一种欧文氏弧菌的环介导等温扩增检测引物组、检测方法和检测试剂盒

摘要

本发明公开了一种欧文氏弧菌的环介导等温扩增检测引物组、检测方法和检测试剂盒。该检测引物组为：前外引物F3：5’‑CATACAGCTCTGCGTCTG‑3’；前内引物FIP：5’‑GCGG ATAGCGTCTGCCCACTTCACCGTGCTTATGTA‑3’；后内引物BIP：5’‑GCCAAGGCCGTGTA GTTATCTTGCTGCTGAATCTGTAGTGAA‑3’；前环引物LF：5’‑CGGAATTGCAGACATTAC GC‑3’；后环引物LB：5’‑CTCTGCAGGTACTGGTAACC‑3’。本发明的检测引物组、检测试剂盒和检测方法具有特异性强，操作方便简单，检测时间短等优点，其反应过程不需要昂贵的仪器设备，反应结果可视化，直接通过肉眼观察即可判断，适合于现场快速检测的推广使用。

权利要求

1.一种欧文氏弧菌的环介导等温扩增检测引物组，其特征在于：所述的检测引物组如下所示：前外引物F3：5’-GCGTAGTAGGCGACCA-3’；

后外引物B3：5’-CATACAGCTCTGCGTCTG-3’；

前内引物FIP：5’-GCGGATAGCGTCTGCCCACTTCACCGTGCTTATGTA-3’；

后内引物BIP：5’-GCCAAGGCCGTGTAGTTATCTTGCTGCTGAATCTGTAGTGAA-3’；

前环引物LF：5’-CGGAATTGCAGACATTACGC-3’；

后环引物LB：5’-CTCTGCAGGTACTGGTAACC-3’。

2.一种欧文氏弧菌的环介导等温扩增检测试剂盒，包括环介导等温扩增反应液、Bst DNA聚合酶、MnCl2溶液、钙黄绿素显色液、阳性对照质控品、阴性对照质控品和检测引物组，其特征在于，所述的检测引物组如下所示：前外引物F3：5’-GCGTAGTAGGCGACCA-3’；

后外引物B3：5’-CATACAGCTCTGCGTCTG-3’；

前内引物FIP：5’-GCGGATAGCGTCTGCCCACTTCACCGTGCTTATGTA-3’；

后内引物BIP：5’-GCCAAGGCCGTGTAGTTATCTTGCTGCTGAATCTGTAGTGAA-3’；

前环引物LF：5’-CGGAATTGCAGACATTACGC-3’；

后环引物LB：5’-CTCTGCAGGTACTGGTAACC-3’。

3.根据权利要求2所述的欧文氏弧菌的环介导等温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照质控品为含欧文氏弧菌的pryH基因的质粒DNA。

4.根据权利要求2所述的欧文氏弧菌的环介导等温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述的阴性对照质控品为不含欧文氏弧菌的pryH基因的DNA或超纯水。

5.一种非疾病诊断和治疗目的的欧文氏弧菌的环介导等温扩增检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)对样品进行增菌培养获得增菌液，提取增菌液中的基因组DNA作为模板；

(2)使用权利要求1所述的欧文氏弧菌的环介导等温扩增检测引物组，与环介导等温扩增反应液、Bst DNA聚合酶、MnCl2溶液、钙黄绿素显色液及样品基因组DNA混合形成环介导等温扩增反应体系，进行环介导等温扩增反应；

(3)扩增反应结束后，通过钙黄绿素荧光显色法和/或凝胶电泳分析检测样品中是否含有欧文氏弧菌。

6.根据权利要求5所述的非疾病诊断和治疗目的的欧文氏弧菌的环介导等温扩增检测方法，其特征在于，所述的通过钙黄绿素荧光显色法检测样品中是否含有欧文氏弧菌具体为：若扩增产物颜色为亮绿色，则样品中含有欧文氏弧菌；若扩增产物颜色保持橙黄色不变，则样品中不含有欧文氏弧菌。

7.根据权利要求5所述的非疾病诊断和治疗目的的欧文氏弧菌的环介导等温扩增检测方法，其特征在于，所述的通过凝胶电泳分析检测样品中是否含有欧文氏弧菌具体为：将扩增产物进行凝胶电泳，若有梯状条带，则样品中含有欧文氏弧菌；若无梯状条带，则样品中不含有欧文氏弧菌。

