青蒿腺毛优势表达AaTCP14基因启动子及其获得方法与应用

摘要

本发明公开了一种青蒿腺毛优势表达AaTCP14基因启动子包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO：1互补的核苷酸序列。该启动子能够调控目的基因在植物各组织中表达，尤其是分泌型和非分泌型腺毛中优势表达。同时本发明还涉及该启动子的获得方法和在利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种中的用途。由于利用植物腺毛优势表达的启动子对植物的腺毛系统进行遗传操作时，不会对植物的生长发育造成危害。因此，本发明对利用植物组织尤其是腺毛中表达和生产代谢产物的基因工程育种具有重要意义。

权利要求

1.一种青蒿腺毛优势表达AaTCP14基因启动子，其特征在于，AaTCP14基因启动子为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，所述AaTCP14基因启动子的顺式作用元件如下表所述：。

2.如权利要求1所述的青蒿腺毛优势表达AaTCP14基因启动子的获得方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、培养青蒿无菌苗；

步骤二、PCR克隆AaTCP14基因启动子基因序列；

其中，PCR引物对为：

PTCP14-F ACAAACAACACAGTTGGACAGGC；

PTCP14-R TTGCTGCTCAATGTCGTAGTG；

步骤三、分析AaTCP14基因启动子上面的顺式作用元件，确定AaTCP14基因启动子类型；

步骤四、将克隆到的AaTCP14基因启动子通过酶切连接连入pCAMBIA1391z载体中；

步骤五、将构建好的载体pCAMBIA1391z-AaTCP14转化根癌农杆菌；

步骤六、将带有pCAMBIA1391z-AaTCP14载体的根癌农杆菌稳定转化青蒿；

步骤七、PCR检测转基因植株；

步骤八、启动子所引导的GUS报告基因在植株中表达部位的确定。

3.如权利要求2所述的青蒿腺毛优势表达AaTCP14基因启动子的获得方法，其特征在于，所述步骤七中的PCR引物对为：

1391z-proTCP14-F CCAAGCTTGGCTGCAGGCATTGACCACTGAGATGACAGT；1391z-proTCP14-RGAATTCCCGGGGATCCAGAGAGATAACTAGGCGTGATTG。

4.如权利要求1所述的青蒿腺毛优势表达AaTCP14基因启动子在利用青蒿腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种中的应用。

5.一种表达载体，其特征在于，含有如权利要求1所述的青蒿腺毛优势表达AaTCP14基因启动子。

6.一种试剂盒，其特征在于，含有如权利要求1所述的青蒿腺毛优势表达AaTCP14基因启动子。

说明书

青蒿腺毛优势表达AaTCP14基因启动子及其获得方法与应用

技术领域

[0001] 本发明属于植物生物技术领域，涉及一种青蒿腺毛优势表达AaTCP14基因启动子及其获得方法与应用。具体是一种利用分子生物学手段获得的在植物各组织，尤其是分泌型和非分泌型腺毛中优势表达的AaTCP14基因启动子(proTCP14)，并分析其在转基因植物中的应用。

背景技术

[0002] 青蒿(Artemisia annua L.)是菊科蒿属一年生草本植物，植株有浓烈的挥发性香气，其植株中含有许多次级代谢产物：青蒿素、青蒿酮、β-石竹烯、β-法尼烯、大根香叶烯、α-蒎烯、樟脑、挥发油等。青蒿素(Artemisinin)是从青蒿叶片中分离出的一种含有过氧桥结构的倍半萜内酯化合物，作为世界卫生组织(WHO)推荐的抗疟疾药物联合治疗(Artemisinin-based combination therapies，ACTs)的主要有效成分。近年来，青蒿素及其衍生物被报道具有治疗红斑狼疮、阿兹海默症、抗癌症和降血脂等功效。目前青蒿素的主要来源是从青蒿的地上部分提取，然而青蒿中青蒿素的含量非常低(0.1％-1％)，这使得这种药物的大规模商业化生产受到了极大限制。

