一株用于净化糖蜜酒精废水的菌株及其应用

摘要

本发明涉及一株微生物菌株及其应用，具体涉及一种赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sp.)S6及其在糖蜜酒精废水中的应用，属于微生物应用技术领域。本发明的目的是提供一种该菌株是能在以糖蜜酒精废水为唯一碳源进行生长的微生物菌株赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sp.)S6，及其相应的培养条件并公开在不添加任何微量元素的情况下，COD去除效果较为理想，48h可达64.22％。此外，该菌还具有一定的脱氮除磷作用。

权利要求

1.一株用于净化糖蜜酒精废水的菌株，其特征在于：所述的用于净化糖蜜酒精废水的菌株的名称为赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sp.)S6，保藏编号为CCTCC NO：M2017085，于2017年3月6日保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心。

2.权利要求1所述的用于净化糖蜜酒精废水的菌株在糖蜜酒精废水处理中的应用。

3.根据权利要求2所述的用于净化糖蜜酒精废水的菌株在糖蜜酒精废水处理中的应用，其特征在于包含如下具体步骤：(1)将所述的用于净化糖蜜酒精废水的菌株接种于发酵培养基中进行发酵；

(2)将步骤(1)发酵后得到的菌液接种到糖蜜酒精废水中，发酵处理。

4.根据权利要求3所述的用于净化糖蜜酒精废水的菌株在糖蜜酒精废水处理中的应用，其特征在于：步骤(1)中的所述的发酵培养基的组成如下：糖蜜酒精废水的用量是以发酵培养基COD为105851.15mg/L来计算，1mol/L的MgSO4 2.00mL，1mol/L的CaCl2 0.10mL，5×M9盐溶液

200mL，加蒸馏水定容至1000mL，pH为7.0。

5.根据权利要求3所述的用于净化糖蜜酒精废水的菌株在糖蜜酒精废水处理中的应用，其特征在于：所述的发酵的条件为37℃、转速为200rpm好氧环境摇床中培养。

说明书

一株用于净化糖蜜酒精废水的菌株及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于微生物领域，特别涉及一株用于净化糖蜜酒精废水的菌株及其应用。

背景技术

[0002] 制糖副产物—糖蜜，常常用来发酵生产酒精，在生产酒精过程中会释放出大量高浓度的有机废水，称之为糖蜜酒精废水。大量的废水不经处理直接排放会造成水体富营养化，破坏水体和陆地生态系统。糖蜜酒精废水直接用于农灌，会造成土壤酸化板结现象。如果用来浇灌甘蔗地，会使甘蔗产量增多，但是会降低甘蔗中的含糖量。当前处理糖蜜酒精废水的方法有理化方法和生物处理方法。相比较于理化方法，生物处理方法具有更加安全高效，周期短，成本低，不会造成二次污染，在处理过程中还可以产生沼气能源，处理后的菌体又是很好的饲料蛋白。这些优点使得生物处理方法成为当前研究的重点和难点。对于生物处理方法来说，良好的微生物菌种是保证废水生物处理成功的关键，从环境中筛选优良的微生物菌种资源是一种重要途径。所以近些年研究者将筛选出对糖蜜酒精废水具有高效生物降解能力的微生物(细菌，真菌等)作为研究的出发点。王维嘉从糖蜜酒精废水氧化塘中分离得到两株细菌PSB-C和PSB-D，这两株细菌属于光合细菌的红假单胞菌属。在最佳反应条件下(COD浓度为20800mg/L，反应温度为30℃，反应时间3d)两株菌对废水的COD去除率分别是55％和54％。刘建福从UASB的反应器颗粒污泥中筛选出8株细菌，分别为皮杆菌属、棒杆菌属、微小杆菌属、乳杆菌属、纤维单孢菌属、丙酸杆菌属、红长命菌属，在废水COD浓度为24000mg/L，37℃条件下处理，COD的去除率为25.1％(疑问：看文献复合菌剂COD去除率90％以上，最好能提供文献信息，信息对应得更为明确些)。范艳霞从IC反应器污泥富集的菌群，菌的分布属于Erysipelotrichales、Clostridiales、Lactobacillales、Xanthomonadales、Burkholderiales、Enterobacteriales、Bacteroidales 7个目中，在最适反应条件下，同时添加营养物质，处理7d，COD的去除率为38.5％。Mohana筛选得到菌群DMC接种到同时添加葡萄糖和无机盐糖蜜酒精废水中，37℃处理4d，COD去除率为51％，废水脱色率为67％；该菌群经16SrDNA比对，包括铜绿色假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa PAO1)、嗜麦芽黄杆菌(stenotrophomonas maltophila)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)。chopra用白腐真菌和云芝菌(C.versicolor)处理糖蜜酒精废水，添加葡萄糖和蛋白胨作为营养物质，8d后COD和色度的去除率都为53％。Ghosh用恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)和气单胞菌(Aeromonas sp.)两步处理糖蜜酒精废水，在废水中添加1％的葡萄糖。最终，24h处理后恶臭假单胞菌的COD去除率为44.4％，色度去除率为60％，气单胞菌的COD去除率为44.4％。

