一种脾氨肽内多肽的提取方法

摘要

本发明公开了一种脾氨肽内多肽的提取方法，包括以下步骤，步骤一，试剂配制，配制流动相A、流动相B；步骤二，样品处理，将脾氨肽加入到起始流动相中，得到样品溶液；步骤三、梯度洗脱。本发明具有以下优点和效果：采用色谱分离提取脾氨肽内的多肽，样品处理时，用0.22μm的有机膜滤过样品，去除脾氨肽样品中的大分子物质，减少对提取多肽时的干扰；其次，进样后进行梯度洗脱，通过调节流动相A与流动相B之间的比例，使得多肽集中在主要色谱峰处洗脱下来，达到了提取脾氨肽内的多肽、分离纯化效果好的效果。

权利要求

1.一种脾氨肽内多肽的提取方法，其特征在于：包括以下步骤

步骤一，试剂配制，配制流动相A、流动相B，流动相A内溶剂为水、溶质为质量百分比浓度为0.1的甲酸，流动相B内溶剂为乙腈、溶质包括质量百分比浓度为0.1％的甲酸和0.05％的己二酸；

步骤二，样品处理，将脾氨肽加入到起始流动相中，得到样品溶液；

步骤三，分离纯化，色谱条件，色谱柱选用Agilent Poroshell 300SB-C18，色谱柱填料为多孔硅胶，填料颗粒直径为5μm，色谱柱内径2.1mm，柱长75mm，柱温40℃，梯度洗脱0min-

5min-14min-18min-24.5min-30min,流动相B 5％-12％-17％-17.5％-30％-50％；流速为

0.5mL/min，进样体积为20μL，检测波长214nm，收集主要色谱峰。

2.根据权利要求1所述的一种脾氨肽内多肽的提取方法，其特征在于：步骤二，样品处理，取脾氨肽原液离心，离心条件为：12000rpm、10min、4℃，离心后取上清液，加入到起始流动相内，用0.22μm有机膜滤过，得到样品溶液。

3.根据权利要求2所述的一种脾氨肽内多肽的提取方法，其特征在于：步骤二中，每600μL上清液加入到 100μL起始流动相。

4.根据权利要求1所述的一种脾氨肽内多肽的提取方法，其特征在于：步骤二，样品处理，取脾氨肽冻干粉溶于去离子水中，4℃下用透析袋透析，向透析后的脾氨肽原液内加入起始流动相，用0.22μm的有机膜滤过，得到样品溶液。

5.根据权利要求4所述的一种脾氨肽内多肽的提取方法，其特征在于：步骤二中，每500μL脾氨肽原液加入200μL起始流动相。

6.根据权利要求1所述的一种脾氨肽内多肽的提取方法，其特征在于：步骤三，分离纯化中，收集11.222-11.711min、25.719-25.919min、25.935-26.285min、26.302-26.652min、

30.016-30.240min、30.999-31.049min的色谱峰。

说明书

一种脾氨肽内多肽的提取方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物制品领域，特别涉及一种脾氨肽内多肽的提取方法。

背景技术

[0002] 脾氨肽口服冻干粉属于从脏器提取的生化药，主要成分包括氨基酸、多肽、核苷酸等物质，作为免疫体调节剂，用于反复呼吸道感染、支气管炎、哮喘、肺炎、癌症等病症的辅助治疗。临床观察显示，能够有效提高患者的抵抗力，减少呼吸道感染的发生率，并具有调节细胞免疫的功能，脾氨肽中主要的活性物质为多肽，国家药品标准WS1-(X-002)-2002Z中，测定多肽的含量是控制脾氨肽产品含量的唯一指标，将脾氨肽内的多肽分离纯化后，对于研究脾氨肽作为免疫调节剂的作用机制，以及将分离的多肽作为冻干粉制剂以显著提高药品的活力，都具有显著的作用和意义，因此，有必要提出一种脾氨肽内多肽的提取方法。

