一种生物组织光透明剂、光透明化方法及其应用

摘要

本发明公开了一种生物组织光透明剂、光透明化方法及其应用，属于生物成像技术领域。所述光透明剂是包含甲酰胺，以及醇类物质溶于水中形成的混合溶液，所述甲酰胺、水以及醇类物质的体积百分比分别为15％‑40％、15％‑30％以及30％‑70％。该生物组织光透明剂在生物组织光透明化处理中的应用。使用该光透明剂进行生物组织光透明化的处理方法，包括：将待处理生物组织进行分离并固定；使用所述光透明剂浸泡所述待处理生物组织，直至所述待处理生物组织变得透明。本发明的光透明剂能在几小时至2天内使不同生物组织变得透明、提高成像深度，透明时间短且保留样本的荧光信号，为获取组织内部神经元、血管及其他结构信息提供了新的方法。

权利要求

1.一种生物组织光透明剂，其特征在于，所述光透明剂是包含甲酰胺，以及醇类物质溶于水中形成的混合溶液，所述醇类物质为N,N,N',N'-四(2-羟基丙基)乙二胺或所述醇类物质为甘油和山梨醇的混合物；

所述醇类物质为N,N,N',N'-四(2-羟基丙基)乙二胺时，所述甲酰胺、水以及醇类物质的体积百分比分别为15％-40％、15％-30％以及40％-55％；

所述醇类物质为甘油和山梨醇的混合物时，所述甲酰胺、水以及醇类物质的体积百分比分别为15％-40％、15％-30％以及40％-60％。

2.如权利要求1所述的生物组织光透明剂，其特征在于，所述光透明剂为一种配比的甲酰胺、水以及醇类物质的混合溶液；或者，所述光透明剂为两种或两种以上不同配比的甲酰胺、水以及醇类物质的混合溶液。

3.如权利要求1所述的生物组织光透明剂在生物组织光透明化处理中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述生物组织为软组织。

5.一种使用如权利要求1所述的光透明剂进行生物组织光透明化的处理方法，其特征在于，包括：将待处理生物组织进行分离并固定；

使用所述光透明剂浸泡所述待处理生物组织，直至所述待处理生物组织变得透明。

6.如权利要求5所述的生物组织光透明化的处理方法，其特征在于，所述光透明剂为一种配比的甲酰胺、水以及醇类物质的混合溶液；或者，所述光透明剂为两种或两种以上不同配比的甲酰胺、水以及醇类物质的混合溶液；其中，当使用两种或两种以上不同配比的光透明剂浸泡所述待处理生物组织时，按照在不同配比的光透明剂中甲酰胺浓度逐渐降低、醇类物质浓度逐渐增加的次序，依次进行浸泡处理。

7.如权利要求5所述的生物组织光透明化的处理方法，其特征在于，所述生物组织为软组织。

8.如权利要求5所述的生物组织光透明化的处理方法，其特征在于，所述浸泡的时间在

2天以内。

说明书

一种生物组织光透明剂、光透明化方法及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物成像技术领域，特别涉及一种生物组织光透明剂、光透明化方法及其应用。

背景技术

[0002] 不断发展的光学成像技术及标记技术，为高分辨获取生物组织的三维微观结构提供了重要的研究工具。然而，大多数生物组织是混浊的，对光具有高散射特性，这使得光学成像技术的成像深度十分有限，仅能对较薄的组织进行成像，且图像质量随深度逐步降低，限制了在大组织成像的应用研究。

[0003] 近年来不断涌现的生物组织光透明技术，通过多种策略减小组织散射，有效增加了光学成像的深度。与多种显微光学成像技术的结合，已能够实现大组织的深层成像，为生命科学的研究，如神经科学、发育学等的研究提供了重要的研究方法。现有的组织光透明方法，主要包括两类，一类是基于有机溶剂的方法，利用四氢呋喃或醇类进行脱水，再利用二苄醚等进行折射率匹配，这种方法具有较好的透明效果，但容易淬灭样本的荧光；还有一类是基于水溶液试剂的方法，利用尿素的水合作用或表面活性剂等试剂的脱脂作用，增加组织各成分的折射率匹配程度，从而减小组织散射，增加透明度，这类方法能够较好的保存荧光，但多数需要较长的透明时间。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一种生物组织光透明剂、光透明化方法及其应用，该光透明剂能在短时间内使生物组织变得透明、且保留样本的荧光信号。

