特异性地识别、结合活性结构的REIC/Dkk-3蛋白的抗体、以及使用该抗REIC/Dkk-3抗体的癌治疗的监测转让专利
申请号 : CN201680056079.7
文献号 : CN108139404B
文献日 : 2022-03-18
发明人 : 公文裕巳 , 木下理惠 , 二见淳一郎
申请人 : 国立大学法人冈山大学 , 桃太郎源株式会社
摘要 :
权利要求 :
1.N‑1抗体或其功能性片段以及Cys‑3抗体在制备用于前列腺癌的检测的试剂盒中的用途,所述N‑1抗体或其功能性片段以及Cys‑3抗体用于测定由被测体采集的生物试样中的REIC/Dkk‑3蛋白浓度,在被测体的生物试样中的REIC/Dkk‑3蛋白的浓度低于正常人的生物试样中的REIC/Dkk‑3蛋白浓度的情况下,判断该被测体罹患前列腺癌,该N‑1抗体是以保藏号NITE BP‑02103进行了国际保藏的杂交瘤所产生的单克隆抗体,其作为第1抗体,特异性地识别正常细胞产生的具有活性结构的REIC/Dkk‑3蛋白,但不识别和不结合在前列腺癌患者血中大量存在的REIC/Dkk‑3蛋白,或者对在前列腺癌患者血中大量存在的REIC/Dkk‑3蛋白的反应性低,并且识别全长REIC/Dkk‑3蛋白的[Ala22‑Thr134]部分区域,该Cys‑3抗体是以保藏号NITE BP‑02104进行了国际保藏的杂交瘤所产生的单克隆抗体,其作为第2抗体,识别REIC/Dkk‑3蛋白的富含半胱氨酸的结构域。
2.如权利要求1所述的用途,其中,使用作为第2抗体的Cys‑3抗体或其功能性片段,测定由被测体采集的生物试样中的REIC/Dkk‑3蛋白浓度,计算出使用作为第1抗体的N‑1抗体或其功能性片段得到的测定值相对于使用第2抗体或其功能性片段得到的测定值之比,在该比低于使用正常人的生物试样得到的比的情况下,判断该被测体罹患前列腺癌,该第2抗体特异性地识别正常细胞产生的具有活性结构的REIC/Dkk‑3蛋白和在前列腺癌患者血中大量存在的REIC/Dkk‑3蛋白。
3.N‑1抗体或其功能性片段在制备用于前列腺癌治疗的监测的试剂盒中的用途,所述N‑1抗体或其功能性片段用于测定由接受前列腺癌治疗的前列腺癌患者经时地采集的生物试样中的REIC/Dkk‑3蛋白浓度,在REIC/Dkk‑3蛋白的浓度上升的情况下,判定具有前列腺癌治疗作用或效果,该N‑1抗体是以保藏号NITE BP‑02103进行了国际保藏的杂交瘤所产生的单克隆抗体,其作为第1抗体,特异性地识别正常细胞产生的具有活性结构的REIC/Dkk‑3蛋白,但不识别和不结合在前列腺癌患者血中大量存在的REIC/Dkk‑3蛋白,或者对在前列腺癌患者血中大量存在的REIC/Dkk‑3蛋白的反应性低,并且识别全长REIC/Dkk‑3蛋白的[Ala22‑Thr134]部分区域。
4.如权利要求3所述的用途,其中,进一步使用Cys‑3抗体或其功能性片段,测定由被测体经时地采集的生物试样中的REIC/Dkk‑3蛋白浓度,该Cys‑3抗体是以保藏号NITE BP‑
02104进行了国际保藏的杂交瘤所产生的单克隆抗体,其作为第2抗体,识别REIC/Dkk‑3蛋白的富含半胱氨酸的结构;计算出使用第1抗体得到的测定值相对于使用第2抗体得到的测定值之比,在该比上升的情况下,判定具有前列腺癌治疗作用或效果,该第2抗体特异性地识别正常细胞产生的具有活性结构的REIC/Dkk‑3蛋白和在前列腺癌患者血中大量存在的REIC/Dkk‑3蛋白。
5.如权利要求3或4所述的用途,其中,经时地采集的生物试样包含在前列腺癌治疗前、前列腺癌治疗中和前列腺癌治疗后采集的生物试样。
6.如权利要求3或4所述的用途,其中,前列腺癌治疗是使用REIC/Dkk‑3基因、REIC/Dkk‑3片段基因、REIC/Dkk‑3蛋白或REIC/Dkk‑3片段肽的治疗。
7.用于在权利要求1或2所述的用途或权利要求4~6中任一项所述的用途中使用的检查试剂盒,其包含N‑1抗体和Cys‑3抗体,该N‑1抗体为以保藏号NITE BP‑02103进行了国际保藏的杂交瘤所产生的单克隆抗体,该N‑1抗体特异性地识别正常细胞产生的具有活性结构的REIC/Dkk‑3蛋白,但不识别和不结合在前列腺癌患者血中大量存在的REIC/Dkk‑3蛋白、或者对在前列腺癌患者血中大量存在的REIC/Dkk‑3蛋白的反应性低;该Cys‑3抗体为以保藏号NITE BP‑02104进行了国际保藏的杂交瘤所产生的单克隆抗体,该Cys‑3抗体特异性地识别正常细胞产生的具有活性结构的REIC/Dkk‑3蛋白和在前列腺癌患者血中大量存在的REIC/Dkk‑3蛋白。