8.根据权利要求5所述的非疾病诊断和治疗目的的欧文氏弧菌的环介导等温扩增检测方法，其特征在于，所述的环介导等温扩增反应体系总体积25μL，包括1×Isothermal Amp Buffer、6mmol/L MgSO4、1.4mmol/L dNTP Mix、1.6μmol/L FIP、1.6μmol/L BIP、0.2μmol/L F3、0.2μmol/L B3、0.4μmol/L LF、0.4μmol/L LB、320U/mL Bst 2.0DNA Polyme rase、

1.2mol/L甜菜碱、1mmol/L氯化锰、1mmol/L钙黄绿素2μL和基因组DNA模板1μL，余量为去离子水。

9.根据权利要求5所述的非疾病诊断和治疗目的的欧文氏弧菌的环介导等温扩增检测方法，其特征在于，所述的环介导等温扩增反应的反应条件为：65℃反应60min，80℃终止反应10min。

说明书

一种欧文氏弧菌的环介导等温扩增检测引物组、检测方法和

检测试剂盒

技术领域：

[0001] 本发明属于微生物检测领域，具体涉及一种欧文氏弧菌的环介导等温扩增检测引物组、检测方法和检测试剂盒。背景技术：

[0002] 欧文氏弧菌(Vibrio owensii)是海洋中一种具有强毒力的肠道病原菌，可引发对虾急性肝胰腺坏死症，也可诱发锦绣龙虾在叶状幼体时期快速病变死亡，同时也是蔷薇珊瑚的致病菌，可感染珊瑚，导致珊瑚白化死亡。关于欧文氏弧菌致病以及如何检测防治的报导并不多见，早期对欧文氏弧菌的检测方法只是停留在一些比较传统的微生物分类鉴定以及传统的PCR检测技术。近期，关于欧文氏弧菌的检测方法有了新的进展，等温重组聚合酶扩增法，可以准确快速的检测出欧文氏弧菌，但此法需要用等温扩增荧光检测系统来检测和记录荧光信号的变化，而往往野外基层现场检测需要快速简便的方法，尽可能避免使用昂贵的仪器设备和繁琐的操作过程。

[0003] 环介导等温扩增(loop-mediated isothemal amplification,LAMP)技术是2000年，Notomi等开发的一种恒温核酸扩增方法。其主要特点是，LAMP引物设计主要针对靶基因的6个不同区域，设计4条特异性引物，部分软件经过改进后可以设计6条特异性引物，从而加速了核酸在反应中的合成速度。DNA模板在链置换型DNA聚合酶(Bst DNA Polymerase)的作用下，于65℃恒温扩增30-60min，便可合成大量核酸，具有操作简便、快速、特异性强、结果可肉眼判断等优点，具有很广阔的应用前景。发明内容：

[0004] 本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种特异性强、操作方便简单、无需昂贵的仪器设备的欧文氏弧菌的环介导等温扩增检测引物组、检测方法和检测试剂盒。

[0005] 本发明利用环介导等温扩增技术，以欧文氏弧菌的pryH基因(Genebank登录号为GU111253.1)为特异靶基因，设计、筛选并优化特异性引物，建立一种LAMP检测方法，并优化反应条件，在反应过程中添加阳性对照组和阴性对照组，并通过钙黄绿素显色法和凝胶电泳分析检测样品组和其他两组对照的扩增产物来判断样品中是否含有欧文氏弧菌，以达到方便简单，经济快速而且灵敏的检测效果，进而实现本发明的目的。

[0006] 本发明的第一个目的是提供欧文氏弧菌的环介导等温扩增检测引物组，所述的检测引物组如下所示：

[0007] 前外引物F3：5’-GCGTAGTAGGCGACCA-3’(如SEQ ID NO.1所示)；

[0008] 后外引物B3：5’-CATACAGCTCTGCGTCTG-3’(如SEQ ID NO.2所示)；

[0009] 前内引物FIP：5’-GCGGATAGCGTCTGCCCACTTCACCGTGCTTATGTA-3’(如SEQ ID NO.3所示)；

[0010] 后内引物BIP：5’-GCCAAGGCCGTGTAGTTATCTTGCTGCTGAATCTGTAGTGAA-3’(如SEQ ID NO.4所示)；

[0011] 前环引物LF：5’-CGGAATTGCAGACATTACGC-3’(如SEQ ID NO.5所示)；

[0012] 后环引物LB：5’-CTCTGCAGGTACTGGTAACC-3’(如SEQ ID NO.6所示)。

[0013] 本发明的第二个目的是提供欧文氏弧菌的环介导等温扩增检测试剂盒，包括环介导等温扩增反应液、Bst DNA聚合酶、MnCl2溶液、钙黄绿素显色液、阳性对照质控品、阴性对照质控品和检测引物组，所述的检测引物组如下所示：