[0005] 一方面，为实现上述目的，本发明提供了一种生物组织光透明剂，所述光透明剂是包含甲酰胺，以及醇类物质溶于水中形成的混合溶液，所述甲酰胺、水以及醇类物质的体积百分比分别为15％-40％、15％-30％以及30％-70％。

[0006] 进一步地，所述光透明剂为一种配比的甲酰胺、水以及醇类物质的混合溶液；或者，所述光透明剂为两种或两种以上不同配比的甲酰胺、水以及醇类物质的混合溶液。

[0007] 进一步地，所述醇类物质为多元醇。

[0008] 进一步地，所述醇类物质为三乙醇胺、N，N，N′，N′-四(2-羟基丙基)乙二胺、甘油或山梨醇中任意一种或几种。

[0009] 另一方面，本发明还提供了一种生物组织光透明剂在生物组织光透明化处理中的应用。

[0010] 进一步地，所述生物组织为软组织。

[0011] 另一方面，本发明还提供了一种生物组织光透明化的处理方法，包括：

[0012] 将待处理生物组织进行分离并固定；

[0013] 使用所述光透明剂浸泡所述待处理生物组织，直至所述待处理生物组织变得透明。

[0014] 进一步地，所述光透明剂为一种配比的甲酰胺、水以及醇类物质的混合溶液；或者，

[0015] 所述光透明剂为两种或两种以上不同配比的甲酰胺、水以及醇类物质的混合溶液；其中，

[0016] 当使用两种或两种以上不同配比的光透明剂浸泡所述待处理生物组织时，按照在不同配比的光透明剂中甲酰胺浓度逐渐降低、醇类物质浓度逐渐增加的次序，依次进行浸泡处理。

[0017] 进一步地，所述生物组织为软组织。

[0018] 进一步地，所述浸泡的时间在2天以内。

[0019] 本申请实施例中提供的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：

[0020] 1、本申请实施例中提供的生物组织光透明剂，是包含甲酰胺，以及醇类物质溶于水中形成的混合溶液，所述甲酰胺、水以及醇类物质的体积百分比分别为15％-40％、15％-30％以及30％-70％；该光透明剂作用于生物组织之后，逐步使得组织内部折射率均一化，降低生物组织内部散射，能在短时间内使生物组织变得透明、提高成像深度，且保留样本的荧光信号。

[0021] 2、本申请实施例中提供的生物组织光透明化方法，通过将待处理生物组织进行分离并固定；使用所述光透明剂浸泡所述待处理生物组织，直至所述待处理生物组织变得透明。该方法能够在几小时至2天内使得不同类型组织透明，透明时间短且保留样本的荧光信号，为获取组织内部神经元、血管及其他结构信息提供了新的方法。