发明内容

[0003] 本发明的目的是提供一种脾氨肽内多肽的提取方法，具有分离脾氨肽内多肽的效果。

[0004] 本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种脾氨肽内多肽的提取方法，包括以下步骤，步骤一，试剂配制，配制流动相A、流动相B，流动相A内溶剂为水、溶质为质量百分比浓度为0.1的甲酸，流动相B内溶剂为乙腈、溶质包括质量百分比浓度为0.1％的甲酸和0.05％的己二酸；步骤二，样品处理，将脾氨肽加入到起始流动相中，得到样品溶液；步骤三，分离纯化，色谱条件，色谱柱填料为多孔硅胶，填料颗粒直径为5μm，色谱柱内径2.1mm，柱长75mm，色谱柱选用Agilent Poroshell 300SB-C18，柱温40℃，梯度洗脱
0min-5min-14min-18min-24.5min-30min,流动B5％-12％-17％-17.5％-30％-50％；流速为0.5mL/min，进样体积为20μL，检测波长214nm，收集主要色谱峰。

[0005] 通过采用上述技术方案，脾氨肽内主要包括多肽、核苷酸、游离氨基酸等组分，组分复杂，各组分分子量大小不一。本申请采用色谱分离技术，色谱分离是一种分离复杂混合物中各种组分的有效方法，利用不同物质在固定相和流动相构成的体系中具有不同的分配系数，当流动相和固定相相对运动时，这些物质随流动相一起运动，并在两相间进行反复的分配，从而使各组分达到分离。

[0006] 色谱分离条件中，流动相的选择对能否得到合适的峰型、能否成功从脾氨肽内分离出多肽至关重要，选用梯度洗脱的方式，流动相A选用甲酸的水溶液，流动相B包括乙腈、甲酸和己二酸，乙腈、甲酸为色谱分离中常用的流动相组分，本申请在流动相B内加入己二酸，通过上述梯度洗脱条件洗脱后，洗脱时能将脾氨肽内的多肽集中洗脱下来，集中在主要色谱峰处，将脾氨肽内的多肽分离出来，分离效果好。

[0007] 本发明的进一步设置为：步骤二，样品处理，取脾氨肽原液离心，离心条件为：12000rpm、10min、4℃，离心后取上清液，加入到起始流动相内，用0.22μm有机膜滤过，得到样品溶液。

[0008] 通过采用上述技术方案，样品处理时，取脾氨肽原液离心，在4℃下离心10分钟，再通过孔径为0.22μm的有机膜滤过，去除脾氨肽原液内的大分子杂质，减少色谱分离时大分子物质的干扰，提高色谱分离提取多肽的准确性。

[0009] 本发明的进一步设置为：步骤二中，每600μL上清液加入100μL起始流动相。

[0010] 通过采用上述技术方案，每600μL上清液加入100μL起始流动相，起始流动相是指色谱分离梯度洗脱时，起始的流动相，根据步骤三中的色谱条件可知，起始流动相包括95％的流动相A和5％的流动相B。

[0011] 本发明的进一步设置为：步骤二，样品处理，取脾氨肽冻干粉溶于去离子水中，4℃下用透析袋透析，向透析后的脾氨肽原液内加入起始流动相，用0.22μm的有机膜滤过，得到样品溶液。

[0012] 通过采用上述技术方案，当脾氨肽为冻干粉时，取脾氨肽冻干粉溶于去离子水中，用透析袋透析，透析袋的截留分子量可根据目标多肽的大小进行选择，透析后向脾氨肽原液内加入起始流动相，通过有机膜滤过后，得到样品溶液。

[0013] 本发明的进一步设置为：步骤二中，每500μL脾氨肽原液加入200μL起始流动相。

[0014] 通过采用上述技术方案，每500μL脾氨肽原液加入200μL起始流动相。

[0015] 本发明的进一步设置为：步骤三，分离纯化中，收集11.222-11.711min、25.719-25.919min、25.935-26.285min、26.302-26.652min、30.016-30.240min、30.999-31.049min的色谱峰。

[0016] 通过采用上述技术方案，在步骤三的色谱条件下，主要色谱峰包括上述6个时间段，脾氨肽内的多肽会集中在上述6个色谱峰，收集即可得到分离的多肽。

[0017] 综上所述，本发明具有以下有益效果：采用色谱分离提取脾氨肽内的多肽，样品处理时，用0.22μm的有机膜滤过样品，去除脾氨肽样品中的大分子物质，减少对提取多肽时的干扰；其次，进样后进行梯度洗脱，通过调节流动相A与流动相B之间的比例，使得多肽集中在主要色谱峰处洗脱下来，达到了提取脾氨肽内的多肽、分离纯化效果好的效果。