[0003] 目前，还没有应用赖氨酸芽孢杆菌降低糖蜜酒精废水COD的报道。

发明内容

[0004] 本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一株用于净化糖蜜酒精废水的菌株。

[0005] 本发明的另一目的在于提供所述用于净化糖蜜酒精废水的菌株的应用。

[0006] 本发明的目的通过下述技术方案实现：一株用于净化糖蜜酒精废水的菌株，名称为赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sp.)S6，保藏编号为CCTCC NO：M2017085，于2017年3月6日保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心。

[0007] 所述的用于净化糖蜜酒精废水的菌株在糖蜜酒精废水处理中的应用，优选包含如下具体步骤：

[0008] (1)将所述的用于净化糖蜜酒精废水的菌株接种于发酵培养基中进行发酵；

[0009] (2)将步骤(1)发酵后得到的菌液接种到糖蜜酒精废水中，发酵处理。

[0010] 步骤(1)中的所述的发酵培养基的组成优选如下：糖蜜酒精废水(COD＝105851.15mg/L)的用量是以发酵培养基COD为105851.15mg/L来计算，1mol/L的MgSO4 
2.00mL，1mol/L的CaCl2 0.10mL，5×M9盐溶液200mL，加蒸馏水定容至1000mL，pH为7.0。

[0011] 所述的发酵培养基中糖蜜酒精废水(COD＝105851.15mg/L)的用量是以发酵培养基COD为105851.15mg/L来计算。

[0012] 所述的5×M9盐溶液的组成如下：Na2HPO4·7H2O 12.80g，KH2PO4 3.00g，NaCl 0.50g，NH4Cl 1.00g，双蒸水定容至200mL。

[0013] 所述的发酵的条件优选为37℃、转速为200rpm好氧环境摇床中培养。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

[0014] 本发明提供的菌株能在以糖蜜酒精废水为唯一碳源进行生长的微生物菌株在糖蜜酒精废水COD浓度为105851.15mg/L，温度为37℃左右，不添加任何微量元素的情况下，COD去除效果较为理想，48h可达64.22％。此外，该菌还具有一定的脱氮除磷作用。

附图说明

[0015] 图1是本发明提供的用于净化糖蜜酒精废水的菌株的形态照片图；其中，图(A)为革兰氏染色的显微照片图(100×/1.25oil)，图(B)为菌落照片图。

[0016] 图2是本发明用多序比对软件MEGA5.0构建的用于净化糖蜜酒精废水的菌株的系统发育树，其中，分支数值代表1000次计算后的置信度，比例尺表示遗传距离，比例尺表示遗传距离。