[0003] 青蒿素的生物合成由细胞质的MVA途径和质体的MEP途径组成。青蒿素的生物合成由四个酶催化，既ADS(紫穗槐-4,11-二烯合酶)、CYP71AV1(细胞色素P450单加氧酶)、DBR2(青蒿醛双键还原酶)和ALDH1(二氢青蒿醛△11(13)还原酶)。值得注意的是中间前体物质青蒿醛既可以被DBR2催化形成二氢青蒿醛而最终形成青蒿酸，也可以被ALDH1和CYP71AV1催化形成青蒿酸而最终形成青蒿素B。因此青蒿醛是否可以有效地被DBR2催化形成二氢青蒿醛是得到高含量的青蒿素的关键，既DBR2酶的活性十分重要。

[0004] AaTCP14是从青蒿中分离得到的一个TCP(TEOSINTE BRANCHED1/CYCLOIDEA/PROLIFERATING CELL FACTOR)家族的转录因子，该家族具有典型的螺旋-环-螺旋(bHLH)结构。该家族在植物次生代谢和腺毛发育中起着十分重要的作用。在拟南芥中，TCP3通过与MYB(MYB domain-containing protein)蛋白互作而促进黄酮的生物合成。在棉花中，TCP14参与了生长素调控的表皮毛的分化和延伸。在青蒿植株中提高或者抑制AaTCP14可以有效增加或者降低青蒿中青蒿素及二氢青蒿酸的含量，表明该基因在青蒿素生物合成途径中具有重要的调节作用。AaTCP14在不同组织部位和叶序中的表达模式与青蒿素合成途径中腺毛特异性表达的合成酶基因ADS、CYP71AV1、DBR2和ALDH1均具有较高的相似性。因此，该基因的启动子也极有可能在腺毛中优势表达。此基因还可特异结合并且激活DBR2和ALDH1启动子，从而激活青蒿素合成代谢通路，并且推动代谢流流向青蒿醛转化为二氢青蒿醛方向，最终提高青蒿素的含量。由于青蒿素是在分泌型腺毛中合成，因此克隆腺毛优势表达启动子对青蒿素代谢工程具有十分重要的意义。

[0005] 青蒿的叶片、花蕾和茎秆组织表面有两种腺毛。分泌型腺毛(glandular secretory trichome，GST)和非分泌型腺毛(T shape trichome,TST)。植物腺毛在抵抗昆虫、传播花粉、降低紫外线伤害、减少蒸腾等方面都起到至关重要的作用。启动子是位于结构基因5'端上游的特定核酸序列，能够调控下游基因的表达，启动子就像一个“开关”，通过顺式作用元件和反式作用因子(转录因子)的相互作用来发挥其特定的功能。启动子一共分三种：组成型启动子、特异型启动子、诱导型启动子。在目前青蒿的基因工程研究中，多采用组成型启动子，例如花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S)，这种启动子能够驱动外源基因在所有的组织和器官中表达，会过度消耗细胞内的物质和能量，并且不能在时间和空间上调控目的基因的表达，极可能会对植物的正常生长造成一定的负担和危害。因此急需找到在植物的组织器官中特异性表达的启动子来代替组成型启动子，从而更好的对植物基因的表达进行调控。由于腺毛特异表达的启动子对于植物的腺毛系统进行遗传操作，不会对植物的生长发育造成危害，可以克服组成型启动子的种种弊端。因此，克隆到植物腺毛组织优势表达的启动子对于青蒿素代谢工程具有十分重要的意义。

发明内容

[0006] 为了克服现有植物基因工程技术的不足，同时为深入研究分泌型和非分泌型腺毛的发生和发育以及其中的次级代谢产物的代谢调控，本发明提供一种在植物分泌型和非分泌型腺毛中优势表达的启动子，能引导基因在转基因植物分泌型和非分泌型腺毛中优势表达。

[0007] 本启动子是诱导型启动子，含有分生组织表达、厌氧诱导、光响应、赤霉素响应、干旱诱导、黄酮基因调控、胚乳表达、水杨酸响应和生理调控等调控元件，可广泛响应激素和非生物胁迫等多种刺激。研究表明，对青蒿植株外施赤霉素和水杨酸都可以提高青蒿素的含量，另有研究证实对青蒿植株进行不同的光照或单色光处理，以及进行干旱处理都可以提高青蒿素的产量。由于本启动子中存在这些诱导元件，使得转基因青蒿植株及时响应外界环境，从而诱导基因在分泌型和非分泌型腺毛中优势表达。

[0008] 本发明公开了一种青蒿腺毛优势表达AaTCP14基因启动子包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO：1互补的核苷酸序列。进一步地，青蒿腺毛优势表达AaTCP14基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，或者为与SEQ ID NO：1互补的核苷酸序列。