具体实施方式

[0018] 实施例1：一种脾氨肽内多肽的提取方法，包括以下步骤，步骤一，试剂配制，配制流动相A、流动相B，流动相A内溶剂为水、溶质为质量百分比浓度为0.1的甲酸，流动相B内溶剂为乙腈、溶质包括质量百分比浓度为0.1％的甲酸和0.05％的己二酸。

[0019] 步骤二，样品处理，取脾氨肽原液离心，离心条件为：12000rpm、10min、4℃，离心后取上清液，加入到起始流动相内，每600μL上清液加入100μL起始流动相，用0.22μm有机膜滤过，得到样品溶液。其中，以体积计，起始流动相包括95％的流动相A和5％的流动相B。

[0020] 步骤三，分离纯化，色谱条件，色谱柱填料为多孔硅胶，填料颗粒直径为5μm，色谱柱内径2.1mm，柱长75mm，色谱柱选用Agilent Poroshell 300SB-C18。柱温40℃，梯度洗脱0min-5min-14min-18min-2 4.5min-30min,流动相B 5％-12％-17％-17.5％-30％-50％；
流速为0.5mL/min，进样体积为20μL，检测波长214nm，收集11.222-11.711min、25.719-
25.919min、25.935-26.285min、26.302-26.652min、30.016-30.240min、30.999-31.049min的色谱峰。

[0021] 收集各时间段的样品，检测各样品内的核苷酸含量、糖含量、多肽含量，在表2中列出检测结果。

[0022] 实施例2：一种脾氨肽内多肽的提取方法，与实施例1的不同之处在于，步骤二，样品处理，取脾氨肽冻干粉溶于去离子水中，4℃下用透析袋透析，向透析后的脾氨肽原液内加入起始流动相，每500μL脾氨肽原液加入200μL起始流动相，用0.22μm的有机膜滤过，得到样品溶液。

[0023] 表1

[0024]时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 95 5
5 88 12
14 83 17
18 82.5 17.5
24.5 70 30
30 50 50

[0025] 表2

[0026] 样品名 时间段/min 核苷酸(μg/ml) 糖(μg/ml) 多肽(μg/ml)Fraction1 0-11.222 ＞15 2.5-5 0.025-0.05
Fraction2 11.222-11.711 8-12 2.5-5 0.4-0.5
Fraction3 11.711-25.719 8-12 2.5-5 0.1-0.2
Fraction4 25.719-25.919 无 1.2-2 0.4-0.5
Fraction5 25.935-26.285 无 1.2-2 0.4-0.5
Fraction6 26.302-26.652 无 1.2-2 0.4-0.5
Fraction7 26.652-30.016 无 1.2-2 0.1-0.2
Fraction8 30.016-30.240 无 1.2-2 0.4-0.5
Fraction9 30.999-31.049 无 1.2-2 0.4-0.5

[0027] 对比例：一种脾氨肽内多肽的提取方法，与实施例1的区别之处在于，流动相B内溶剂为乙腈、溶质包括质量百分比浓度为0.1％的甲酸。

[0028] 收集各时间段的样品，检测各样品内的核苷酸含量、糖含量、多肽含量，在表3中列出检测结果。

[0029] 表3

[0030]样品名 时间段/min 核苷酸(μg/ml) 糖(μg/ml) 多肽(μg/ml)
Fraction1 0-11.222 ＞15 2.5-5 0.025-0.05
Fraction2 11.222-11.711 8-12 2.5-5 0.2-0.3
Fraction3 11.711-25.719 4-5 2.5-5 0.2-0.3
Fraction4 25.719-25.919 4-5 2.5-5 0.2-0.3
Fraction5 25.935-26.285 4-5 1-2 0.2-0.3
Fraction6 26.302-26.652 4-5 1-2 0.2-0.3
Fraction7 26.652-30.016 4-5 无 0.2-0.3
Fraction8 30.016-30.240 4-5 无 0.2-0.3
Fraction9 30.999-31.049 4-5 无 0.05-0.1

[0031] 具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。