[0017] 图3是本发明提供的用于净化糖蜜酒精废水的菌株的生长曲线图。

[0018] 图4是本发明提供的用于净化糖蜜酒精废水的菌株去除糖蜜酒精废水COD的检测结果图。

[0019] 图5是本发明提供的用于净化糖蜜酒精废水的菌株去除糖蜜酒精废水氨氮的检测结果图。

[0020] 图6是本发明提供的用于净化糖蜜酒精废水的菌株去除糖蜜酒精废水总磷的检测结果图。

具体实施方式

[0021] 下面结合实施例和说明书附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

[0022] 本发明所用的培养基如下：

[0023] 驯化培养基为：将糖蜜酒精废水与过滤的猪粪水按照COD之比3：2配制成总COD浓度为4000mg/L的混合培养液。将混合培养液和丰富培养基分别以体积比1：4(驯化培养基A)、2：4(驯化培养基B)、3：4(驯化培养基C)、4:0(驯化培养基D)配比混匀，将pH调至7.00，115℃低压湿热灭菌15min，分别依次得到驯化培养基A、B、C、D。

[0024] 丰富培养基为：蛋白胨10.00g，牛肉膏3.00g，酵母粉5.00g，葡萄糖3.00g，氯化钠3.00g，磷酸氢二钾2.50g，大豆肉汤3.00g，水定容至1000mL，pH7.00。

[0025] LB固体培养基为：胰蛋白胨10.00g，酵母粉5.00g，氯化钠5.00g，琼脂11g，水定容至1000mL，pH 7.00。

[0026] 发酵液体培养基为：糖蜜酒精废水(COD＝105851.15mg/L)的用量是以发酵培养基COD为105851.15mg/L来计算，1mol/L的MgSO4 2.00mL，1mol/L的CaCl2 0.10mL，5×M9盐溶液200mL，加蒸馏水定容至1000mL，pH为7.0。

[0027] 5×M9盐溶液的组成如下：Na2HPO4·7H2O 12.80g，KH2PO4 3.00g，NaCl 0.50g，NH4Cl 1.00g，双蒸水定容至200mL。

[0028] 发酵固体培养基为：即在发酵液体培养基中加入琼脂，琼脂的浓度为1.1％(w/v)。

[0029] 实施例1

[0030] (1)驯化培养：从运行至稳定期的IC反应器(有效容积约为20L，)底部提取污泥(未驯化污泥取自广西贵糖股份有限公司运行中的IC反应器底部，富含微生物菌群)，用无菌玻璃棒将活性污泥捣碎后混匀，静置5min，取其上清液。以5％(w/v)的接种量接入丰富培养基中，置于好氧(37℃下，200rpm摇床振荡培养)环境下培养2d。以5％(v/v)的接种量接入驯化培养基A中，相同条件下培养2d后。摇匀以5％(v/v)的接种量转接入驯化培养基B中，相同条件下培养3d后。摇匀以5％(v/v)的接种量转接入驯化培养基C中，相同条件下培养3d。最后摇匀以5％(v/v)的接种量转接入仅有糖蜜酒精废水与猪粪水混合液的驯化培养基中培养(即驯化培养基D)3d，驯化阶段结束。

[0031] (2)分离纯化培养：样品取自驯化终阶段的发酵菌液，使用稀释涂布平板法对样品进行梯度稀释后涂LB板；分别选取10-3、10-4、10-5、10-6四个梯度样品，每个梯度设置三个平行，以1％的接种量涂板，设置一个空白对照，置于37℃震荡培养并观察每天生长情况；当平板菌落丰度较多时，观察菌落形态，运用平板划线法尽可能将平板上形态不一样的菌株挑出后转划于新鲜的丰富培养基上，并连续挑出单菌落进行划线纯化，置于好氧环境条件下37℃、150～200rpm培养，至少重复以上划线操作3次及以上。