[0009] 从另一个方面来说，本发明公开的一种青蒿腺毛优势表达AaTCP14基因启动子具有如下表(表1)的第一和第二列所示的顺式作用元件：

[0010] 表1

[0011]

[0012]

[0013] 进一步地，上述顺式作用元件在SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列中的位置和/或作用如表1所示。

[0014] 本发明还公开了如上所述的青蒿腺毛优势表达AaTCP14基因启动子的获得方法，其特征在于，包括以下步骤：

[0015] 步骤一、培养青蒿无菌苗；

[0016] 步骤二、PCR克隆AaTCP14基因启动子基因序列；

[0017] 步骤三、分析AaTCP14基因启动子上面的顺式作用元件，确定AaTCP14基因启动子类型；

[0018] 步骤四、将克隆到的AaTCP14基因启动子通过酶切连接连入pCAMBIA1391z载体中；

[0019] 步骤五、将构建好的载体pCAMBIA1391z-AaTCP14转化根癌农杆菌；

[0020] 步骤六、将带有pCAMBIA1391z-AaTCP14载体的根癌农杆菌稳定转化青蒿；

[0021] 步骤七、PCR检测转基因植株；

[0022] 步骤八、启动子所引导的GUS报告基因在植株中表达部位的确定。

[0023] 进一步地，步骤二中的PCR引物对为：

[0024] PTCP14-F(如SEQ ID NO：2所示)

[0025] ACAAACAACACAGTTGGACAGGC；

[0026] PTCP14-R(如SEQ ID NO：3所示)

[0027] TTGCTGCTCAATGTCGTAGTG。

[0028] 进一步地，步骤二中的PCR条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，50℃退火30s，68℃延伸2min，35个循环；68℃延伸10min。

[0029] 进一步地，步骤七中的PCR引物对为：

[0030] 1391z-proTCP14-F(如SEQ ID NO：4所示)

[0031] CCAAGCTTGGCTGCAGGCATTGACCACTGAGATGACAGT；

[0032] 1391z-proTCP14-R(如SEQ ID NO：5所示)

[0033] GAATTCCCGGGGATCCAGAGAGATAACTAGGCGTGATTG。

[0034] 本发明还涉及如上所述的青蒿腺毛优势表达AaTCP14基因启动子在利用青蒿腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种中的应用。

[0035] 本发明还涉及一种表达载体和试剂盒。该表达载体含有如上所述的青蒿腺毛优势表达AaTCP14基因启动子。

[0036] 该试剂盒含有如上所述的青蒿腺毛优势表达AaTCP14基因启动子。

[0037] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明利用有效的青蒿腺毛组织优势性启动子(AaTCP14)代替组成型启动子可以用于构建在分子生物学中在青蒿分泌型和非分泌型腺毛优势表达目的基因的融合基因。利用遗传转化技术将其转入其他植物的基因组中，从而实现目的基因的定向操作来获得转基因植物，并且不会对植物的生长发育造成危害，能广泛用于利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种中。

附图说明

[0038] 图1是转基因青蒿植株的PCR阳性检测电泳图。其中，泳道1(M)：DNA marker 2000；泳道2(+)：阳性质粒对照；泳道3(-)：非转基因青蒿对照；泳道4～12(1～9)：pCAMBIA1391z-proTCP14转基因青蒿的9个不同株系。

[0039] 图2是利用AaTCP14基因启动子与GUS基因融合的载体pCAMBIA1391z-proTCP14通过农杆菌介导稳定转化青蒿后，所获得的转基因青蒿中GUS组织染色图。其中(A)：转空载体pCAMBIA1391z转基因青蒿叶片GUS染色；(B-C)：pCAMBIA1391z-proTCP14转基因青蒿叶片染色；(D-E)：pCAMBIA1391z-proTCP14转基因青蒿茎部染色；TST，非分泌型腺毛；GST，分泌型腺毛。TCP14启动子的GUS染色主要分布于幼嫩叶片和茎的分泌型和非分泌型腺毛中。

具体实施方式

[0040] 下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步的说明：下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0041] 下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册见New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press的1989年版中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

