一种CuInS/ZnS量子点及检测碱性磷酸酶的方法

摘要

本发明涉及生化检测技术领域，公开了一种CuInS/ZnS量子点及利用该量子点检测碱性磷酸酶的方法。以CuInS/ZnS量子点做为碱性磷酸酶水解4‑硝基苯磷酸二钠体系中的探针，在λex/λem＝405/588nm条件下测定荧光强度，通过荧光强度的变化以及碱性磷酸酶与荧光强度的线性关系，得到碱性磷酸酶的含量。本发明制备的CuInS/ZnS量子点最佳激发波长为405nm，与PNP的最大底物吸收峰重叠，能够产生内滤效应，从而达到检测ALP的目的。检测灵敏度高，抗干扰能力强，样品要求低，能够实现对血清样品的直接检测。

权利要求

1.一种纳米荧光探针检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于，以CuInS/ZnS量子点作为碱性磷酸酶水解4-硝基苯磷酸二钠体系中的探针，在λex/λem＝405/588nm条件下测定水解体系的荧光强度，通过测定的荧光强度以及碱性磷酸酶与荧光强度的线性关系，得到碱性磷酸酶的含量；所述CuInS/ZnS量子点的最佳激发波长为405nm，发射波长为588nm；

所述CuInS/ZnS量子点以CuInS为核，ZnS为壳，所述CuInS/ZnS量子点的最佳激发波长为405nm，发射波长为588nm；

所述CuInS/ZnS量子点的制备方法，包括以下步骤：

(1)将可溶性铜源化合物、铟源化合物及巯基脂肪酸与水混合，调节pH值至8～10，得到混合液；所述混合液中，Cu2+和In3+的摩尔比为0.015～0.045：0.015～0.120；Cu2+和In3+的物质的量之和与巯基脂肪酸的摩尔比为0.03～0.06：0.24～0.90；

(2)搅拌条件下，将所述步骤(1)得到的混合液与硫源化合物混合，微波辅助加热使混合后溶液温度在4min以内升温至90～100℃，保持温度反应1～10min，得到含有CuInS核的反应液；

(3)待步骤(2)得到的反应液冷却至低于50℃后，向反应液中加入锌源溶液和硫源溶液，在90～100℃下微波加热反应1～10min，得到CuInS/ZnS量子点；

所述巯基脂肪酸为主链长度为2～8个碳原子的巯基脂肪酸。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述铜源化合物为碘化铜或氯化铜，所述铟源化合物为醋酸铟或氯化铟；步骤(2)中，所述硫源化合物为Na2S。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述Cu2+的摩尔含量为0.015～

0.045mmol；步骤(2)中，所述Na2S的摩尔含量为0.02～0.06mmol。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述锌源溶液为Zn(Ac)2溶液，所述硫源溶液为Na2S溶液。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述铜源化合物在进行混合前还包括：将铜源化合物溶解于氨水溶液中。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述CuInS/ZnS量子点在所述碱性磷酸酶水解4-硝基苯磷酸二钠体系中的质量浓度为0.05～2.0mg/mL。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述碱性磷酸酶水解4-硝基苯磷酸二钠的体系中，底物4-硝基苯磷酸二钠的摩尔浓度为0.5～2mM。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述碱性磷酸酶水解4-硝基苯磷酸二钠的体系中还含有MgSO4。

说明书

一种CuInS/ZnS量子点及检测碱性磷酸酶的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及半导体量子点合成、分析化学、生化检测技术领域，特别是涉及一种CuInS/ZnS量子点及利用该量子点作为纳米荧光探针检测碱性磷酸酶的方法。

