一种凝集变异细胞的试剂组合物

摘要

本发明提供了一种凝集变异细胞的试剂组合物，所述组合物包括1，4‑二甲氨基蒽醌。本发明人在研究过程中意外地发现1，4‑二甲氨基蒽醌具有良好的凝集变异细胞的效果。对凝集的变异细胞进行观察，可以获取作为中间结果的信息，对该信息进行统计分析设定判断标准后即可以用于肿瘤的早期检测。

权利要求

1.一种凝集肿瘤细胞的试剂组合物，其特征在于，所述试剂组合物包括1，4-二甲氨基蒽醌，所述试剂组合物为水溶液；其中，1，4-二甲氨基蒽醌的浓度为1％－2.5％(w/v)，pH为

9.5-12。

2.如权利要求1所述的试剂组合物，其特征在于，所述试剂组合物中1，4-二甲氨基蒽醌浓度为2.0％。

3.如权利要求2所述的试剂组合物，其特征在于，所述试剂组合物的pH为10-11.5。

4.如权利要求1所述的试剂组合物，其特征在于，用氢氧化钠调整所述试剂组合物的pH值。

5.如权利要求4所述的试剂组合物，其特征在于，所述试剂组合物的pH为10.8。

6.1，4-二甲氨基蒽醌在制备凝集肿瘤细胞的试剂组合物中的用途，其中，所述试剂组合物为水溶液，所述试剂组合物中1，4-二甲氨基蒽醌的浓度为1％－2.5％(w/v)，所述试剂组合物的pH为9.5-12。

7.一种凝集肿瘤细胞的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：(1)提供体液样本涂片；

(2)将权利要求1所述的凝集肿瘤细胞的试剂组合物滴加于所述涂片上，进行凝集反应；

(3)干燥步骤(2)获得的涂片；

所述方法为非诊断目的的。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述体液样本为血液全血样本、胸水样本、脑脊液样本、或腹水样本。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中凝集时间为60－180分钟。

10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中干燥温度为16－28℃；和/或所述步骤(3)中干燥空间湿度为40％－80％。

11.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述体液样本为血液末梢血样本。

说明书

一种凝集变异细胞的试剂组合物

技术领域

[0001] 本发明属于生物医学领域，具体地说，本发明涉及一种凝集变异细胞的试剂组合物。

背景技术

[0002] 肿瘤(tumor，neoplasm)是指细胞在致瘤因素作用下失去对其生长的正常调控，导致异常增生而产生的疾病。肿瘤可分为良性和恶性肿瘤两大类。前者生长缓慢，与周围组织界限清楚，不发生转移，对人体健康危害不大。后者生长迅速，可转移到身体其它部位，还会产生有害物质，破坏正常器官结构，使机体功能失调，威胁生命。

[0003] 恶性肿瘤也叫癌症(cancer)是目前危害人类健康最严重的一类疾病。在美国，恶性肿瘤的死亡率仅次于心血管疾病而居第二位。癌细胞有三个显著的基本特征即：不死性，迁移性和失去接触抑制。癌细胞大小形态不一，通常比它的源细胞体积要大，核质比显著高于正常细胞，可达1:1，正常的分化细胞和之比仅为1:4-6。核形态不一，并可出现巨核、双核或多核现象。核内染色体呈非整倍态(aneuploidy)，某些染色体缺失，而有些染色体数目增加。正常细胞染色体的不正常变化，会启动细胞凋亡过程，但是癌细胞(变异细胞)中，细胞凋亡相关的信号通路产生障碍，也就是说癌细胞具有不死性。

[0004] 恶性肿瘤在播散、侵袭、转移的过程中，常伴有肿瘤细胞进入体液，如血液、胸水、脑脊液等。因此，在这些体液样本中找到变异细胞，是判定肿瘤存在甚至转移的有效证据。但是，这些体液样本包含多种细胞且变异细胞的数目常常较少，这给临床检测带来挑战。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于提供一种凝集变异细胞的试剂组合物及其应用。

[0006] 在本发明的第一方面，提供了一种凝集变异细胞的试剂组合物，所述组合物包括1，4-二甲氨基蒽醌。

[0007] 在另一优选例中，所述试剂组合物还包括碱性物质。

[0008] 在另一优选例中，所述碱性物质选自下组的一种或多种：氢氧化钠、和氢氧化钾；优选为氢氧化钠。

[0009] 在另一优选例中，所述试剂组合物还包括水。

[0010] 在另一优选例中，试剂组合物为水溶液。

[0011] 在另一优选例中，所述水溶液的pH为碱性。

[0012] 在另一优选例中，所述水溶液的pH为约8-12；优选地为约9.5-12；更优选地为约10-11.5。

[0013] 在另一优选例中，所述试剂组合物中1，4-二甲氨基蒽醌的含量为约0.5％－4％(w/v)；优选为约0.8％－3.5％(w/v)；更优选为约1％－3％(w/v)；最优选为1％－2.5％(w/v)。