说明书 :
特异性地识别、结合活性结构的REIC/Dkk‑3蛋白的抗体、以及
使用该抗REIC/Dkk‑3抗体的癌治疗的监测
技术领域
断的抗REIC/Dkk‑3特异性抗体、以及使用这些特异性抗体的检查方法。具体而言,涉及能够
特异性识别REIC/Dkk‑3的活性结构的抗REIC/Dkk‑3抗体和利用这些抗体的诊断方法。
背景技术
多方面的作用(参见非专利文献5和7)。
发明内容
法;进而目的在于提供以REIC/Dkk‑3蛋白为肿瘤标记物的癌的预测和预后的诊断方法。
蛋白同等或更高。这表明REIC/Dkk‑3蛋白的特定部分区域担负着由单核细胞向树突细胞样
细胞的分化诱导能力,使癌免疫活化,能够用于癌的治疗和预防(国际公开第WO2012/
002582号)。
物标记物的利用进行了研究。
进行癌治疗的监测以及癌的预测和预后的诊断,能够将上述特定的REIC/Dkk‑3蛋白分子种
作为用于癌治疗的监测以及癌的预测和预后的诊断的生物标记物来利用。
定的REIC/Dkk‑3蛋白分子种具有特异性结合性的抗体,利用该抗体的夹心ELISA法能够作
为上述用于癌治疗的监测、以及癌的预测和预后诊断的检测系统来利用,从而完成了本发
明。
于正常人的生物试样中的REIC/Dkk‑3蛋白浓度的情况下,判断该被测体罹患癌前病变或肿
瘤性疾病,该第1抗体特异性地识别正常细胞产生的具有活性结构的REIC/Dkk‑3蛋白,但不
识别、不结合在癌患者血中大量存在的REIC/Dkk‑3蛋白,或者对在癌患者血中大量存在的
REIC/Dkk‑3蛋白的反应性低。
得到的测定值相对于使用第2抗体或其功能性片段得到的测定值之比,在该比低于使用正
常人的生物试样得到的比的情况下,判断该被测体罹患癌前病变或肿瘤性疾病,该第2抗体
特异性地识别正常细胞产生的具有活性结构的REIC/Dkk‑3蛋白和在癌患者血中大量存在
的REIC/Dkk‑3蛋白。
者对在癌患者血中大量存在的REIC/Dkk‑3蛋白的反应性低的第1抗体是特异性地识别
REIC/Dkk‑3蛋白的N端结构域的抗体。
REIC/Dkk‑3蛋白的富含半胱氨酸的结构域的抗体。
3蛋白、或者对在癌患者血中大量存在的REIC/Dkk‑3蛋白的反应性低的第1抗体为N‑1抗体,
其是识别以保藏号NITE BP‑02103进行了国际保藏的杂交瘤所产生的REIC/Dkk‑3蛋白的N
端结构域的单克隆抗体;特异性地识别正常细胞产生的具有活性结构的REIC/Dkk‑3蛋白和
在癌患者血中大量存在的REIC/Dkk‑3蛋白的第2抗体为Cys‑3抗体,其是识别以保藏号NITE
BP‑02104进行了国际保藏的杂交瘤所产生的REIC/Dkk‑3蛋白的富含半胱氨酸的结构域的
单克隆抗体。
上升的情况下,判定具有癌治疗作用或效果,该第1抗体特异性地识别正常细胞产生的具有
活性结构的REIC/Dkk‑3蛋白,但不识别、不结合在癌患者血中大量存在的REIC/Dkk‑3蛋白,
或者对在癌患者血中大量存在的REIC/Dkk‑3蛋白的反应性低。
相对于使用第2抗体得到的测定值之比,在该比上升的情况下,判定具有癌治疗作用或效
果,该第2抗体特异性地识别正常细胞产生的具有活性结构的REIC/Dkk‑3蛋白和在癌患者
血中大量存在的REIC/Dkk‑3蛋白。
蛋白、或者对在癌患者血中大量存在的REIC/Dkk‑3蛋白的反应性低的第1抗体是特异性地
识别REIC/Dkk‑3蛋白的N端结构域的抗体。
识别REIC/Dkk‑3蛋白的富含半胱氨酸的结构域的抗体。
蛋白、或者对在癌患者血中大量存在的REIC/Dkk‑3蛋白的反应性低的第1抗体为N‑1抗体,
其是识别以保藏号NITE BP‑02103进行了国际保藏的杂交瘤所产生的REIC/Dkk‑3蛋白的N
端结构域的单克隆抗体;特异性地识别正常细胞产生的具有活性结构的REIC/Dkk‑3蛋白和
在癌患者血中大量存在的REIC/Dkk‑3蛋白的第2抗体为Cys‑3抗体,其是识别以保藏号NITE
BP‑02104进行了国际保藏的杂交瘤所产生的REIC/Dkk‑3蛋白的富含半胱氨酸的结构域的
单克隆抗体。
酸的结构域的抗体、或者识别REIC/Dkk‑3蛋白的C端结构域的抗体、或它们的功能性片段。
或者对在癌患者血中大量存在的REIC/Dkk‑3蛋白的反应性低,该杂交瘤以保藏号NITE BP‑