背景技术

[0002] 目前，临床检测血清中ALP采用的方法是比色法，此法以4-硝基苯磷酸二钠(PNPP)为底物，在ALP存在条件下，PNPP与ALP反应产生游离酚(对硝基苯酚PNP)和磷酸，酚在碱性溶液中与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化形成红色醌类化合物，其红色深浅与ALP活性成正比。在37℃条件下，每100mL血清与底物作用15分钟，产生1mg酚的ALP活性为1个金氏单位(U)。以蒸馏水调零点，在510nm处读取各管吸光度(紫外分光光度计)。该方法对样品需要量大，样品前处理复杂，灵敏度低，选择性差，抗干扰能力不足。由于临床样品(如全血)中的复杂组分会对检测结果造成干扰，因此只能用于成分相对简单而显色又不易受到干扰的体系，检测前都需要对样品进行离心分离等预处理，并不能直接用于分析实际血液样品。底物溶液中不得含有酚类物质，血清样品需要量为100μL；检测下限未知。

发明内容

[0003] 有鉴于此，本发明的目的是提供一种快速检测碱性磷酸酶的方法，该方法可以直接对人血清进行测定，每测一个样品仅需20μl血清，检测灵敏度高，抗干扰性强，操作简便，可实现快速测定。

[0004] 本发明的另外一个目的还在于提供上述CuInS/ZnS量子点及其制备方法。

[0005] 为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：

[0006] 一种CuInS/ZnS量子点的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

[0007] (1)将可溶性铜源化合物、铟源化合物及巯基脂肪酸与水混合，调节pH值至8～10，得到混合液；

[0008] 所述混合液中，Cu2+和In3+的摩尔比为0.015～0.045：0.015～0.120；Cu2+和In3+的物质的量之和与巯基脂肪酸的摩尔比为0.03～0.06：0.24～0.90；

[0009] (2)搅拌条件下，将所述步骤(1)得到的混合液与硫源化合物混合，微波辅助加热使混合后溶液温度在4min以内升温至90～100℃，保持温度1～10min，得到含有CuInS核的反应液；

[0010] (3)待步骤(2)得到的反应液冷却至低于50℃后，向反应液中加入锌源溶液和硫源溶液，在90～100℃下微波加热反应1～10min，得到CuInS/ZnS量子点。

[0011] 优选的，步骤(1)中，所述铜源化合物为碘化铜或氯化铜，所述铟源化合物为醋酸铟或氯化铟，所述巯基脂肪酸为主链长度为2～8个碳原子的巯基脂肪酸。

[0012] 步骤(2)中，所述硫源化合物为Na2S。

[0013] 更优选的，步骤(1)中，所述Cu2+的摩尔含量为0.015～0.045mmol；步骤(2)中，所述Na2S的摩尔含量为0.02～0.06mmol。

[0014] 优选的，步骤(3)中，所述锌源溶液为Zn(Ac)2溶液，所述硫源溶液为Na2S溶液。

[0015] 优选的，所述铜源化合物在进行混合前还包括：将铜源化合物溶解于氨水溶液中。

[0016] 本发明还包括上述任意一项技术方案所述方法制备得到的CuInS/ZnS量子点，其特征在于，所述CuInS/ZnS量子点以CuInS为核，ZnS为壳，所述CuInS/ZnS量子点的最佳激发波长为405nm，发射波长为588nm。

[0017] 本发明还提供了一种纳米荧光探针检测碱性磷酸酶的方法，以CuInS/ZnS量子点作为碱性磷酸酶水解4-硝基苯磷酸二钠体系中的探针，在λex/λem＝405/588nm条件下测定水解体系的荧光强度，通过测定的荧光强度以及碱性磷酸酶与荧光强度的线性关系，得到碱性磷酸酶的含量；

[0018] 所述CuInS/ZnS量子点的最佳激发波长为405nm，发射波长为588nm。

[0019] 优选的，所述CuInS/ZnS量子点在所述碱性磷酸酶水解4-硝基苯磷酸二钠体系中的质量浓度为0.5～2mM。

[0020] 优选的，所述碱性磷酸酶水解4-硝基苯磷酸二钠的体系中，底物4-硝基苯磷酸二钠的摩尔浓度为0.5～2mM。

[0021] 优选的，所述碱性磷酸酶水解4-硝基苯磷酸二钠的体系中还含有MgSO4。

[0022] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：

[0023] 本发明制备CuInS/ZnS量子点的方法中，Cu2+:In3+的摩尔比为0.015～0.045:

[0024] 0.015～0.120。由于量子点具有尺寸效应和量子限域效应，通过控制不同比例的两种阳离子前驱体可以形成不同尺寸、不同光谱性质的量子点，本发明中的上述铜铟摩尔比合成得到的量子点最大激发波长在405nm，与PNP底物的最大紫外吸收峰(405nm)重叠，从而构建一种基于内滤效应的检测方法。本发明的CuInS/ZnS量子点制备的反应温度为90～100℃，反应时间为1～10min，在上述反应时间和反应温度下能够得到激发波长为405nm、稳定的、荧光强度较强的CuInS/ZnS量子点。

[0025] 本发明纳米荧光探针检测碱性磷酸酶的方法，以CuInS/ZnS量子点做为碱性磷酸酶水解4-硝基苯磷酸二钠体系中的探针，在λex/λem＝405/588nm条件下测定荧光强度，通过荧光强度以及碱性磷酸酶与荧光强度的线性关系，得到碱性磷酸酶的含量。所述CuInS/ZnS量子点的最佳激发波长为405nm，发射波长为588nm。本方法的检测机理是利用内滤效应实现对碱性磷酸酶(ALP)的检测，具体机理阐释如下：ALP水解4-硝基苯磷酸二钠(PNPP)得到对硝基酚(PNP)，PNP在405nm处有强的紫外吸收峰。本发明的CuInS/ZnS量子点的最佳激发波长与PNP的底物最大吸收峰重叠，从而产生内滤效应。在以PNPP为底物，CuInS/ZnS为探针的体系中，ALP水解产生的PNP由于吸收了405nm的激发光，导致CuInS/ZnS发生荧光淬灭，从而达到检测ALP的目的。

[0026] 本发明首先在检验原理的设计上排除了氧化、光照等外界因素可能引起的干扰，[0027] 内滤效应的运用大大提高了检测方法的专属性。样品的消耗上，对样品要求低，不需要复杂的前处理过程，可直接对血清见检测，用量少，仅需20μL(一滴血)血清样品，不仅可以减轻患者的身体和精神负担，而且对于在临床研究和诊断时需要从同一样品获得多种血清信息的实际应用来说，有着重要的实用价值。简便的实验操作、溶液配制及快速反应过程，可以大大节省人力消耗，提高检测效率。良好的灵敏度和回收率，确保了检验结果的准确性，可实现对碱性磷酸酶的快速测定。

[0028] 图1为实施例4中ALP检测工作曲线和标准曲线；

[0029] 图2为CuInS/ZnS量子点在PNPP体系中检测ALP活力；

[0030] 图3为干扰离子对本发明ALP检测方法的干扰结果；

[0031] 图4为干扰蛋白或氨基酸等对本发明ALP检测方法的干扰结果。

具体实施方式

[0032] 本发明提供了一种CuInS/ZnS量子点的制备方法，包括以下步骤：

[0033] (1)将铜源化合物、铟源化合物及巯基脂肪酸与水混合，调节pH值至8～10，得到混合液；

[0034] 其中，Cu2+、In3+摩尔比为0.015～0.045：0.015～0.120；Cu2+、In3+的摩尔之和与巯基脂肪酸的摩尔比为0.03～0.06：0.24～0.90；

[0035] (2)搅拌条件下，将步骤(1)得到的混合液与硫源化合物混合，微波辅助加热使混合后溶液温度在4min以内升温至90～100℃，保持温度1～10min，得到含有CuInS核的反应液；

[0036] (3)待步骤(2)得到的反应液冷却至低于50℃后，向反应液中加入锌源溶液和硫源溶液，在90～100℃下微波加热反应1～10min，得到CuInS/ZnS量子点。

[0037] 本发明中，所述铜源化合物优选为碘化铜或氯化铜，所述铟源化合物优选为醋酸铟或氯化铟，所述巯基脂肪酸优选为主链长度为2～8个碳原子的巯基脂肪酸，更优选为巯基丙酸(MPA)。在本发明中，优选巯基脂肪酸和水分别与铜源化合物、铟源化合物混合。分别混合时，优选巯基脂肪酸和水的量各自占其总量的30％～60％。