[0014] 前外引物F3：5’-GCGTAGTAGGCGACCA-3’(如SEQ ID NO.1所示)；

[0015] 后外引物B3：5’-CATACAGCTCTGCGTCTG-3’(如SEQ ID NO.2所示)；

[0016] 前内引物FIP：5’-GCGGATAGCGTCTGCCCACTTCACCGTGCTTATGTA-3’(如SEQ ID NO.3所示)；

[0017] 后内引物BIP：5’-GCCAAGGCCGTGTAGTTATCTTGCTGCTGAATCTGTAGTGAA-3’(如SEQ ID NO.4所示)；

[0018] 前环引物LF：5’-CGGAATTGCAGACATTACGC-3’(如SEQ ID NO.5所示)；

[0019] 后环引物LB：5’-CTCTGCAGGTACTGGTAACC-3’(如SEQ ID NO.6所示)。

[0020] 所述的阳性对照质控品优选为含欧文氏弧菌的pryH基因(Genebank登录号为GU111253.1)的质粒DNA，可以通过人工合成或从欧文氏弧菌的基因组DNA扩增得到。

[0021] 所述的阴性对照质控品优选为不含欧文氏弧菌的pryH基因的DNA或超纯水。所述的不含欧文氏弧菌的pryH基因的DNA可以为其他细菌的pryH基因或超纯水。如裂珊瑚弧菌(Vibrio coralliilyticus)；罗尼氏弧菌(Vibrio shilonii)；溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)；弗尼斯弧菌(Vibrio furnissii)；河流弧菌(Vibrio fluvialis)；V.antiquarius；嗜气芽孢杆菌；荧光假单胞菌；金黄色葡萄球菌；超纯水。

[0022] 本发明的第三个目的是提供一种非疾病诊断和治疗目的的欧文氏弧菌的环介导等温扩增检测方法，包括以下步骤：

[0023] (1)对样品进行增菌培养获得增菌液，提取增菌液中的基因组DNA作为模板；

[0024] (2)使用上述的欧文氏弧菌的环介导等温扩增检测引物组，与环介导等温扩增反应液、Bst DNA聚合酶、MnCl2溶液、钙黄绿素显色液及样品基因组DNA混合形成环介导等温扩增反应体系，进行环介导等温扩增反应；

[0025] (3)扩增反应结束后，通过钙黄绿素荧光显色法和/或凝胶电泳分析检测样品中是否含有欧文氏弧菌。

[0026] 所述的通过钙黄绿素荧光显色法检测样品中是否含有欧文氏弧菌具体为：若扩增产物颜色为亮绿色，则样品中含有欧文氏弧菌；若扩增产物颜色保持橙黄色不变，则样品中不含有欧文氏弧菌。

[0027] 所述的通过凝胶电泳分析检测样品中是否含有欧文氏弧菌具体为：将扩增产物进行凝胶电泳，若有梯状条带，则样品中含有欧文氏弧菌；若无梯状条带，则样品中不含有欧文氏弧菌。

[0028] 优选，所述的环介导等温扩增反应体系总体积25μL，包括1×Isothermal Amp Buffer、6mmol/L MgSO4、1.4mmol/L dNTP Mix、1.6μmol/L FIP、1.6μmol/L BIP、0.2μmol/L F3、0.2μmol/L B3、0.4μmol/L LF、0.4μmol/L LB、320U/mL Bst 2.0DNA Polymerase、1.2mol/L甜菜碱、1mmol/L氯化锰、1mmol/L钙黄绿素2μL和基因组DNA模板1μL，余量为去离子水。

