一种环孢菌素H的分离纯化方法

摘要

一种环孢菌素H的分离纯化方法，其中层析柱采用了苯基氨基甲酸酯化β‑环糊精硅胶作为层析柱的填料，进行环孢菌素H的分离纯化，可将原料中的环孢菌素A和环孢菌素H进行有效分离。同时分离纯化过程中，可使用单一极性溶剂，可对溶剂进行回收利用，节约生产成本。洗脱过程中，含有环孢菌素H的交叉部分还可以回收重新纯化，避免造成浪费。同时，该技术方案适用于各种含环孢菌素H的原料,适用性强，可大量制备，可为医药工业提供大量高纯度的环孢菌素H原材料。

权利要求

1.一种环孢菌素H的分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：待分离液的制备：将环孢菌素H含量10%以上的环孢菌素H粗品溶解于极性溶剂，过滤后得到含环孢菌素H的溶液，按溶液体积比15‑25%加入水进行搅拌稀释，制成待分离液；

上样：将待分离液上样层析柱，形成含有环孢菌素H的层析柱；所述层析柱的制备包括：将苯基氨基甲酸酯化β‑环糊精硅胶用甲醇浸泡后装柱，再用体积百分比浓度35‑40%的极性溶剂平衡层析柱；

洗脱：用洗脱液对层析柱进行梯度洗脱，所述洗脱液中含有质量百分比为0.1%的甲酸或乙酸，所述洗脱液中极性溶剂的体积百分比浓度由35‑40%逐步提高至45‑50%，洗脱流速为每小时3‑5个柱体积，用HPLC进行跟踪监测，收集环孢菌素H含量95%以上的洗脱液；

浓缩结晶：将洗脱步骤中收集的环孢菌素H含量95%以上的洗脱液进行浓缩，浓缩后产物用乙酸乙酯进行萃取，并取上相萃取液减压浓缩后得到稠状浓缩物，稠状浓缩物加入丙酮溶解过滤后，再依次加入甲基叔丁基醚和去离子水，最后逐步加入正己烷至溶液中出现白色不溶物后，降温至4℃，析出白色固体；

干燥：过滤浓缩结晶步骤中析出的白色固体，将白色固体在40‑60℃下进行干燥，得到环孢菌素H成品；

所述环孢菌素H粗品中含有环孢菌素A；

所述待分离液的制备步骤中，所述环孢菌素H粗品与所述极性溶剂的重量比为1：8‑12；

所述上样步骤中，所述环孢菌素H粗品与所述苯基氨基甲酸酯化β‑环糊精硅胶的重量比为1：10‑100；

所述层析柱的径高比大于10。

2.根据权利要求1所述的一种环孢菌素H的分离纯化方法，其特征在于，所述极性溶剂为乙腈、甲醇、乙醇的一种或者多种。

3.根据权利要求1所述的一种环孢菌素H的分离纯化方法，其特征在于，所述浓缩结晶步骤中，将洗脱步骤中收集的环孢菌素H含量95%以上的洗脱液减压浓缩至无极性溶剂后，再用乙酸乙酯进行萃取。

4.根据权利要求1所述的一种环孢菌素H的分离纯化方法，其特征在于，所述浓缩结晶步骤中，将洗脱步骤中收集的环孢菌素H含量95%以上的洗脱液用截留分子量不大于200的聚醚砜纳滤膜进行浓缩，浓缩至原体积的五分之一后，再用乙酸乙酯进行萃取。

5.根据权利要求1所述的一种环孢菌素H的分离纯化方法，其特征在于，所述浓缩结晶步骤中，所述稠状浓缩物与丙酮、甲基叔丁基醚、去离子水的重量比为1:1‑3:1:0.001。

6.根据权利要求1所述的一种环孢菌素H的分离纯化方法，其特征在于，所述浓缩结晶步骤中，所述稠状浓缩物与正己烷的体积比为1:4‑6。

说明书

一种环孢菌素H的分离纯化方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物化学领域，特别涉及一种环孢菌素H的分离纯化方法。

背景技术

[0002] 环孢菌素(Cyclosporin)是20世纪70年代发现的由雪白白僵菌(Beauveria bassiana，原名为多孔木霉菌Tolypocladium inflatum)产生的一组环状十一肽物质。其中
的一个主要组分一环孢素A(Cyclosporin A,CsA)己作为高效免疫抑制剂广泛应用于器官
移植术，环孢素A结构图与结构式可见图1。它的问世引起了器官移植领域的一场革命。除免
疫抑制作用外，环孢素还有一系列其它生物活性，如治疗红斑狼疮、牛皮癣等自身免疫系统
疾病，抑制HIV‑1病毒，逆转肿瘤多药耐药等。