[0042] 本实施例涉及的根癌农杆菌EHA105已在《黄亚丽，蒋细良，田云龙，郭萍，朱昌雄；根癌农杆菌介导的哈茨木霉菌遗传转化的研究，中国生物工程杂志，2008,28(3)：38-43》文献中公开。根癌农杆菌EHA105，质粒pCAMBIA1391z可通过公开市售的商业渠道取得，如EHA105可以从上海唯地生物公司获得，pCAMBIA1391z可以从澳大利亚CAMBIA公司购得，菌株编号为Gambar1。

[0043] 实施例

[0044] 本实施例涉及AaTCP14基因启动子的获得，具体包括如下步骤：

[0045] 步骤一、培养青蒿无菌苗

[0046] 青蒿种子用体积分数为75％的乙醇浸泡2-3min，无菌水冲洗1次，再用20％(w/v)的NaClO浸泡20min后，无菌水冲洗3次～4次，用无菌吸水纸吸干表面水分，接种于无激素的MS固体培养基(采用Murashige和Skoog在1962年发明的固体培养基，该固体培养基可以通过商业渠道获得)上，25℃、16h/8h(日光/黑暗)培养，14天后即可获得青蒿无菌苗；

[0047] 步骤二、基因组DNA中启动子序列的克隆

[0048] 1、基因组DNA的提取

[0049] 在2.0mL离心管中加入2粒钢珠，在其中放一片青蒿叶片(1cm2左右大小，用冰盒盛取)；加入650μL CTAB buffer(通风橱内操作，CTAB中含有2％巯基乙醇)，55-60Hz，震荡90秒；65℃水浴1h(每隔10min摇一摇)，可适当延长时间，最长1.5h；冷却至室温，加入650μL三氯甲烷，轻柔上下颠倒10min，12000rpm离心10min；取400μL-500μL上清液于一新1.5mL离心管中，等体积加入400μL-500μL三氯甲烷；轻柔上下颠倒10min，12000rpm离心10min；取300μL-400μL上清液于一新1.5mL离心管中，等体积加入300μL-400μL异丙醇(异丙醇在-20℃预冷)；轻柔上下颠倒后在-20℃冰箱中放置1-2h。取出后4℃12000rpm离心10min，弃去上清，加入75％乙醇600-700μL，将沉淀吹打起或用手指弹起，放在摇床上摇15-20min，重复一次。吸干液体，放在37℃中烘干，直到沉淀变为透明。加入40-60μL ddH2O回溶，4℃保存。

[0050] 2、PCR扩增

[0051] 以基因组DNA为模板，利用PCR方法扩增分泌型和非分泌型腺毛优势启动子序列。根据本实验室基因组测序拼接得到AaTCP14基因启动子的预测电子序列设计PCR引物如表2所示，PCR反应体系如表3所示。PCR条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s；50℃退火30s；68℃延伸2min，35个循环；68℃延伸10min。在1％的琼脂糖凝胶中电泳检测PCR产物，切胶回收目的片段，纯化DNA。然后连接到PLB(购自天根公司)载体用于测序，将该片段的序列与AaTCP14的基因编码序列进行拼接，获得AaTCP14基因编码序列上游约1.8k bp的片段(该约
1.8k bp的片段是根据AaTCP14基因启动子的预测电子序列扩增出来的PCR产物片段与已知的AaTCP14基因编码序列进行比较得出的AaTCP14的ATG上游约1.8k bp的启动子片段)。

[0052] 表2 PCR引物设计

[0053]

[0054] 表3 PCR反应体系

[0055]

[0056] 步骤三、分析得到的AaTCP14基因启动子的顺式作用元件，确定AaTCP14基因启动子的类型

[0057] 本发明中得到的AaTCP14基因启动子序列长度为1828bp。为了寻找启动子上面的顺式作用元件，用Plantcare(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)对AaTCP14基因的启动子进行分析。分析发现多克隆到的启动子上面具有除了TATA box和CAAT box，还具有很多顺式作用元件：CAT-box、ARE、BOX 4、BOX、IGATA-motif、Sp1、ATCT-motif、MNF1、G-box、CCAAT-box、GARE-motif、P-box、TATC-box、MBS、MBSⅡ、Skn-1motif、TCA-element、Circadian等；其中，CAT-box响应分生组织表达，ARE响应厌氧胁迫，BOX 4、BOX、I GATA-motif、Sp1、ATCT-motif、MNF1和G-box在植物对光响应中起到重要作用，GARE-motif、P-box和TATC-box元件都受到赤霉素的诱导，受到干旱胁迫时MYB蛋白会结合MBS元件，MBSⅡ为黄酮基因的调控元件，Skn-1motif与胚乳表达相关，TCA-element响应激素水杨酸，Circadian元件表明启动子受生理节律调控(表1)。以上结果分析表明，AaTCP14基因启动子是一个诱导型的启动子，能受多种因素诱导。