附图说明

[0022] 图1是本申请实施例提供的生物组织光透明化的处理方法流程图；

[0023] 图2是本申请实施例提供的成年小鼠1mm脑片在光透明处理前、后的图像；

[0024] 图3是本申请实施例提供的出生后2天的小鼠全脑在光透明处理前、后的图像；

[0025] 图4是本申请实施例提供的胚胎13.5天的小鼠胚胎头部在光透明处理前、后的图像；

[0026] 图5是本申请实施例提供的光透明处理前、后用共聚焦显微镜拍摄的脑片荧光图像经重建后轴向投影图像；

[0027] 图6是本申请实施例提供的光透明处理前、后用共聚焦显微镜拍摄的胚胎上肢手部位置的荧光图像。

具体实施方式

[0028] 本发明实施例提供一种生物组织光透明剂、光透明化方法及其应用，该光透明剂能在短时间内使生物组织变得透明、提高成像深度，且保留样本的荧光信号。

[0029] 为实现上述目的，本申请实施例总体思路如下：

[0030] 本申请提供一种生物组织光透明剂，所述光透明剂是包含甲酰胺，以及醇类物质溶于水中形成的混合溶液，所述甲酰胺、水以及醇类物质的体积百分比分别为15％-40％、15％-30％以及30％-70％。该光透明剂作用于生物组织之后，逐步使得组织内部折射率均一化，降低生物组织内部散射，能在几小时至2天内使生物组织变得透明、提高成像深度，且保留样本的荧光信号。

[0031] 为了更好的理解上述技术方案，下面通过附图和具体实施例对本申请技术方案做详细的说明，应当理解本申请实施例以及实施例中的具体特征是对本申请技术方案的详细的说明，而不是对本申请技术方案的限定，在不冲突的情况下，本申请实施例以及实施例中的技术特征可以相互结合。

[0032] 应当理解的是，虽然本文中可能使用了术语“第一”、“第二”等等来描述各混合溶液，但是这些混合溶液不应当受这些术语限制。使用这些术语仅仅是为了将一种混合溶液与另一种混合溶液进行区分。举例来说，在不背离示例性实施例的范围的情况下，第一混合溶液可以被称为第二混合溶液，并且类似地第二混合溶液可以被称为第一混合溶液。这里所使用的术语“和/或”包括其中一个或更多所列出的相关联项目的任意和所有组合。

[0033] 一方面，为实现上述目的，本申请实施例提供了一种生物组织光透明剂，该光透明剂是包含甲酰胺，以及醇类物质溶于水中形成的混合溶液，所述甲酰胺、水以及醇类物质的体积百分比分别为15％-40％、15％-30％以及30％-70％。

[0034] 本实施例中，所述光透明剂为一种配比的甲酰胺、水以及醇类物质的混合溶液；或者，所述光透明剂为两种或两种以上不同配比的甲酰胺、水以及醇类物质的混合溶液。

[0035] 具体而言，当所述光透明剂由两种或两种以上混合溶液组成时，在不同的混合溶液中，甲酰胺浓度与醇类物质浓度形成梯度变化。例如，所述光透明剂由两种不同配比的混合溶液组成；其中，按照体积百分比，第一混合溶液由25％-40％的甲酰胺、15％-30％的水和30％-60％的醇类物质组成，第二混合溶液由15％-25％的甲酰胺、15％-30％的水和45％-70％的醇类物质组成。在该光透明剂中，第一混合溶液与第二混合溶液相互独立，并非以混合形式存在。

[0036] 又例如，所述光透明剂由三种不同配比的混合溶液组成；其中，按照体积百分比，第三混合溶液由30％-40％的甲酰胺、15％-30％的水和30％-55％的醇类物质组成，第四混合溶液由20％-30％的甲酰胺、15％-30％的水和40％-65％的醇类物质组成，第五混合溶液由15％-20％的甲酰胺、15％-30％的水和50％-70％的醇类物质组成。在该光透明剂中，第三混合溶液、第四混合溶液及第五混合溶液相互独立，并非以混合形式存在。

[0037] 其中，所述醇类物质为多元醇。进一步，所述醇类物质为三乙醇胺、N，N，N′，N′-四(2-羟基丙基)乙二胺、甘油或山梨醇中任意一种或几种。

[0038] 本申请实施例光透明剂化学成分的形成，是基于以下原理：

[0039] 甲酰胺作用于组织时，由于其具有水和作用，能够使得组织吸水膨胀，一方面用于疏松组织，一方面用于减小蛋白成分的折射率，减小组织成分间折射率的差异；用量大于40％易使得组织膨胀严重，小于15％则效果不明显。三乙醇胺、N，N，N′，N′-四(2-羟基丙基)乙二胺、甘油或山梨醇主要用于折射率匹配；用量大于70％试剂过于黏稠，不利于渗透，小于30％试剂折射率偏低，影响最后透明程度。水作溶剂利于保持荧光蛋白的荧光信号，因为大多数荧光蛋白的发光需要在水环境中。该光透明剂作用于生物组织之后，一方面通过减小组织内高折射率成分的折射率，一方面增加组织内低折射率介质的折射率，逐步使得组织内部折射率均一化，降低生物组织内部散射，使组织变得透明。