[0014] 本发明的第二方面，提供了1，4-二甲氨基蒽醌在制备凝集变异细胞的试剂组合物中的用途。

[0015] 在另一优选例中，所述试剂组合物还包括碱性物质。

[0016] 在另一优选例中，所述碱性物质选自下组的一种或多种：氢氧化钠、和氢氧化钾；优选为氢氧化钠。

[0017] 在另一优选例中，所述试剂组合物还包括水。

[0018] 在另一优选例中，试剂组合物为水溶液。

[0019] 在另一优选例中，所述水溶液的pH为碱性。

[0020] 在另一优选例中，所述水溶液的pH为约8-12；优选地为约9-11.5；更优选地为约10-11.5。

[0021] 本发明的第三方面，提供了一种凝集变异细胞的方法，所述方法包括步骤：

[0022] (1)提供体液样本涂片；

[0023] (2)将权利要求1所述的凝集变异细胞的试剂组合物滴加于所述涂片上，进行凝集反应；

[0024] (3)干燥步骤(2)获得的涂片。

[0025] 在另一优选例中，所述方法为非诊断目的的。

[0026] 在另一优选例中，所述体液样本为血液全血样本、血液末梢血样本、胸水样本、脑脊液样本、腹水样本。

[0027] 在另一优选例中，所述体液样本中含变异细胞。

[0028] 在另一优选例中，所述步骤(2)中凝集时间为约60－180分钟；优选为70－130分钟；更优选为约80－120分钟。

[0029] 在另一优选例中，所述步骤(3)中干燥温度为约16－28℃；优选为18－26℃；更优选为20－25℃。

[0030] 在另一优选例中，所述步骤(3)中干燥空间湿度为约40％－80％；优选为50％－70％；更优选为60％－70％。

[0031] 在另一优选例中，制备涂片所需要的样本量为约20-30微升(优选为约25微升)；优选地，滴加的试剂组合物的量为约40-60微升(优选为约50微升)。

[0032] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

[0033] 图1显示了使用实施例1中的试剂组合物进行凝集血液样本中变异细胞的检测时在×10倍镜下观察到的凝集细胞团。

[0034] 图2显示了凝聚颗粒为不规则类园形晶型颗粒、立体感较强，呈淡绿色、淡黄色或棕黄色，颗粒中心色淡且亮——有屈光性，表面附有试剂和血浆质的混合物，颗粒四周应混合物较多而常呈棕黑色、墨绿色。在一般情况下，较大颗粒的四周围常有深色园面状底纹，最大的颗粒周围常有弧形深色条纹，这些底纹可为寻找颗粒提供目标。

[0035] 图3显示了使用对比试剂组合物进行凝集血液样本中肿瘤细胞检测的典型结果，无法观察到凝集细胞团。

具体实施方式

[0036] 本发明人在研究过程中意外地发现1，4-二甲氨基蒽醌具有良好的凝集变异细胞的效果，在此基础上完成了本发明。对凝集的变异细胞进行观察，可以获取作为中间结果的信息，对该信息进行统计分析设定判断标准后即可以用于肿瘤的早期检测。

[0037] 在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。

[0038] 除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

[0039] 虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。

[0040] 本发明中术语“变异细胞”是相对于“正常细胞”而言的，指与正常细胞相比发生了突变的细胞，包括肿瘤细胞等。正常生命细胞的外面包裹一层肽链、核酸链、糖链等体现生命现象的生命链，与正常细胞相比，变异细胞更常见的出现这些生命链的表达水平的异常以及结构异常，这类异常通常具有调节黏附分子受体功能、直接涉及细胞的粘附，可以改变细胞的粘附性和转移性，促进变异细胞的侵袭和转移行为，最终导致肿瘤的发展。

[0041] 下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

[0042] 实施例1试剂组合物配置和优化

[0043] 配置试剂组合物的步骤如下：

[0044] 称量凝集剂1，4-二甲氨基蒽醌放置在玻璃器皿内，加入计算好的双蒸水，用氢氧化钠调整pH值到设定值，搅拌均匀，静置后，即获得试剂组合物，分装待用。

[0045] 优化后的凝集肿瘤细胞检测步骤如下：

[0046] (1)取肿瘤患者指端末梢或耳垂血约30μl(2滴)静脉血或者全血，加样枪直接加样25微升，推成宽大均匀的血片2张，置恒温恒湿工作环境内，平放待干燥。