02103进行了国际保藏。
保藏号NITE BP‑02104进行了国际保藏。
体和识别REIC/Dkk‑3蛋白的富含半胱氨酸的结构域的抗体或识别REIC/Dkk‑3蛋白的C端结
构域的抗体。
测出的REIC/Dkk‑3蛋白是对于癌的预测和预后的诊断有用的生物标记物,还能够作为伴随
诊断法有效利用。
附图说明
据与全长REIC/Dkk‑3蛋白、REIC部分区域3和REIC部分区域1[Arg142‑Ile350](参见专利文
献3)的反应性进行筛选,将确定了识别区域的12种抗REIC/Dkk‑3单克隆抗体的与抗原的反
应模式以蛋白的种类和识别的区域示出的图。
125、250、500、1000、2000pg/mL这8种浓度的REIC/Dkk‑3蛋白标准品(重组型REIC/Dkk‑3蛋
白)制成的标准曲线的图。
第1、2、7、14天(即将第2次治疗之前)、第15、17、21、28天、第56天(即将手术之前)、第84天的
血清试样实施测定。对于患者A(图3‑1A)和患者B(图3‑1B),示出将识别REIC/Dkk‑3蛋白的N
端结构域的N‑1抗体作为捕获抗体所测定的数据。
第1、2、7、14天(即将第2次治疗之前)、第15、17、21、28天、第56天(即将手术之前)、第84天的
血清试样实施测定。对于患者A(图3‑2A)和患者B(图3‑2B),示出将识别富含半胱氨酸的结
构域的抗体Cys‑3作为捕获抗体所测定的数据。
图中判断,也能够以利用这两种抗体所测定的浓度之比为指标进行治疗的监测。
夹心ELISA法,对于前列腺癌患者、正常人、外科手术后各5人的血清中的REIC/Dkk‑3蛋白浓
度使用夹心ELISA法所测定的结果的图。图中表明,利用两种捕获抗体所测定的REIC/Dkk‑3
蛋白的浓度之比能够作为癌的预测、预后的诊断有效利用。
与检测抗体不同的抗体,以100ng/mL、10ng/mL的浓度添加纯化的REIC/Dkk‑3蛋白,使用亲
和素‑HRP作为与检测抗体反应的作用性复合体。将作为REIC/Dkk‑3蛋白与各种抗体的结合
量的指标的HRP活性以吸光度450nm的测定值示出。
具体实施方式
量存在的REIC/Dkk‑3蛋白的反应性低的抗体。
基酸构成的序列为信号序列。
表示的氨基酸序列中的第142位的氨基酸至第288位的氨基酸构成的区域)和C端结构域(由
序列号2所表示的氨基酸序列中的第289位的氨基酸至第350位的氨基酸构成的区域)。
白酶或与REIC/Dkk‑3蛋白结合的蛋白等)所致的N端结构域分解、其它物质向N端结构域的
结合等、或N端结构域的糖基化模式的变化等修饰而使N端结构域的结构存在异常。即,在癌
患者血中大量存在的REIC/Dkk‑3蛋白是由于罹患癌而变得具有与正常细胞产生分泌的
REIC/Dkk‑3蛋白不同的结构的REIC/Dkk‑3蛋白。另外,在癌患者血中大量存在的REIC/Dkk‑
3蛋白也可以说是在癌细胞存在的情况下变得具有与正常细胞产生分泌的REIC/Dkk‑3蛋白
不同的结构的REIC/Dkk‑3蛋白。另一方面,正常人的正常细胞产生的REIC/Dkk‑3蛋白的N端
结构域的结构不存在异常。本发明中,将正常人的正常细胞产生的N端结构域的结构不存在
异常的REIC/Dkk‑3蛋白称为具有活性结构的REIC/Dkk‑3蛋白。因此,特异性地识别、结合正
常细胞产生的具有活性结构的REIC/Dkk‑3蛋白、但不识别、不结合在癌患者血中大量存在
的REIC/Dkk‑3蛋白、或者对在癌患者血中大量存在的REIC/Dkk‑3蛋白的反应性低的抗体是
识别正常细胞产生的具有活性结构的REIC/Dkk‑3蛋白的N端结构域的抗体。即,识别正常细
胞产生的活性结构的REIC/Dkk‑3蛋白的N端结构域的抗体是对在癌患者血中大量存在的
REIC/Dkk‑3蛋白分子种的反应性低、并且能够识别血中的具有活性结构的特定的REIC/
Dkk‑3蛋白分子种的抗体,是能够识别癌患者血清特有的REIC/Dkk‑3蛋白分子的结构与正
常人血清的REIC/Dkk‑3蛋白分子的结构的差异的抗体。如后所述,作为抗REIC/Dkk‑3蛋白
单克隆抗体的N‑1抗体特异性地识别、结合正常细胞产生的具有活性结构的REIC/Dkk‑3蛋
白,但不识别、不结合在癌患者血中大量存在的REIC/Dkk‑3蛋白,或者对在癌患者血中大量