[0038] 本发明中，Cu2+、In3+的摩尔比为0.015～0.045：0.015～0.120，更优选为0.02～[0039] 0.04：0.02～0.10。本发明中的上述铜铟摩尔比合成得到的量子点最大激发波长在405nm，与PNP底物的最大紫外吸收峰(405nm)重叠，进而产生内滤效应。本发明所述混合液中，Cu2+的摩尔含量优选为0.015～0.045mmol，更优选为0.020～0.040mmol。

[0040] 本发明中，Cu2+、In3+的摩尔之和与巯基脂肪酸的摩尔比为0.03～0.06：0.24～[0041] 0.90；更优选为0.04～0.05：0.4～0.6。巯基脂肪酸在反应中起到稳定剂配体的作用，稳定剂配体可以理解为一种连接剂，也就是利用巯基与在金属离子表面的结合，增加该多元量子点的稳定性。

[0042] 由于巯基丙酸具有还原性，因此反应前优选先将铜源化合物溶解于氨水溶液中，Cu2+(铜离子)与过量的氨水反应，形成四氨合铜(II)络离子，氨络合物较稳定，不与稀碱液作用，由此可以保证Cu2+在合成反应中不被巯基脂肪酸还原，不受溶液pH的影响。本发明中，优选氨水的质量浓度为20～35％，更优选为23～30％。所述Cu2+与氨水的摩尔比优选为1～4：4～9；更优选为2～3：6～8。

[0043] 本发明中，调节含有铜铟阳离子的化合物与巯基脂肪酸及水的混合物pH值至8～10，更优选为9，使核反应在适宜的pH下进行。本发明中，优选用NaOH溶液调节混合物的pH值，进一步优选NaOH溶液的浓度为0.5～2M。

[0044] 本发明中，搅拌条件下，将步骤(1)得到的混合液与硫源化合物混合，在90～100℃下反应1～10min，得到含有CuInS核的反应液。优选所述硫源化合物为Na2S，进一步优选为Na2S溶液。所述Na2S溶液中S2-的摩尔含量优选为0.02～0.06mmol，更优选为0.03～0.04mmol。本发明对硫源化合物的添加量没有特殊限制，优选Cu2+、In3+的物质的量之和与硫源化合物中S的摩尔比为0.02～0.14：0.03～0.04，更优选为0.04～0.06：0.03～0.04。本发明对搅拌的条件没有特殊限制，优选在200～500转每分钟的速率下进行搅拌，更优选搅拌速率为300～400转每分钟。

[0045] 本发明中CuInS核形成的反应温度采用微波辅助加热，以使反应液的温度迅速升温至所需温度。本发明中，铜铟及硫源化合物的反应液在4min之内升温至反应温度，更优选为在1～3min内升温至反应温度；所述反应的温度为90～100℃，更优选为95℃。当采用微波辅助加热时，若功率过低，无法快速(4min内)升温至所需温度，升温时间的延长使得反应溶液中的阳离子前驱体继续被还原，导致最初的Cu2+:In3+比例发生改变，最终无法得到理想的量子点；若功率太大，升温过快，老化时间不够，晶体未充分生长，同样无法得到量子点。本发明中优选微波功率为500～900W，更优选为700～800W，可以实现在4min内升温至90～
100℃。

[0046] 本发明中，制备CuInS核的反应时间为1～10min。反应时间过短量子点产率底，荧光强度弱，时间过长会使量子点合成失败，完全没有荧光。本发明中，优选反应时间为3～8min，更优选为5min。反应完成后得到CuInS核。

[0047] 待含有CuInS核的反应液冷却至低于50℃后，向反应液中加入锌源溶液和硫源溶液，在90～100℃下反应1～10min，得到CuInS/ZnS量子点。此步骤中加热方式采用微波辅助加热，优选反应温度为93～97℃，反应时间优选为3～8min，更优选为5min。本发明对此步骤中的升温速率没有特殊限定，优选在4min内升温至反应温度。