[0040] 该光透明剂能在短时间内使生物组织变得透明、提高成像深度，且保留样本的荧光信号是基于以下原理：

[0041] 由于甲酰胺具有较高的渗透速率，能够快速引起组织吸水、膨胀、疏松，结合三乙醇胺、N，N，N′，N′-四(2-羟基丙基)乙二胺、甘油或山梨醇中一种或任意几种进行折射率匹配，能够伴随甲酰胺快速渗透进组织，因此能够快速实现组织光透明，由于试剂是以水作溶剂，且使用的试剂为中性或碱性，因此对荧光蛋白的信号具有良好的保持作用。

[0042] 另一方面，基于同一发明构思，本申请实施例提供了该生物组织光透明剂在生物组织光透明化处理中的应用。该应用中所涉及的生物组织适用于软组织。所述软组织包括脑组织、胚胎组织和其它软组织，例如，肺、小肠及胰腺等。

[0043] 另一方面，基于同一发明构思，本申请实施例还提供了一种生物组织光透明化的处理方法，参见图1，具体包括以下步骤：

[0044] 步骤S110：将待处理生物组织进行分离并固定；

[0045] 其中，所述生物组织为软组织。所述软组织包括脑组织、胚胎组织和其它软组织，例如，肺、小肠及胰腺等。

[0046] 步骤S120：使用所述光透明剂浸泡所述待处理生物组织，直至所述待处理生物组织变得透明。

[0047] 本步骤中使用的光透明剂为一种配比的甲酰胺、水以及醇类物质的混合溶液；或者，所述光透明剂为两种或两种以上不同配比的甲酰胺、水以及醇类物质的混合溶液。

[0048] 具体而言，当使用两种或两种以上不同配比的光透明剂浸泡所述待处理生物组织时，按照在不同配比的光透明剂中甲酰胺浓度逐渐降低、醇类物质浓度逐渐增加的次序，依次进行浸泡处理。按照甲酰胺浓度由高到低的次序对组织进行浸泡，开始甲酰胺浓度高，可使样本充分水合，增加通透性，便于后面高折射率的多元醇类物质渗透进组织，以达到折射率匹配的目的，达到透明效果更好的技术效果。一般而言，针对比较薄的组织样本，例如500μm的脑片组织，使用一种配比的光透明剂即可以使得透明；针对较厚的样本(毫米级别)，例如1.5mm的组织样本，优选使用两种或两种以上不同配比的光透明剂分别处理达到透明，当然，使用一种配比的光透明剂也可使得透明。

[0049] 本步骤中，所述浸泡的时间在2天以内。具体而言，针对不同类型的生物组织，浸泡时间在几小时至2天内，即可使组织透明，大部分甚至在几小时至1天内即可使组织透明，透明时间短且保留了样本的荧光信号。

[0050] 以下通过实施例对本申请作更详细的描述。这些实施例仅是对本申请最佳实施方式的描述，并不对本申请的范围有任何的限制。

[0051] 本申请实施例的光透明剂配方如表1所示。

[0052] 表1 实施例光透明剂配方表(体积比)

[0053]