存在的REIC/Dkk‑3蛋白的反应性低。因此,也将在癌患者血中大量存在的REIC/Dkk‑3蛋白
称为与N‑1抗体的反应性降低的REIC/Dkk‑3蛋白。
REIC/Dkk‑3蛋白、但不识别、不结合在癌患者血中大量存在的REIC/Dkk‑3蛋白、或者对在癌
患者血中大量存在的REIC/Dkk‑3蛋白的反应性低的抗体与特异性地识别正常细胞产生的
具有活性结构的REIC/Dkk‑3蛋白和在癌患者血中大量存在的REIC/Dkk‑3蛋白的抗体适当
组合使用。特异性地识别、结合正常细胞产生的具有活性结构的REIC/Dkk‑3蛋白、但不识
别、不结合在癌患者血中大量存在的REIC/Dkk‑3蛋白、或者对在癌患者血中大量存在的
REIC/Dkk‑3蛋白的反应性低的抗体是识别REIC/Dkk‑3的N端结构域的抗体,有时也称为第1
抗体。另外,特异性地识别正常细胞产生的具有活性结构的REIC/Dkk‑3蛋白和在癌患者血
中大量存在的REIC/Dkk‑3蛋白的抗体是识别富含半胱氨酸的结构域的抗体或识别C端结构
域的抗体,有时也称为第2抗体。
位的Phe构成的氨基酸序列所构成的、包含富含半胱氨酸的结构域的部分区域称为REIC部
分区域3[Ser135‑Phe288],将由第142位的Arg至第350位的Ile构成的氨基酸序列所构成的
部分区域称为REIC部分区域1[Arg142‑Ile350](国际公开第WO2012/002582号)。
Phe288]等REIC/Dkk‑3蛋白的片段作为免疫原。作为免疫原的全长REIC/Dkk‑3蛋白使用具
有活性结构的REIC/Dkk‑3蛋白、即重组型(recombinant)REIC/Dkk‑3蛋白或正常细胞产生
的REIC/Dkk‑3蛋白即可。所得到的抗体可以根据与全长REIC/Dkk‑3蛋白、REIC部分区域3
[Ser135‑Phe288]和REIC部分区域1[Arg142‑Ile350]的反应性来确定识别区域。识别N端结
构域的抗体是指与全长REIC/Dkk‑3蛋白反应、但不与REIC部分区域3和REIC部分区域1反应
的抗体,识别C端结构域的抗体是指与全长REIC/Dkk‑3蛋白和REIC部分区域1反应、但不与
REIC部分区域3反应的抗体,识别富含半胱氨酸的结构域的抗体是指识别N端结构域的抗体
和识别C端结构域的抗体以外的抗体,是与全长REIC/Dkk‑3蛋白、REIC部分区域1和REIC部
分区域3反应的抗体。即,识别N端结构域的抗体是指识别[Ala22‑Thr134]部分区域的抗体,
识别C端结构域的抗体是指识别[Val289‑Ile350]部分区域的抗体,识别富含半胱氨酸的结
构域的抗体是指识别[Ser142‑Phe288]部分区域的抗体。
段。本发明中,优选使用单克隆抗体。按照本发明的方法有用的抗体可以通过现有方法和/
或基因工程学进行制作。
段、双抗体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体等。另外,这些抗体片段的多
聚体也包含在本发明的抗体的功能性片段中。Fab是用蛋白分解酶木瓜蛋白酶处理抗体而
得到的片段,是H链的氨基末端侧约一半与L链整体以二硫键结合而成的分子量约5万的对
抗原具有结合活性的抗体片段。F(ab’)2是用蛋白分解酶胃蛋白酶处理IgG而得到的片段之
中Fab藉由铰链区的二硫键结合而成的分子量约10万的抗体片段。Fab’是将上述F(ab’)2的
铰链区的二硫键切断而成的分子量约5万的抗体片段。作为Fv片段之一的scFv是藉由肽接
头将1个重链可变区(VH)与1个轻链可变区(VL)连结而成的抗体片段。双抗体是使scFv二聚
化而成的抗体片段,是具有2价抗原结合活性的抗体片段。
造。
是高度特异性的,以单一的抗原部位作为结合对象。此外,与包含以典型不同的抗原决定簇
(表位)为对象的不同抗体的现有(多克隆)抗体制备物形成对照,各单克隆抗体以其抗原上
的单一决定簇为对象。按照本发明来使用的单克隆抗体例如通过杂交瘤法或重组DNA法进
行制备,此外例如也可以由噬菌体抗体库分离制备。
该链的其余部分与来源于其它种的抗体或者属于其它抗体类或亚类的抗体中的对应序列
相同或同源),进而也包含上述抗体的功能性片段,只要这些片段显示出所期望的生物活
性。
体,用于例如临床试样等在各种临床试验中采集的样本中的REIC/Dkk‑3蛋白的鉴定、定量。
用的酶的例子,可以举出辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、β‑半乳糖苷酶等,另外可以举