[0003] 环孢菌素H(Cyclosporin H,CsH)结构图与结构式可见图2，与CsA都是首先从半知菌属多孔木霉(Tolypocladium inflatum后正名为雪白白僵菌Beauveria bassiana)代谢
产物中分离出来的。CsH的化学结构和CsA相似，都是由十一个氨基酸组成的环状多肽，只是
第十一位上的甲基缬氨酸(MeVal)的构型不同，在CsA中为L构型，在CsH中为D构型。CsH无免
疫抑制活性，但在逆转肿瘤多药耐药、抗寄生虫以及抗病毒方面与CsA有相似的作用，特别
是在对G‑蛋白偶联受体(GPCR)－甲酰肽受体(FPR)功能的拮抗作用方面大大强于CsA，也强
于许多其他甲酰肽受体拮抗剂，引起科学家广泛的注意。此外，CsH已经用于研究其它的一
些生物过程，包括程序性死亡、K+离子通道的功能性表达、Ca+在血管平滑肌可能的作用、一
氧化氮(NO)合成酶活性、病毒诱导的细胞调亡、肿瘤和获得性免疫缺陷综合症(HIV)等。

[0004] 目前，环孢菌素H来源主要有两个途径：1、依据美国专利pat20120253007，Synthesis of Cyclosporin H的报道方法，将CsA转换为CsH，但先分离出CsA，再进行CsH的
转换，步骤繁琐，收率较低。2、从多孔木霉的发酵液经过滤或离心分离,滤液用乙酸丁酯提
取,提取物除脂后得到环孢菌素的混合物,再经硅胶柱层析后经分部收集、去色素、减压浓
缩和干燥得到白色CsH粉末。图3、图4分别是由两种发酵粗提取物环孢菌素H的HPLC图，其中
环孢菌素H含有不同比例，有2.7％也有4.1％(RT 79min)。从发酵粗提取物HPLC在210nm下
可以看到含有的杂质大概分布情况，较难快速获得高纯度的环孢菌素H。其中，这两种发酵
粗提取物一般是经过不同的层析作为环孢菌素A的生产原料。但由于发酵副产物较多，提取
步骤复杂，收率较低。图5是由环孢菌素A合成制备的环孢菌素H的HPLP图，其中环孢菌素H含
量为21.4％。

[0005] 目前获得环孢菌素H的主要方法用硅胶或者ODS‑C18色谱填料对以上环孢菌素粗品进行提纯，但分离度效果不好、收率低且繁琐。有研究报道，可采用大孔树脂结合高速逆
流色谱分离纯化的方法，分离中交叉组分大，纯化周期长，不适合放大。

[0006] 在《茄病镰刀菌产生的环孢菌素H的研究‑‑‑‑分离纯化和结构鉴别》提供了硅胶层析柱分离纯化方法和HPLC检测条件，ODS‑C18，4.6*250mm，5μm，1ml/min，乙腈：水：叔丁基甲
醚：磷酸＝50：45：5：0.1，紫外210nm，80℃。在实用新型专利《一种环孢菌素同系物的分离纯
化装置》CN205838893U中提供了一种环孢菌素同系物的分离纯化装置，该方法主要利用至
少两级切向层析柱分离纯化单元的系统，该系统主要是适用于硅胶填料或者氧化铝填料介
质，设备系统复杂且设置多处压力泵和洗脱体系，难适用于反相层析方式。在专利《高纯度
环孢菌素A的制备方法》CN1763084报道了使用丙酮、水和正己烷长时间粗结晶以及结合硅
胶层析纯化然后再结晶得到纯度高的环孢菌素A，和《一种制备环孢菌素A的方法》
CN102086226A中，则使用了大孔吸附树脂层析、硅胶柱层析、结晶纯化得到纯度高的环孢菌
素A，

[0007] 由工业生产上环孢菌素A发酵的参考相关文献：《发酵液中小组分环孢菌素D的HPLC测定法》《果葡糖浆对环孢菌素A发酵影响的研究》《环孢菌素A发酵生产方法》《环孢菌
素A产生菌诱变育种及发酵条件研究》《雪白白僵菌产环孢菌素A分批补料发酵动力学》可知
一般环孢菌素A的组分初始占总纯度都会大于85％，以及后续的纯化生产才能获得有价值
的环孢菌素A纯品。对于发酵粗品中本身含有的杂质小组分环孢菌素H的获得还较难获得规
模化生产，一般都是通过环孢菌素A生产的边角料，经过多次富集纯化，提高含量后再进行
纯化获得，专利pat20120253007和其参考文献报道的合成转换方法获得的粗品是一种有效
可控的环孢菌素H获得来源，但纯化也过于繁琐收率较低。同时，合适的结晶溶剂体系会对
产品的纯度和晶型起关键的作用，结晶和重结晶也是一种重要的提高产品纯度的方式。

发明内容

[0008] 为此，需要提供一种高收率，高纯度的环孢菌素H的分离纯化方法，特别是将环孢菌素H与环孢菌素A进行分离纯化的方法。为实现上述目的，发明人提供了一种环孢菌素H的
分离纯化方法，包括以下步骤：