[0029] 所述的环介导等温扩增反应的反应条件优选为：65℃反应60min，80℃终止反应10min。

[0030] 本发明根据欧文氏弧菌(Vibrio owensii)的管家基因pyrH设计特异性引物组，具有很好的特异性，可用于检测欧文氏弧菌。本发明设计和筛选了一套特异性检测引物组以及含有该引物组的检测试剂盒和使用该检测试剂盒通过环介导等温扩增的检测方法，进而确定检测的样品中是否存在欧文氏弧菌。本发明的检测引物组，检测试剂盒和检测方法具特异性强，操作方便简单，检测时间短，无需昂贵的仪器设备等优点，特别适合野外基层的现场检测，具有广阔的应用前景。附图说明：

[0031] 图1是纯菌特异性实验中LAMP扩增产物的显色分析结果图；1.含欧文氏弧菌的pyrH基因的重组质粒；2.欧文氏弧菌(Vibrio owensii)；3.裂珊瑚弧菌(Vibrio coralliilyticus)；4.罗尼氏弧菌(Vibrio  shilonii)；5.溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)；6.弗尼斯弧菌(Vibrio furnissii)；7.河流弧菌(Vibrio fluvialis)；8.Vibrio antiquarius；9.嗜气芽孢杆菌；10.荧光假单胞菌；11.金黄色葡萄球菌；12.超纯水；其中1,2为亮绿色，3～12为橙黄色。

[0032] 图2是纯菌特异性实验中LAMP扩增产物的凝胶电泳结果图；M.标准分子量DL2000；1.含欧文氏弧菌的pyrH基因的重组质粒；2.欧文氏弧菌(Vibrio owensii)；3.裂珊瑚弧菌(Vibrio coralliilyticus)；4.罗尼氏弧菌(Vibrio shilonii)；5.溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)；6.弗尼斯弧菌(Vibrio furnissii)；7.河流弧菌(Vibrio fluvialis)；
8.V.antiquarius；9.嗜气芽孢杆菌；10.荧光假单胞菌；11.金黄色葡萄球菌；12.超纯水。

[0033] 图3是重组质粒pClone007-pyrH灵敏性实验中LAMP扩增产物的显色分析结果图；1～12.6.19×1011～6.19×100；N.超纯水。

[0034] 图4是是重组质粒pClone007-pyrH灵敏性实验中LAMP扩增产物的凝胶电泳结果图；M.标准分子量DL2000；1～12.6.19×1011～2.6.19×100；N.超纯水。具体实施方式：

[0035] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

[0036] 实施例1：引物的设计与合成

[0037] 根据环介导等温扩增引物的设计原则，在NCBI Genebank数据库中查找欧文氏弧菌(Vibrio owensii)适用于环介导等温扩增的靶基因序列，最终选择特异性较强的pyrH基因(Genebnak登录号为GU111253.1)为靶基因。根据欧文氏弧菌pyrH基因特异性区域，依照环介导等温扩增引物设计原则，利用LAMP引物设计软件Primer Designer设计6套引物，并筛选出一组特异性最佳的引物组。

[0038] 由此设计的欧文氏弧菌的环介导等温扩增检测引物为：

[0039] 前外引物F3：5’-GCGTAGTAGGCGACCA-3’(如SEQ ID NO.1所示)；

[0040] 后外引物B3：5’-CATACAGCTCTGCGTCTG-3’(如SEQ ID NO.2所示)；

[0041] 前内引物FIP：5’-GCGGATAGCGTCTGCCCACTTCACCGTGCTTATGTA-3’(如SEQ ID NO.3所示)；

[0042] 后内引物BIP：5’-GCCAAGGCCGTGTAGTTATCTTGCTGCTGAATCTGTAGTGAA-3’(如SEQ ID NO.4所示)；

[0043] 前环引物LF：5’-CGGAATTGCAGACATTACGC-3’(如SEQ ID NO.5所示)；

[0044] 后环引物LB：5’-CTCTGCAGGTACTGGTAACC-3’(如SEQ ID NO.6所示)。

[0045] 实施例2：核酸提取

[0046] 将欧文氏弧菌(Vibrio owensii)以及裂珊瑚弧菌(Vibrio coralliilyticus)、罗尼氏弧菌(Vibrio shilonii)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、弗尼斯弧菌(Vibrio furnissii)、河流弧菌(Vibrio fluvialis)和V.antiquarius分别接菌到含1.5％NaCl的TSB液体培养基中，30℃过夜培养；将嗜气芽孢杆菌，荧光假单胞菌和金黄色葡萄球菌分别接菌到LB液体培养基中，37℃过夜培养。吸取1mL菌液，12000rpm离心2min，去掉上清，再加入100μL无菌去离子水重悬，置于100℃金属浴10min，再冰浴2min，12000rpm离心2min，此时的上清液即为含该菌基因组DNA的DNA液，可作为LAMP扩增反应的模板。