出生物素标记等。
的REIC/Dkk‑3蛋白、或者对在癌患者血中大量存在的REIC/Dkk‑3蛋白的反应性低的单克隆
抗体),可以例示N‑1抗体和N‑2抗体。另外,作为识别REIC/Dkk‑3蛋白的富含半胱氨酸的结
构域的单克隆抗体(其为特异性地识别正常细胞产生的具有活性结构的REIC/Dkk‑3蛋白和
在癌患者血中大量存在的REIC/Dkk‑3蛋白的单克隆抗体),可以例示Cys‑1抗体、Cys‑2抗
体、Cys‑3抗体、Cys‑4抗体、Cys‑5抗体、Cys‑6抗体、Cys‑7抗体和Cys‑8抗体。此外,作为识别
REIC/Dkk‑3蛋白的C端结构域的单克隆抗体,可以例示C‑1抗体和C‑2抗体。
0818千叶县木更津市上总镰足2‑5‑8 122号室)以保藏号NITE BP‑02103(“识别的表示”为
“REIC‑N‑1”)进行了国际保藏,产生Cys‑3抗体的杂交瘤于2015年8月19日在独立行政法人
国家技术评估学会(NITE)专利微生物保藏中心(NITE Patent Microorganisms
Depository)(日本〒292‑0818千叶县木更津市上总镰足2‑5‑8 122号室)以保藏号NITE
BP‑02104(“识别的表示”为“REIC‑Cys‑3”)进行了国际保藏。
的REIC/Dkk‑3治疗的监测、还可应对基于担负抗癌免疫活性的片段肽的REIC/Dkk‑3治疗的
监测的诊断方法。
端结构域的抗体组合来测定REIC/Dkk‑3蛋白,并以其测定值的比例作为指标来进行诊断,
能够提供排除了以产生个体差异的浓度为指标的诊断中的误诊的诊断方法。
液、胸腔渗出液、脑脊液、腹水、胸水、羊水、膀胱冲洗液和支气管肺泡灌洗液等。其中,优选
血液、血清和血浆。来自被测体的试样可以为新鲜的或冷冻的,也可以用肝素、柠檬酸或
EDTA进行处理。
附测定))、放射线免疫测定法(RIA)、双抗体夹心法、凝集反应法、荧光免疫测定法、免疫层
析法等本领域技术人员已知的定量免疫测定方法进行。优选利用夹心ELISA等使用捕获抗
体和经标记的检测抗体的夹心测定法进行。
等。
单克隆抗体被固定于微板孔上。将稀释后的人血清/血浆试样中的REIC/Dkk‑3蛋白、或
REIC/Dkk‑3标准抗原(重组野生型REIC/Dkk‑3蛋白)在孔内进行温育,利用捕获单克隆抗体
使REIC/Dkk‑3抗原结合。对孔进行清洗后,在藉由捕获抗体而被固定的REIC/Dkk‑3抗原中
添加经生物素标记的检测抗体,之后再次对孔进行清洗。接着,加入亲和素‑辣根过氧化物
酶复合体。在最终清洗后,向孔中加入TMB底物(TMB substrate),检测出所结合的过氧化物
酶活性。加入2N硫酸使反应停止,在450nm测定吸收。根据含有REIC/Dkk‑3蛋白的试样的吸
收值的相关性,能够决定血清或血浆等试样中的REIC/Dkk‑3蛋白浓度。作为捕获抗体,可以
使用特异性地识别REIC/Dkk‑3蛋白的N端结构域的单克隆抗体、优选N‑1抗体、或者识别
REIC/Dkk‑3蛋白的富含半胱氨酸的结构域的单克隆抗体、优选Cys‑3抗体。作为检测抗体,
可以使用针对REIC/Dkk‑3蛋白的单克隆抗体,也可以使用以重组型REIC/Dkk‑3蛋白或正常
细胞产生的REIC/Dkk‑3蛋白作为免疫原而制作的多克隆抗体。从不产生批次间的反应性差
异的方面出发,优选单克隆抗体。
白的对照试样,对于该对照试样也同时进行测定,制成校正曲线。可以由所测定的测定值和
校正曲线对被测试样中的REIC/Dkk‑3蛋白的量进行定量。
Dkk‑3的治疗称为REIC/Dkk‑3治疗。
捉被测体中的经时的血中REIC/Dkk‑3蛋白的动态变化、即具有活性结构的REIC/Dkk‑3蛋白
和在癌患者血中大量存在的REIC/Dkk‑3蛋白的浓度的变化。血中的经时的REIC/Dkk‑3蛋白
的动态变化反映出癌患者的癌的状态的变化,能够进行癌的状态的监测。另外,例如在使用
REIC/Dkk‑3基因制剂的治疗中,REIC/Dkk‑3蛋白的浓度上升表明作为治疗有效成分的
REIC/Dkk‑3蛋白在癌细胞中进行了表达,表明REIC/Dkk‑3蛋白在癌细胞中的表达具有治疗
作用。即,通过REIC/Dkk‑3蛋白的动态变化的监测,能够进行癌治疗的监测。此外,在被测体
罹患癌的情况下,能够进行预后的预测。此处,癌的检测包括是否罹患癌(包括癌前病变状