[0058] 步骤四、将得到的启动子连入pCAMBIA-1391z载体，融合GUS报告基因。

[0059] 为了研究基因启动子在植物不同组织部位中的表达，将AaTCP14基因的启动子proTCP14连接pCAMBIA-1391z载体融合gus报告基因，为了实现对表达载体的构建，正向引物中引入PstI酶切位点，反向引物中引入BamHI酶切位点，引物序列如表4所示：

[0060] 表4 pCAMBIA1391z-proFDS1载体构建PCR引物

[0061]

[0062] 步骤五、将构建好的pCAMBIA1391z-proTCP14载体转化根癌农杆菌并检测。

[0063] 将含有构建完成的植物双元表达载体转入根癌农杆菌(EHA105)，并进行PCR验证。结果表明：含有基因启动子片段的植物双元表达载体成功的构建到根癌农杆菌菌株中，从而获得含基因启动子和gus基因融合的植物表达载体pCAMBIA1391z-proTCP14的根癌农杆菌菌株中。

[0064] 步骤六、将带有pCAMBIA1391z-proTCP14载体的根癌农杆菌转化青蒿

[0065] 1)外植体的预培养

[0066] 青蒿种子用体积分数为75％的乙醇浸泡2～3min；无菌水冲洗1次；再用20％(w/v)的NaClO浸泡20min；无菌水冲洗3～4次；用无菌吸水纸吸干表面水分；接种于无激素的MS，该MS培养基采用Murashige和Skoog在1962年发明的固体培养基，该固体培养基可以通过商业渠道获得；25℃、16小时的日光和8小时的黑夜培养，即可获得青蒿无菌苗，待苗长至5cm左右后,剪取无菌苗叶片外植体用于转化；

[0067] 2)农杆菌与外植体的共培养

[0068] 将所述的叶片外植体，转到1/2MS和100μmol/L AS组成的共培养培养基中，滴加含活化好的所述含TCP14基因启动子的植物双元表达载体的根癌农杆菌工程菌的1/2MS悬液，使外植体与菌液充分接触，28℃暗培养3d，以滴加在不带有目的基因的根癌农杆菌的1/2MS液体培养基悬液的叶片外植体为对照；

[0069] 3)抗性再生植株的筛选

[0070] 将所述的共培养3d的青蒿外植体转入到MS、0.5mg/L 6-BA、0.05mg/L NAA、50mg/L Kan和500mg/L Cb组成的发芽筛选培养基上，于25℃、16小时的日光(light)和8小时的黑暗(dark)中培养，每两周继代培养一次，经过2-3次继代后即可获得Kan抗性丛生芽，将生长良好的抗性丛生芽剪下转入1/2MS和125mg/L Cb组成的生根培养基上培养至生根，从而获得Kan抗性再生青蒿植株；

[0071] 步骤七，PCR检测转基因植株

[0072] 根据目的基因所在表达盒promoter-GUS序列promoter和GUS分别设计正向引物(proTCP14:GGTGTTATCATTCATTTATT)和反向引物(GUSR:GTCATTGTAACTGCTTGGGA)对gus基因进行检测；结果表明，利用所设计的PCR特异引物，能扩增出特异DNA片段，而以非转化青蒿基因组DNA为模板时，没有扩增出任何片段，如图1所示；

[0073] 步骤八，启动子所引导的gus报告基因在植株中的表达部位的确定

[0074] 对PCR检测为阳性的青蒿植株，取其幼嫩的叶片和茎部进行GUS组织染色，结果如图2所示，结果表明，染色部位主要在青蒿的分泌型和非分泌型腺毛中，说明AaTCP14基因启动子在转基因青蒿中能够引导外源基因在腺毛中特异表达，由此可见，本发明所克隆的proTCP14基因启动子可用于利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种和产业化中。

[0075] 以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。