[0047] 实施例3：pyrH重组质粒的构建

[0048] 人工构建的含欧文氏弧菌的pyrH基因的重组质粒DNA的制备方法为：使用pClone007 simple vector作为载体，以欧文氏弧菌的pyrH基因为DNA目的片段，通过连接酶的催化，将pyrH目标片段连接到pClone007 simple vector上，构建重组质粒pClone007-pyrH，并转化到E.coli DH5α感受态细胞中，经100mg/mL氨苄青霉素筛选出阳性克隆，用质粒试剂盒提取重组质粒，最后经PCR检测并送测序，检测重组质粒是否构建成功。

[0049] 实施例4：LAMP方法的特异性

[0050] 样品的环介导等温扩增反应体系为25μL，包括：1×Isothermal Amp Buffer(反应体系终浓度)、6mmol/L MgSO4(反应体系终浓度)、1.4mmol/L dNTP Mix(反应体系终浓度)、1.6μmol/L FIP(反应体系终浓度)、1.6μmol/L BIP(反应体系终浓度)、0.2μmol/L F3(反应体系终浓度)、0.2μmol/L B3(反应体系终浓度)、0.4μmol/L LF(反应体系终浓度)、0.4μmol/L LB(反应体系终浓度)、320U/mL Bst 2.0DNA Polymerase(反应体系终浓度)、
1.2mol/L甜菜碱(反应体系终浓度)、1mmol/L氯化锰(反应体系终浓度)、1mol/L钙黄绿素2μL和细菌模板DNA(分别为实施例2获得的各细菌基因组DNA)1μL，去离子水补齐至25μL。

[0051] 阳性对照质控品的环介导等温扩增体系为25μL，包括：1×Isothermal Amp Buffer(反应体系终浓度)、6mmol/L MgSO4(反应体系终浓度)、1.4mmol/L dNTP Mix(反应体系终浓度)、1.6μmol/L FIP(反应体系终浓度)、1.6μmol/L BIP(反应体系终浓度)、0.2μmol/L F3(反应体系终浓度)、0.2μmol/L B3(反应体系终浓度)、0.4μmol/L LF反应体系终浓度)、0.4μmol/L LB(反应体系终浓度)、320U/mL Bst 2.0DNA Polymerase(反应体系终浓度)、1.2mol/L甜菜碱(反应体系终浓度)、1mmol/L氯化锰(反应体系终浓度)、1mol/L钙黄绿素2μL和人工构建的含欧文氏弧菌的pyrH基因的质粒DNA 1μL，去离子水补齐至25μL。

[0052] 阴性对照质控品的环介导等温扩增反应体系为25μL，包括：1×Isothermal Amp Buffer(反应体系终浓度)、6mmol/L MgSO4(反应体系终浓度)、1.4mmol/L dNTP Mix(反应体系终浓度)、1.6μmol/L FIP(反应体系终浓度)、1.6μmol/L BIP(反应体系终浓度)、0.2μmol/L F3(反应体系终浓度)、0.2μmol/L B3(反应体系终浓度)、0.4μmol/L LF(反应体系终浓度)、0.4μmol/L LB(反应体系终浓度)、320U/mL Bst 2.0DNA Polymerase(反应体系终浓度)、1.2mol/L甜菜碱(反应体系终浓度)、1mmol/L氯化锰(反应体系终浓度)、1mol/L钙黄绿素2μL和非欧文氏弧菌的其他细菌的基因组DNA 1μL，去离子水补齐至25μL。