态)的判定、是否具有罹患癌的风险的预测、癌的恶性程度(分期、强度)的判定等。癌治疗的
监测是指对癌患者进行癌治疗时的癌治疗作用或癌治疗效果的监测。
癌、肾盂输尿管癌、膀胱癌、前列腺癌、尿道癌、阴茎癌、睾丸癌、骨/骨肉瘤、平滑肌瘤、横纹
肌瘤、间皮瘤和引起上述癌的癌前病变。
的治疗。
存在的REIC/Dkk‑3蛋白区别地进行测定。
REIC/Dkk‑3蛋白、或者对在癌患者血中大量存在的REIC/Dkk‑3蛋白的反应性低的抗体,测
定来自被测体的试样中的REIC/Dkk‑3蛋白。在被测体罹患癌的情况下,试样中具有活性结
构的REIC/Dkk‑3蛋白减少。特异性地识别N端结构域、特异性地识别、结合正常细胞产生的
具有活性结构的REIC/Dkk‑3蛋白、但不识别、不结合在癌患者血中大量存在的REIC/Dkk‑3
蛋白、或者对在癌患者血中大量存在的REIC/Dkk‑3蛋白的反应性低的抗体无法识别在癌患
者血中大量存在的REIC/Dkk‑3蛋白,或者反应性低,因此REIC/Dkk‑3蛋白的测定值降低。另
一方面,特异性地识别正常细胞产生的具有活性结构的REIC/Dkk‑3蛋白和在癌患者血中大
量存在的REIC/Dkk‑3蛋白中的每一者的例如识别富含半胱氨酸的结构域的抗体能够同样
地识别在癌患者的血中大量存在的REIC/Dkk‑3蛋白,因此REIC/Dkk‑3蛋白的测定值不会显
著降低。
患癌的情况下能够进行预后的预测。例如,在使用特异性地识别、结合正常细胞产生的具有
活性结构的REIC/Dkk‑3蛋白、但不识别、不结合在癌患者血中大量存在的REIC/Dkk‑3蛋白、
或者对在癌患者血中大量存在的REIC/Dkk‑3蛋白的反应性低的抗体进行测定时确认到被
测体试样中的REIC/Dkk‑3蛋白浓度低于50ng/mL、优选低于30ng/mL、进一步优选低于20ng/
mL的情况下,可以判定该被测体有可能具有癌前病变/肿瘤性疾病。另外,将正常人的试样
作为对照试样,与对照试样中的REIC/Dkk‑3蛋白浓度进行比较,在使用特异性地识别、结合
正常细胞产生的具有活性结构的REIC/Dkk‑3蛋白、但不识别、不结合在癌患者血中大量存
在的REIC/Dkk‑3蛋白、或者对在癌患者血中大量存在的REIC/Dkk‑3蛋白的反应性低的抗体
进行测定时被测体试样中的REIC/Dkk‑3蛋白浓度低于对照试样中的REIC/Dkk‑3蛋白浓度
的情况下,可以判定该被测体有可能具有癌前病变/肿瘤性疾病。
REIC/Dkk‑3蛋白的总REIC/Dkk‑3蛋白的浓度之比,能够进行被测体中的癌的检测。此外,在
被测体罹患癌的情况下,能够进行癌治疗的监测,能够进行预后的预测。正常细胞产生的具
有活性结构的REIC/Dkk‑3蛋白的浓度相对于总REIC/Dkk‑3蛋白的浓度之比采取下述比例
即可:使用特异性地识别、结合正常细胞产生的具有活性结构的REIC/Dkk‑3蛋白、但不识
别、不结合在癌患者血中大量存在的REIC/Dkk‑3蛋白、或者对在癌患者血中大量存在的
REIC/Dkk‑3蛋白的反应性低的抗体进行测定时的浓度与使用特异性地识别正常细胞产生
的具有活性结构的REIC/Dkk‑3蛋白和在癌患者血中大量存在的REIC/Dkk‑3蛋白的抗体进
行测定时的浓度之比。例如,采取使用识别REIC/Dkk‑3蛋白的N端结构域的抗体进行测定时
的浓度与使用识别REIC/Dkk‑3蛋白的富含半胱氨酸的结构域的抗体进行测定时的浓度之
比即可。识别REIC/Dkk‑3蛋白的N端结构域的抗体无法识别在癌患者血中大量存在的REIC/
Dkk‑3蛋白、或者反应性低;识别REIC/Dkk‑3蛋白的富含半胱氨酸的结构域的抗体既能够识
别在癌患者血中大量存在的REIC/Dkk‑3蛋白,也能够识别正常细胞产生的具有活性结构的
REIC/Dkk‑3蛋白。使用了识别REIC/Dkk‑3蛋白的N端结构域的抗体的测定例如可以通过使
用识别REIC/Dkk‑3蛋白的N端结构域的抗体作为捕获抗体、使用以全长REIC/Dkk‑3为免疫
原而制作的多克隆抗体作为检测抗体的夹心ELISA法来进行,也可以代替多克隆抗体而使
用识别REIC/Dkk‑3蛋白的富含半胱氨酸的结构域或C端结构域的单克隆抗体作为检测抗
体。使用了识别REIC/Dkk‑3蛋白的富含半胱氨酸的结构域的抗体的测定例如可以通过使用
识别REIC/Dkk‑3蛋白的富含半胱氨酸的结构域的抗体作为捕获抗体、使用以全长REIC/
