。分子式根据高分辨质谱HR-ESI-MS计算为C28H24N4O4(m/z＝[M+H]+481.1866,calculated 481.1876)，核磁数据如表1所示，因此鉴定该化合物为(3′-O-demethyl-4′-N-demethyl-4′-acetyl-4′-epi-staurosporine)，命名为A61-31A，和具体结构如下：

[0030]

[0031] 表1 1H 600MHz,13C 125MHz(CD3OD)

[0032]

[0033]

[0034] 三、抗肿瘤活性实验

[0035] 人前列腺癌细胞株PC3细胞测定IC50实验。采用SBR细胞实验，取对数生长期的细胞，1×105个/mL铺96孔板，CO2培养箱中培养24小时，取出培养板后于每孔中加入不同浓度的待测样品，加药完成后，培养板于微孔板振荡器上振荡混匀，置于CO2培养箱中继续培养48小时。取出培养板，在培养液表面每孔轻轻加入50μl预冷的50％的三氯醋酸(TCA)固定，静置5分钟后，再将培养板移至4℃放置1小时。倒掉固定液，每孔用去离子水洗5遍，甩干，空气干燥。每孔加入100μl SRB液，在室温25℃放置10分钟，去上清液，用体积百分数1％醋酸洗涤5次，空气干燥，结合的SRB用150μl 10mmol/L非缓冲Tris碱液(pH10.5)振荡溶解。置于酶标仪中测定各孔光吸收，测定波长为540nm。根据各孔OD值计算药物对细胞增殖抑制率，根据各浓度抑制率，采用Logit法计算半数抑制浓度IC50。

[0036] 表2

[0037]化合物 IC50(μM)
A61-31A 0.16

[0038] 四、蛋白激酶的抑制活性

[0039] 采用 KinEASETM-TK assay kit(Cisbio)，以星孢菌素(STU)阳性药测定所得不同浓度化合物对蛋白激酶的抑制活性。HRFT值通过测定蛋白激酶在经340nm紫外光激发后665nm和620nm的荧光比值获得，即HTRF值T＝[F665nm/F620nm]×104。蛋白激酶(PKC-α，ROCK2)抑制％＝((T待测)-(Tmin))/((Tmax)-(Tmin))×100，Tmax为反应液的HTRF值，Tmin为没有蛋白激酶的空白反应液HTRF值。最终根据各浓度抑制率计算半数抑制浓度IC50如表3所示：

[0040] 表3

[0041]

[0042] 从表2可以看出，采用人前列腺癌细胞株PC3细胞进行活性评价试验，显示出良好的抑制活性，其中式Ⅰ显示较强的细胞毒性。从表3可以看出，对本发明式Ⅰ结构显示出良好的蛋白激酶抑制活性。说明本发明式Ⅰ结构的化合物在抗肿瘤、激酶相关的神经性疾病如老年痴呆，视觉相关疾病如青光眼，老年黄斑病等都具有巨大的应用潜力，可应用于制备蛋白激酶相关的小分子抑制剂类药物和抗肿瘤药物。