[0032] (3)形态鉴定：分离纯化培养的菌株用革兰氏染色法鉴别革兰氏阴/阳性菌。将菌株在LB固体培养基上37℃下培养1-2d后观察菌落大小、形状、颜色和表面特征并加以描述。革兰氏染色以及菌落形态如图1所示。该株革兰氏染色为红色，形状为杆状，确定为阴性杆状菌。在LB固体培养基上生长时，单菌落圆形，扁平状，边缘不齐，湿润，表面光滑，易挑取，正反两面均呈浅褐色。

[0033] (4)分子生物学鉴定：以基因组DNA为模板，使用通用引物27f(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492r(5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’)PCR扩增16S rDNA。产物送至生工生物工程(上海)有限公司进行测序。测序得到的序列如下所示，将测序得到的16S rDNA片段与Genbank数据库中已知细菌进行比对从而获得样品在属分类水平上的信息。并用多序比对软件MEGA5.0构建系统发育树如图2所示。

[0034] GCTGGCTCCAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGGCTTCATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGAACGACTTTATCGGATTAGCTCCCTCTCGCGAGTTGGCAACCGTTTGTATCGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTAAATGATGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACCGTTGCCCCCGAAGGGGAAACTATATCTCTACAGTGGTCAACGGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAAAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCAAATCTCTACGCATTTCACCGCTACACTTGGAATTCCACTTTCCTCTTCTGCACTCAAGTCCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCACGGTTGAGCCGTGGGCTTTCACATCAGACTTAAAGGACCGCCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTAATAAGGTACCGTCAAGGTACAGCCAGTTACTACTGTACTTGTTCTTCCCTTACAACAGAGTTTTACGATCCGAAAACCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGGCTTTCGCCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTCGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGCCCATCCTATAGCGACAGCCGAAACCGTCTTTCAGTCTTTCACCATGAAGCAAAAGAGATTATTCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAAACTATAGGGTAGGTTGCCCACGTGT。

[0035] 经鉴定，确定分离得到的菌属于赖氨酸芽孢杆菌，将其命名为赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sp.)S6,保藏编号为CCTCC NO:M2017085，于2017年3月6日保藏于位于中国湖北武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心。

[0036] 实施例2

[0037] 取赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sp.)S6菌株进行生长曲线测定：将位于LB平板上的细菌接种在丰富培养基中，在37℃、转速为200rpm/min好氧环境摇床中培养培养，可观察到细菌的生长繁殖有一定的规律性，以OD600值作纵坐标，以培养时间作横坐标，绘制成生长曲线。

[0038] 在丰富培养基中的生长曲线图如图3所示，可见，经过驯化后的微生物没有调整期或者是调整期很短，接种后很快就进入对数期，48h后微生物进入稳定期。

[0039] 实施例3

[0040] 取赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sp.)S6菌株用驯化培养基，于200rpm培养3d。再以1％的接种量将好氧菌菌液接种于发酵液体培养基中，分别于好氧37℃200rpm摇床振荡培养；每天测定其COD、氨氮、总磷，一共测定6d。观察其COD、氨氮、总磷的变化。

[0041] 在发酵培养基中的COD去除效果如图4所示：第1d的COD去除率为45.06％，第2d的COD去除率为64.22％，。随着处理时间的延长，COD去除率增幅呈下降趋势，发酵处理6天后，COD去除率仅仅达到71.00％。在第3d～6d，随着发酵时间的延长，其中的营养物质在减少，一部分细菌的活性可能就下降。

[0042] 在发酵培养基中的氨氮去除效果如图5所示：在第1d～4d内随着发酵时间的延长，氨氮的去除率在渐渐增加。在第4d达到最大值为21.90％。第5d～6d氨氮的去除率相比较第4d有所下降。

[0043] 在发酵培养基中的总磷去除效果如图6所示：在发酵的第1d～2d内微生物的活性高，对总磷的吸收效果好，去除率较高。在随后处理时间内，总磷的去除率下降。总体来看，该菌株对总磷的去除率低于5％，去除效果不理想。

[0044] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。