Dkk‑3为免疫原而制作的多克隆抗体作为检测抗体的夹心ELISA法来进行,也可以代替多克
隆抗体而使用识别REIC/Dkk‑3蛋白的富含半胱氨酸的结构域或C端结构域的单克隆抗体作
为检测抗体。作为识别REIC/Dkk‑3蛋白的N端结构域的抗体,可以例示N‑1抗体,作为识别
REIC/Dkk‑3蛋白的富含半胱氨酸的结构域的抗体,可以例示Cys‑3抗体。
的REIC/Dkk‑3蛋白的反应性低的抗体测定的浓度与使用特异性地识别正常细胞产生的具
有活性结构的REIC/Dkk‑3蛋白和在癌患者血中大量存在的REIC/Dkk‑3蛋白的抗体测定的
REIC/Dkk‑3蛋白的浓度之比低于使用正常人的生物试样得到的比的情况下,可以判定该被
测体有可能具有癌前病变/肿瘤性疾病。
将定期采集的试样中的REIC/Dkk‑3蛋白浓度的变化作为指标来进行癌治疗的监测。
3蛋白的N端结构域的、特异性地识别正常细胞产生的具有活性结构的REIC/Dkk‑3蛋白、但
不识别、不结合在癌患者血中大量存在的REIC/Dkk‑3蛋白、或者对在癌患者血中大量存在
的REIC/Dkk‑3蛋白的反应性低的抗体测定的REIC/Dkk‑3蛋白的浓度上升的情况下,意味着
REIC/Dkk‑3在癌细胞中进行了表达,表明在癌细胞中的表达具有基于REIC/Dkk‑3的治疗作
用或治疗效果。因此,可以判断:对于疾病的缓解或癌治疗具有肯定的应答,确认到癌治疗
的效果。另一方面,在正常细胞产生的具有活性结构的REIC/Dkk‑3蛋白浓度降低的情况下,
可以判断:未确认到癌治疗的效果,或者癌发生了恶化。
异性地识别正常细胞产生的具有活性结构的REIC/Dkk‑3蛋白和在癌患者血中大量存在的
REIC/Dkk‑3蛋白的抗体测定的REIC/Dkk‑3蛋白的浓度之比上升的情况下,可以判断:对于
疾病的缓解或癌治疗具有肯定应答,确认到癌治疗的效果。另一方面,该比降低的情况下,
可以判断:未确认到癌治疗的效果,或者癌发生了恶化。
断也有用。此处,伴随诊断是指为了在给药前预测药品的效果或副作用而进行的临床检查。
的同等的患者试样中的REIC/Dkk‑3蛋白浓度的逐次变化进行免疫学检测和定量,将患者试
样中的REIC/Dkk‑3蛋白浓度与对照试样中的REIC/Dkk‑3蛋白浓度进行比较的各步骤;基于
患者试样中的REIC/Dkk‑3蛋白浓度与对照试样中的REIC/Dkk‑3蛋白浓度的平均浓度的差
异、以及患者试样中的REIC/Dkk‑3蛋白浓度的逐次变化,决定是否对患者使用现有的治疗
和/或REIC/Dkk‑3治疗。
所包含的识别REIC/Dkk‑3蛋白的抗体,可以举出N‑1抗体等识别N端结构域的抗体和Cys‑3
抗体等识别富含半胱氨酸的结构域的抗体或者识别C端结构域的抗体。该试剂盒可以包含
使用说明书、可检测的标签或标记、促进与抗体的结合的溶液等。
用髂淋巴结法来制作,根据与全长REIC/Dkk‑3蛋白、REIC部分区域3和REIC部分区域1
[Arg142‑Ile350](参见专利文献3)的反应性进行筛选而确定了识别区域的抗体。识别N端
结构域的抗体是指与全长REIC/Dkk‑3蛋白反应、但不与REIC部分区域3和REIC部分区域1反
应的抗体,识别C端结构域的抗体是指与全长REIC/Dkk‑3蛋白和REIC部分区域1反应、但不
与REIC部分区域3反应的抗体,识别富含半胱氨酸的结构域的抗体是指上述识别N端结构域
的抗体和识别C端结构域的抗体以外的抗体,是与全长REIC/Dkk‑3蛋白、REIC部分区域1和
REIC部分区域3反应的抗体。即,识别N端结构域的抗体是指识别[Ala22‑Thr134]部分区域
的抗体,识别C端结构域的抗体是指识别[Val289‑Ile350]部分区域的抗体,识别富含半胱
氨酸的结构域的抗体是指识别[Ser142‑Phe288]部分区域的抗体。关于利用上述方法筛选
出的12种抗体(N‑1、N‑2、C‑1、C‑2、Cys‑1、Cys‑2、Cys‑3、Cys‑4、Cys‑5、Cys‑6、Cys‑7和Cys‑8
抗体)与抗原的反应模式,将蛋白的种类和所识别的区域示于图1‑1。图1‑2中示出REIC/
Dkk‑3蛋白的结构示意图。
起的测定障碍,必须特别留意人的血清和血浆的制备与测定。对于在样本采集时假定混杂
的凝集体,在稀释前通过微量离心分离将其从试样中除去,此外,所要检查的血清或血浆试