[0048] 本发明中，锌源及硫源与CuInS核的比例无严格限定。本发明中，所述锌源溶液为Zn(Ac)2溶液，所述硫源溶液为Na2S溶液，分别为量子点提供锌和硫源，进而形成CuInS/ZnS量子点。优选Zn+和S2-的摩尔比为1～2：1～4，更优选为1：1。优选锌源及硫源溶液中Zn+和S2-的总加入量为0.01～0.05mmol，更优选为0.02～0.04mmol。

[0049] 本发明制备得到的CuInS/ZnS量子点，最佳激发波长为405nm，发射波长为588nm。其最佳激发波长与PNP底物的最大紫外吸收峰(405nm)重叠，因此可以产生内滤效应，将CuInS/ZnS量子点作为应用于碱性磷酸酶水解4-硝基苯磷酸二钠体系中，进而用于检测碱性磷酸酶。

[0050] 本发明提供了一种纳米荧光探针检测碱性磷酸酶的方法，在碱性磷酸酶水解4-硝基苯磷酸二钠的体系中，以CuInS/ZnS量子点做为探针，在λex/λem＝405/588nm条件下测定荧光强度，通过荧光强度的变化以及碱性磷酸酶与荧光强度的线性关系，得到碱性磷酸酶的含量；所述CuInS/ZnS量子点的最佳激发波长为405nm，发射波长为588nm。

[0051] 本发明的碱性磷酸酶(ALP)水解4-硝基苯磷酸二钠得到对硝基酚(PNP)，PNP在405nm处有强的紫外吸收峰。本发明的CuInS/ZnS量子点的最佳激发波长与PNP的最大底物吸收峰重叠，从而产生内滤效应。在以PNPP为底物，CuInS/ZnS为探针的体系中，ALP水解产生的PNP由于吸收了405nm的激发光，导致CuInS/ZnS发生荧光淬灭，从而达到检测ALP的目的。

[0052] 本发明中，所述碱性磷酸酶水解4-硝基苯磷酸二钠的体系中，4-硝基苯磷酸二钠作为底物，在碱性磷酸酶的作用下水解得到对硝基酚。通过CuInS/ZnS量子点与对硝基酚产生的内滤效应产生荧光，根据荧光强度的强弱测定碱性磷酸酶的含量。本发明碱性磷酸酶水解4-硝基苯磷酸二钠的体系中，底物4-硝基苯磷酸二钠的摩尔浓度优选为0.5～2mM，更优选为1mM。本发明碱性磷酸酶水解4-硝基苯磷酸二钠的体系中优选还含有MgSO4。MgSO4作为碱性磷酸酶的激酶，促进水解反应去磷酸化的进行。本领域技术人员可以根据本领域的常规操作添加MgSO4。在本发明具体实施例中，优选MgSO4在水解体系中的浓度为0.1μM。

[0053] 本发明所述碱性磷酸酶水解4-硝基苯磷酸二钠的体系中，所述CuInS/ZnS量子点在上述体系中作为探针，通过量子点的荧光强度对碱性磷酸酶进行检查。优选CuInS/ZnS量子点在水解体系中的质量浓度为0.05～2.0mg/mL，进一步优选为0.1～1.0mg/mL。

[0054] 本发明对荧光检测的方法没有特殊限定，采用本领域中的常规荧光检测方法即可，优选在荧光池中进行荧光检测。

[0055] 本发明通过设置系列碱性磷酸酶浓度，采用上述方法，在碱性磷酸酶水解4-硝基苯磷酸二钠的体系中加入CuInS/ZnS量子点作为探针，检测体系中不同碱性磷酸酶浓度下的荧光强度，从而得到碱性磷酸酶与荧光强度的线性关系。得到的线性方程为：(F0-F)＝[0056] 38.148[ALP]+253.2，其中F为加入ALP的检测体系荧光强度值，F0为不含ALP的检测体系荧光强度值，相关系数r＝0.9984。