[0054] 下面针对实施例的光透明剂配方具体说明该光透明剂的应用试验及效果。

[0055] 应用例1

[0056] 将Cx3Cr1-GFP标记的转基因小鼠，经过灌流、后固定、切片为1mm脑片，用于透明试验。光透明剂按照表1中实施例1、2、6各成分的比例分别配置成混合溶液，依次使用实施例6→2→1的光透明剂直接浸泡脑片组织，共作用3小时左右。图2给出了1mm脑片透明处理前、后拍摄的直观图像。其中左侧脑片为透明前拍摄，由于脑片组织的混浊特性，我们不能看到脑片下方格子纸的黑色线条；右侧为脑片透明后拍摄，此时脑片变得透明，下方格子纸变得清晰可见。并利用共聚焦显微镜进行荧光成像，如图5所示，透明后，荧光保持良好，且光学成像深度显著高于透明前。需要说明的是，使用任一单一实施例配方或其它几种实施例配方的组合也可达到相同或相似效果，例如：实施例5→2→1的组合、6→3→1的组合、4→2→1的组合、6→7→9的组合、4→7→9的组合、8→7→9的组合、8→7→1的组合、10→7→9的组合、10→7→1的组合、实施例4→2的组合、实施例10→7的组合、实施例6→9的组合等，此处不一一列举。

[0057] 应用例2

[0058] 将出生后2天的幼年C57小鼠的全脑取材、后固定，用于透明试验。光透明剂按照表1中实施例1、2、4各成分的比例分别配置成混合溶液，依次使用实施例4→2→1的光透明剂直接浸泡共1天。图3给出了幼年全脑透明处理前、后拍摄的直观图像。其中左侧为透明前拍摄，由于脑组织的混浊特性，我们不能看到脑片下方格子纸的黑色线条；右侧为透明后拍摄，此时全脑变得透明，下方格子纸变得清晰可见。需要说明的是，使用任一单一实施例配方或其它几种实施例配方的组合也可达到相同或相似效果，例如：实施例5→2→1的组合、6→3→1的组合、6→2→1的组合、6→7→9的组合、4→7→9的组合、8→7→9的组合、8→7→1的组合、10→7→9的组合、10→7→1的组合、实施例4→2的组合、实施例10→7的组合、实施例6→9的组合等，此处不一一列举。

[0059] 应用例3

[0060] 将胚胎13.5天的C57小鼠胚胎头部取材、后固定，用于透明试验。光透明剂按照表1中实施例2、4各成分的比例分别配置成混合溶液，依次使用实施例4→2的光透明剂直接浸泡共1天。图4给出了胚胎头部组织透明处理前、后拍摄的直观图像。其中左侧为透明前拍摄，由于胚胎组织的混浊特性，我们不能看到脑片下方格子纸的黑色线条；右侧为透明后拍摄，此时胚胎头部变得透明，下方格子纸隐约可见。需要说明的是，使用任一单一实施例配方或其它几种实施例配方的组合也可达到相同或相似效果，例如：实施例6→2→1的组合、实施例5→2→1的组合、6→3→1的组合、4→2→1的组合、6→7→9的组合、4→7→9的组合、8→7→9的组合、8→7→1的组合、10→7→9的组合、10→7→1的组合、实施例10→7的组合、实施例6→9的组合等，此处不一一列举。

[0061] 应用例4

[0062] 将胚胎13.5天的C57小鼠胚胎头部取材、后固定。利用三维免疫组化对胚胎进行染色，经过封闭、一抗孵育、二抗孵育，标记神经纤维。使用实施例5的光透明剂浸泡胚胎组织使其透明，在透明前、后，利用共聚焦显微镜进行荧光成像，如图6所示。透明前，胚胎上肢手部位置，只能观察到少数的神经纤维，透明后，神经纤维清晰可见。需要说明的是，使用任一单一实施例配方或其它几种实施例配方的组合也可达到相同或相似效果，例如：实施例6→2→1的组合、实施例5→2→1的组合、6→3→1的组合、4→2→1的组合、6→7→9的组合、4→7→9的组合、8→7→9的组合、8→7→1的组合、10→7→9的组合、10→7→1的组合、实施例4→
2的组合、实施例10→7的组合、实施例6→9的组合等，此处不一一列举。

[0063] 上述试验结果表明，使用本申请实施例的生物组织光透明剂浸泡胚胎等组织，可在短时间内使得组织变得透明，原来所不能看见的神经结构在浸泡后都可以清楚显示，荧光图像对比度明显增强。

[0064] 最后所应说明的是，以上具体实施方式仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照实例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。