样的最初的浓度应为约2%以下。
体,对于进行了2次(第0天、第14天)REIC/Dkk‑3基因治疗的患者,测定11种样本、即基准(治
疗前)、第1次治疗后第1、2、7、14天(即将第2次治疗之前)、第15、17、21、28天、第56天(即将
手术之前)、第84天的血清中的REIC/Dkk‑3蛋白浓度。作为检测抗体,使用经生物素标记的
抗REIC/Dkk‑3蛋白多克隆抗体。该多克隆抗体以由HEK293细胞分泌的REIC/Dkk‑3蛋白作为
免疫原而制作。根据该测定数据,在使用识别N端结构域的N‑1抗体作为捕获抗体的情况下,
能够进行治疗的监测,将两名患者(患者A、患者B)的测定数据示于图3‑1A和图3‑1B中。进
而,使用识别富含半胱氨酸的结构域的Cys‑3抗体作为捕获抗体,测定上述血清样品中的
REIC/Dkk‑3蛋白浓度,将结果示于图3‑2A(患者A)和图3‑2B(患者B)中。如图3‑1所示,在使
用N‑1抗体作为捕获抗体的情况下,进行REIC/Dkk‑3基因治疗或外科治疗后的血清中的
REIC/Dkk‑3蛋白测定值显著上升。另一方面,在使用Cys‑3抗体作为捕获抗体的情况下,进
行REIC/Dkk‑3基因治疗或外科治疗后的血清中的REIC/Dkk‑3蛋白测定值不上升。通过将这
些捕获抗体不同的两种测定数据进行比较,可以判断:N‑1抗体对癌患者血清中的REIC/
Dkk‑3蛋白的反应性显著降低。作为图3‑3,示出以N‑1抗体和Cys‑3抗体作为捕获抗体所测
定的REIC/Dkk‑3蛋白浓度的比例(%)(N‑1抗体/Cys‑3抗体的测定值)。该结果表明,作为
REIC/Dkk‑3蛋白浓度的比例(%)的N‑1抗体/Cys‑3抗体的测定值之比准确地反映了血中的
REIC/Dkk‑3蛋白的动态。另外,图3‑4中示出患者A和B以及其他3名患者(共5人)的治疗前的
血清中的REIC/Dkk‑3蛋白浓度的测定结果。图3‑4中示出使用识别N端结构域的N‑1抗体或
识别富含半胱氨酸的结构域的Cys‑3抗体作为捕获抗体时的测定结果。如图3‑4所示,使用
N‑1抗体时的血清中浓度为约10~50ng/mL,使用Cys‑3抗体时的血清中浓度为约55~
110ng/mL。由图3‑3和图3‑4可以判断,以REIC/Dkk‑3蛋白的血清中浓度和利用上述2种抗体
测定的浓度之比为指标,能够捕捉接受了治疗的患者血中的经时的REIC/Dkk‑3蛋白的动态
变化、即具有活性结构的REIC/Dkk‑3蛋白和在癌患者血中大量存在的REIC/Dkk‑3蛋白的浓
度的变化。血中的经时的REIC/Dkk‑3蛋白的动态变化反映了癌患者的癌状态的变化,还能
够进行治疗的监测,以往的基于肿瘤标记物的诊断是利用癌患者的血中浓度的绝对值来进
行评价,因此是包含个体差异的诊断法,与此相对,该诊断方法利用2种抗体来捕捉癌患者
血清中的REIC/Dkk‑3蛋白的结构变化,由此成为能够实现用于提供最适合患者个体的治疗
方法的定制医疗的新型肿瘤诊断法。
的夹心ELISA法,对前列腺癌患者、外科手术后、正常人各5人的血清中的REIC/Dkk‑3蛋白浓
度进行测定。将以N‑1抗体和Cys‑3抗体作为捕获抗体所测定的REIC/Dkk‑3蛋白浓度的比例
(%)(N‑1抗体/Cys‑3抗体的测定值)示于图4‑1。将5名前列腺患者的概况示于图4‑2。如图
4‑1所示,在前列腺癌患者的血清中,N‑1抗体/Cys‑3抗体的测定值低,在治疗后的前列腺癌
患者的血清和正常人血清中,N‑1抗体/Cys‑3抗体的测定值高。该结果表明,利用2种捕获抗
体所测定的REIC/Dkk‑3蛋白的浓度之比能够作为癌的预测、预后的诊断有效利用。
素标记的识别富含半胱氨酸的结构域的Cys‑3抗体作为检测抗体时的、可组合的捕获抗体
进行了研究。捕获抗体使用与检测抗体不同的抗体,以100ng/mL、10ng/mL的浓度添加纯化
的重组型REIC/Dkk‑3蛋白,作为与检测抗体反应的作用性的复合体,使用了亲和素‑HRP。将
作为REIC/Dkk‑3蛋白与各种抗体的结合量的指标的HRP活性以吸光度450nm的测定值示于
图5。如图5所示,可以将所确认的所有捕获抗体与检测抗体组合而测定REIC/Dkk‑3蛋白。另
外可知:作为捕获抗体,N‑1抗体优于N‑2抗体;在识别富含半胱氨酸的结构域的抗体中,
Cys‑3抗体是优异的。
癌的预测和预后的诊断方法以及伴随诊断法有效利用,其诊断方法以检查试剂盒的形式提
供。