[0057] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

[0058] 实施例1

[0059] 采用微波辅助加热法合成CuInS/ZnS量子点

[0060] 在室温下将0.025mmol InCl3与0.2mmol巯基丙酸(MPA)溶于20mL双蒸水中，用1mol/L NaOH溶液调节pH值至8；再加入0.5mL 0.015mmol CuCl2的氨水溶液和0.3mmol MPA；然后在剧烈搅拌下加入0.04mmol Na2S溶液，采用微波辅助加热在800W功率下1min内将溶液温度升温至100℃，保持5min，得到CuInS核。停止加热待冷却至低于50℃后，再向溶液中缓缓加入1mL 0.02M Zn(Ac)2溶液和1mL 0.02MNa2S溶液，再次在800W下微波加热，1min内将温度升温至100℃，保持5min，待反应结束，得到终产物CuInS/ZnS量子点。

[0061] 实施例2

[0062] 采用微波辅助加热法合成CuInS/ZnS量子点

[0063] 在室温下将0.06mmol InCl3与0.5mmol巯基丙酸(MPA)溶于20mL双蒸水中，用1MNaOH溶液调节pH值至10；再加入0.5mL 0.025mmol CuCl2的氨水溶液和0.4mmol MPA；然后在剧烈搅拌下加入0.02mmolNa2S溶液，采用微波辅助加热在700W功率下3min内将溶液温度升温至95℃，保持8min，得到CuInS核。停止加热待冷却至低于50℃后，再向溶液中缓缓加入1mL 0.01M Zn(Ac)2溶液和1mL 0.01MNa2S溶液，再次在700W下微波加热，3min内将温度升温至95℃，保持8min，待反应结束，得到终产物CuInS/ZnS量子点。

[0064] 实施例3

[0065] 采用微波辅助加热法合成CuInS/ZnS量子点

[0066] 在室温下将0.12mmol InCl3与0.8mmol巯基丙酸(MPA)溶于20mL双蒸水中，用1MNaOH溶液调节pH值至9；再加入0.5mL 0.05mmol CuCl2的氨水溶液和0.6mmol MPA；然后在剧烈搅拌下加入0.05mmolNa2S溶液，采用微波辅助加热在600W功率下3min内将溶液温度升温至90℃，保持10min，得到CuInS核。停止加热待冷却至低于50℃后，再向溶液中缓缓加入1mL 0.01M Zn(Ac)2溶液和1mL 0.02MNa2S溶液，再次在600W下微波加热，3min内将温度升温至90℃，保持10min，待反应结束，得到终产物CuInS/ZnS量子点。

[0067] 实施例4

[0068] CuInS/ZnS量子点检测ALP标准曲线的建立

[0069] 配制下述浓度的ALP标准溶液：0.01、0.025、0.05、0.1、1、2、5、10、20、50和100U L-1。

[0070] 取20μL上述不同浓度的ALP标准溶液，加入到含有1mM PNPP和0.1μMMgSO4(ALP激酶)的1mL 0.1mg mL-1CuInS/ZnS量子点溶液中，反应30min后，用1cm荧光池，在λex/λem＝-1405/588nm条件下，测定荧光强度并记录荧光光谱，在0.01～100.00U L 范围内绘制工作曲线。

[0071] 工作曲线结果见图1。由图1表明，荧光强度与ALP浓度在1.00～20.00U L-1范围内呈线性关系，线性方程为：(F0-F)＝38.148[ALP]+253.2,其中F为加入ALP的检测体系荧光-1强度值，F0为不含ALP的检测体系荧光强度值。相关系数r＝0.9984，检出限为0.001U L 。

[0072] 实施例5

[0073] 血清样品的检测

[0074] 取20μL人血清样品稀释50倍后，加入0.2～10U L-1的ALP溶液，充分混匀后。取20μL-1上述混合液直接加入到含有1mM PNPP和0.1μM MgSO4(ALP激酶)的1mL 0.1mg mL CuInS/ZnS量子点溶液中，反应30min后，用1cm荧光池，在λex/λem＝405/588nm条件下，测定荧光强度并记录荧光光谱。结果见表1。表1结果显示，本发明方法的回收率在81.5～94.8％范围，[0075] 说明该法准确可靠，可以用于临床分析。