[0047] (2)用胶头滴管吸取本发明的试剂组合物，于约5cm高处在每张血片上间隔均匀滴加3滴，每滴约50μl、液斑φ为10～12mm，共制成6个液斑。

[0048] (3)20－25℃，60％－70％湿度下，静置待干燥约2小时，等待凝集、色斑干燥即可进行以下操作。

[0049] (4)干燥后的涂片通过拍片进行分析，观察凝集效果。

[0050] 研发过程中对试剂组合物中各影响因素进行了优化筛选，部分典型的影响因素的筛选结果如下。

[0051] 表1列出了对试剂组合物中1，4-二甲氨基蒽醌浓度的部分筛选结果：

[0052] 表1

[0053]

[0054]

[0055] 表2列出了对试剂组合物的最适pH的部分筛选结果，其中1，4-二甲氨基蒽醌浓度为2.0％。

[0056] 表2

[0057] 试剂组合物pH 凝集效果 试剂组合物pH 筛选结果5.5 无 10.5 有
6.0 无 10.8 有
6.5 无 11.0 有
7.0 无 11.2 有
7.5 无 11.5 有
8.0 无 11.8 有
8.5 无 12.0 有
9.0 无 12.5 无
9.5 有 13.0 无
10.0 有 13.5 无
10.2 有    

[0058] 经过大量筛选，最终确定了本发明的试剂组合物中1，4-二甲氨基蒽醌的最佳浓度为约1％－2.5％(w/v)；最佳pH为约10-11.5。

[0059] 最终确定较优的试剂组合物如下：

[0060] 1，4-二甲氨基蒽醌碱性水溶液，含1，4-二甲氨基蒽醌1％－2.5％(w/v)，pH为约10-11.5。

[0061] 参照上述优化后试剂组合物的配置方法，配置了一系列的对比试剂组合物，区别仅在于将实施例1中的“1，4-二甲氨基蒽醌”分别替换为了表1中的化合物2-7。然后使用上述方法检测对比组合物凝集肿瘤细胞的效果。

[0062] 经多次试验检测，结果表明：当使用含1，4-二甲氨基蒽醌的试剂组合物进行实验时出现了凝集现象，使用其它对比试剂组合物均未观察到凝集现象，检测结果如表1所示。

[0063] 表3

[0064]

[0065] 另外，本申请人对分散蓝335、分散蓝338、分散蓝366(分散蓝CR-E，分子式C19H18N6O2)进行了检测，发现分散蓝335、分散蓝338、分散蓝366均没有观察到凝集效果。

[0066] 图1显示了使用实施例1中的试剂组合物进行凝集血液样本中变异细胞(肿瘤细胞)的检测时在×10倍镜下观察到的凝集细胞团。

[0067] 图2放大显示的凝聚颗粒为不规则类园形晶型颗粒、立体感较强，呈淡绿色、淡黄色或棕黄色，颗粒中心色淡且亮——有屈光性，表面附有试剂和血浆质的混合物，颗粒四周应混合物较多而常呈棕黑色、墨绿色。在一般情况下，较大颗粒的四周围常有深色园面状底纹，最大的颗粒周围常有弧形深色条纹，这些底纹可为寻找颗粒提供目标。

[0068] 图3显示了使用对比试剂组合物进行凝集血液样本中肿瘤细胞检测的典型结果，无法观察到凝集细胞团。

[0069] 实施2凝集肿瘤细胞检测

[0070] (1)采受检者指端末梢或耳垂血30μl(2滴)静脉血或者全血，加样枪直接加样25微升，推成宽大均匀的血片2张，置恒温恒湿工作环境内，平放待干燥。

[0071] (2)用胶头滴管吸取本发明的试剂组合物，于约5cm高处在每张血片上间隔均匀滴加3滴，每滴约50μl、液斑φ为10～12mm，共制成6个液斑。

[0072] (3)20－25℃，60％－70％湿度下，静置待干燥约2小时，等待凝集、色斑干燥即可进行以下操作。

[0073] (4)干燥后的涂片通过拍片进行分析；

[0074] (5)结合临床实际情况进行统计分析，凝集颗粒面积大于设定数值M，即可判定为阳性；颗粒面积小于设定数值N或者没有，判定为阴性；介于数值M和N之间，判定为有倾向性，建议定期复查。

[0075] 本实施例中随机选取10例肿瘤患者的血液样本和10例正常人血液样本，使用实施例1的较优试剂组合物进行凝集肿瘤细胞(变异细胞)检测实验。

[0076] 实验结果如下表所示：

[0077] 表4

[0078]

[0079]

[0080] 备注：样本编号1-10为肿瘤患者血液样本，11-20为正常人血液样本；“+”表示阳性，观察到肿瘤细胞(变异细胞)凝集效果；“—”表示阴性，未观察到肿瘤细胞(变异细胞)凝集效果。“+/—”表示介于数值M和N之间，可能为肿瘤早期，有倾向性，需要跟踪观察。

[0081] 从上表中可以看出，使用本发明的试剂组合物对血液样本进行检测，可以有效的判断出肿瘤患者的血样样本。

[0082] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。