[0053] 分别将上述3种环介导等温扩增体系混合均匀后，放入恒温水浴箱中，反应条件为65℃，60min；终止反应为80℃，10min。

[0054] 在反应体系中添加了MnCl2溶液和钙黄绿素显色液，在反应结束后，观察反应产物颜色是否发生变化，如颜色呈亮绿色，为阳性；颜色呈橙色，为阴性。如图1所示，钙黄绿素荧光显色法检测结果显示：欧文氏弧菌(Vibrio owensii)和阳性对照质控品pryH重组质粒DNA扩增产物呈亮绿色，为阳性；而裂珊瑚弧菌(Vibrio coralliilyticus)、罗尼氏弧菌(Vibrio shilonii)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、弗尼斯弧菌(Vibrio furnissii)、河流弧菌(Vibrio fluvialis)和Vibrio antiquarius以及嗜气芽孢杆菌、荧光假单胞菌和金黄色葡萄球菌以及超纯水等的扩增反应产物呈橙黄色，为阴性。

[0055] 环介导等温扩增反应结束后，取4.5μL的扩增产物与2μL的6×Lodding buffer混合后，点样于1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，130V通电35min，如图2所示，电泳分析检测结果显示，欧文氏弧菌(Vibrio owensii)和阳性对照质控品pryH重组质粒DNA的扩增产物，电泳条带呈特异性梯状条带(阳性)；而裂珊瑚弧菌(Vibrio coralliilyticus)、罗尼氏弧菌(Vibrio shilonii)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、弗尼斯弧菌(Vibrio furnissii)、河流弧菌(Vibrio fluvialis)和Vibrio antiquarius以及嗜气芽孢杆菌、荧光假单胞菌和金黄色葡萄球菌以及超纯水的扩增产物，其电泳结果无特异性条带(阴性)。这表明本发明的欧文氏弧菌的环介导等温扩增检测引物具有极高的专一性，特异性强，因此可以用于快速的检测样品中是否含有欧文氏弧菌。

[0056] 实施例5：LAMP方法的灵敏度

[0057] 根据实施例3构建好的pryH重组质粒DNA，经检测，质粒浓度为152ng/μL。根据质粒长度，浓度以及特定公式计算，质粒的拷贝数为6.19×1013copies/mL。取10μL的质粒DNA，用超纯水进行10倍梯度稀释，由此分别得到各稀释浓度的质粒DNA，并以此作为LAMP灵敏度检测的DNA模板。

[0058] LAMP灵敏度检测的环介导等温扩增反应体系为25μL，包括：1×Isothermal Amp Buffer(反应体系终浓度)、6mmol/L MgSO4(反应体系终浓度)、1.4mmol/L dNTP Mix(反应体系终浓度)、1.6μmol/L FIP(反应体系终浓度)、1.6μmol/L BIP(反应体系终浓度)、0.2μmol/L F3(反应体系终浓度)、0.2μmol/L B3(反应体系终浓度)、0.4μmol/L LF(反应体系终浓度)、0.4μmol/L LB(反应体系终浓度)、320U/mL Bst 2.0DNA Polymerase(反应体系终浓度)、1.2mol/L甜菜碱(反应体系终浓度)、1mmol/L氯化锰(反应体系终浓度)、1mol/L钙黄绿素2μL以及各稀释浓度的质粒DNA 2μL，去离子水补齐至25μL。LAMP扩增体系混合均匀后，放入恒温水浴箱中，反应条件为65℃，60min；终止反应为80℃，10min。

[0059] 结果如图3和图4所示，本发明的环介导等温扩增检测方法的灵敏度为：6.19×103copies/mL。钙黄绿素荧光显色法检测结果为6.19×1011～6.19×103copies/mL为亮绿色(阳性)，6.19×103～6.19×100copies/mL为橙黄色(阴性)，N为超纯水，为橙黄色(阴性)；
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1.5％凝胶电泳结果为6.19×10 ～6.19×10copies/mL有特异性条带(阳性)，6.19×10～6.19×100copies/mL无特异性条带(阴性)，N为超纯水，无特异性条带(阴性)；荧光显色法检测结果(图3)与凝胶电泳结果(图4)相一致，由此说明，本发明的环介导等温扩增检测方法的灵敏度为6.19×103copies/mL。

[0060] 钙黄绿素荧光显色法与凝胶电泳分析检测结果一致，证明此方法数据可靠。可以直接通过扩增产物颜色判断样品中是否含有欧文氏弧菌，极大地缩短了检测时间。

[0061] 综上所述，本发明的欧文氏弧菌的环介导等温扩增检测引物组及检测方法不仅可以快速、简便、灵敏地检测到欧文氏弧菌，而且特异性强，准确性高。