[0076] 表1人血清中ALP活性的测定(n＝3)

[0077]

[0078] 实施例6

[0079] 本发明CuInS/ZnS量子点检测ALP方法的抗干扰能力实验

[0080] (1)对体内可能存在的离子的抗干扰能力进行测试：取20μL人血清样品，用pH7.4的Tris-HCl溶液稀释50倍后，取等份1mL的稀释液，分别于每份1mL的稀释液中加入0.1μM的含Mg2+、Na+、K+、Ca2+、Cd2+、Mn2+、Cu2+和Fe3+的溶液，充分混匀后，反应30min，用1cm荧光池，在λex/λem＝405/588nm条件下，测定荧光强度并记录荧光光谱。结果见图3。横坐标为干扰离子及ALP，纵坐标F0/F(F0为空白体系荧光强度，F为加入不同干扰物的荧光强度)。

[0081] (2)对体内可能存在的蛋白、酶、氨基酸及其他物质的抗干扰能力进行测试：取20μL人血清样品，用pH7.4的Tris-HCl溶液稀释50倍后，取等份1mL的稀释液，分别于每份1mL的稀释液中加入10U L-1的酪氨酸酶(Tyr)、辣根过氧化酶(HRP)、葡萄糖氧化酶(GOX)、半胱氨酸(Cys)、乙酰胆碱酯酶(AChE)、抗坏血酸(AA)、谷胱甘肽(GSH)、牛血清白蛋白(BSA)和IgG的溶液，充分混匀后，反应30min，用1cm荧光池，在λex/λem＝405/588nm条件下，测定荧光强度并记录荧光光谱。结果见图4。横坐标为干扰蛋白、酶、氨基酸、其他物质及ALP，纵坐标F0/F(F0为空白体系荧光强度，F为加入不同干扰物的荧光强度)。

[0082] 干扰实验结果表明，所建立的基于内滤效应的检测方法抗干扰能力良好，体内存在的各离子及蛋白、氨基酸等物质均不会影响ALP的测定结果，可以满足实际血液样品直接测定的需要。

[0083] 实施例7

[0084] 本发明的检查方法与现有技术的检测方法对比

[0085] 现有技术中报道的荧光探针体系检测方法如下：

[0086] [1]W.Na,S.Liu,X.Liu,X.Su,Ultrasensitive detection of amifostine and alkaline phosphatase based on the growth ofCdS quantum dots,Talanta 144(2015)1059-1064.

[0087] [2]L.Zhang,J.Zhao,M.Duan,H.Zhang,J.Jiang,R.Yu,Inhibition of dsDNA-templated copper nanoparticles by pyrophosphate as a label-free fluorescent strategy for alkaline phosphatase assay,Anal Chem 85(2013)3797-3801.

[0088] [3]Y.Chen,W.Li,Y.Wang,X.Yang,J.Chen,Y.Jiang,et al.,Cysteine-directed fluorescent gold nanoclusters for the sensing of pyrophosphate and alkaline phosphatase,Journal ofMaterials Chemistry C 2(2014)4080-4085.

[0089] [4]Y.Zhu,G.Wang,H.Jiang,L.Chen,X.Zhang,One-step ultrasonic synthesis ofgraphene quantum dots with high quantum yield and their application in sensing alkaline phosphatase,Chemical Communications 51(2015)948-951.

[0090] 对比上述检测方法与本发明ALP荧光探针体系的效果，结果见表3。

[0091] 表2本发明的ALP荧光探针体系与之前报道荧光探针体系的性能对比

[0092]

[0093] 由表2可以看出，本发明的检测方法可对血清样品进行直接测定，检测相应时间短，检测限低，能够对ALP进行快速测定，灵敏度高。

[0094] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。