[0009] 待分离液的制备：将环孢菌素H含量10％以上的环孢菌素H粗品溶解于极性溶剂，过滤后得到含环孢菌素H的溶液，按溶液体积比15‑25％加入水进行搅拌稀释，制成待分离
液；

[0010] 上样：将待分离液上样层析柱，形成含有环孢菌素H的层析柱；所述层析柱制备包括：将苯基氨基甲酸酯化β‑环糊精硅胶用甲醇浸泡后装柱，再用体积百分比浓度35‑40％的
极性溶剂平衡层析柱；

[0011] 洗脱：用洗脱液对层析柱进行梯度洗脱，所述洗脱液中含有质量百分比为0.1％的甲酸或乙酸，所述洗脱液中极性溶剂的体积百分比浓度由35‑40％逐步提高至45‑50％，洗
脱流速为每小时3‑5个柱体积，用HPLC进行跟踪监测，收集环孢菌素H含量95％以上的洗脱
液；

[0012] 浓缩结晶：将洗脱步骤中收集的环孢菌素H含量95％以上的洗脱液进行浓缩，浓缩后产物用乙酸乙酯进行萃取，并取上相萃取液减压浓缩后得到稠状浓缩物，稠状浓缩物加
入丙酮溶解过滤后，再依次加入甲基叔丁基醚和去离子水，最后逐步加入正己烷至溶液中
出现白色不溶物后，降温至4℃，析出白色固体；

[0013] 干燥：过滤浓缩结晶步骤中析出的白色固体，将白色固体在40‑60℃下进行干燥，得到环孢菌素H成品。

[0014] 优选的，所述环孢菌素H粗品中含有环孢菌素A。

[0015] 优选的，所述极性溶剂为乙腈、甲醇、乙醇的一种或者多种。

[0016] 优选的，所述待分离液的制备步骤中，所述环孢菌素H粗品与所述极性溶剂的重量比为1：8‑12。

[0017] 优选的，所述环孢菌素H粗品与所述苯基氨基甲酸酯化β‑环糊精硅胶的重量比为1：10‑100。

[0018] 优选的，所述层析柱的径高比大于10。

[0019] 优选的，所述浓缩结晶步骤中，将洗脱步骤中收集的环孢菌素H含量95％以上的洗脱液减压浓缩至无极性溶剂后，再用乙酸乙酯进行萃取。

[0020] 优选的，所述浓缩结晶步骤中，将洗脱步骤中收集的环孢菌素H含量95％以上的洗脱液用截留分子量不大于200的聚醚砜纳滤膜进行浓缩，浓缩至原体积的五分一后，再用乙
酸乙酯进行萃取。

[0021] 优选的，所述浓缩结晶步骤中，所述稠状浓缩物与丙酮、甲基叔丁基醚、去离子水的重量比为1:1‑3：1:0.001。

[0022] 优选的，所述浓缩结晶步骤中，所述稠状浓缩物与正己烷的体积比为1:4‑6。

[0023] 区别于现有技术，上述技术方案的层析柱采用了苯基氨基甲酸酯化β‑环糊精硅胶作为层析柱的填料，进行环孢菌素H的分离纯化，可将原料中的环孢菌素A和环孢菌素H进行
有效分离。同时分离纯化过程中，可使用单一极性溶剂，可对溶剂进行回收利用，节约生产
成本。洗脱过程中，含有环孢菌素H的交叉部分还可以回收重新纯化，避免造成浪费。该技术
方案适用于各种含环孢菌素H的原料,适用性强，可大量制备，可为医药工业提供大量高纯
度的环孢菌素H原材料。

附图说明

[0024] 图1为背景技术所述环孢菌素A的结构图与结构式；

[0025] 图2为背景技术所述环孢菌素H的结构图与结构式；

[0026] 图3为背景技术所述的一种发酵提取粗品的HPLC图；

[0027] 图4为背景技术所述的另一种发酵提取粗品的HPLC图；

[0028] 图5为背景技术所述的一种环孢菌素A合成制备含环孢菌素H粗品的HPLC图；

[0029] 图6为实施例3中制备的环孢菌素H成品的HPLC图；

[0030] 图7为实施例3中制备的环孢菌素H成品的质谱图。

具体实施方式

[0031] 为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例并配合附图详予说明。

[0032] 本实施方式中HPLC高效液相色谱参数如下：色谱柱：ZORBAX SB‑C18，4.6*250mm，5μm，流速：1ml/min，流动相比例为(乙腈：水：叔丁基甲醚：磷酸＝50：45：5：0.1)，紫外检测波
长210nm，柱温：60℃。

[0033] 实施例1：

[0034] 实施例1中的环孢菌素H粗品来自用硅胶柱层析纯化环孢菌素A时的交叉副产物，经检测环孢菌素H含量为10％。

[0035] 本实施例的分离纯化方法，包括以下步骤：

[0036] 待分离液的制备：将环孢菌素H含量10％的环孢菌素H粗品溶解于10倍重量的甲醇，过滤去除固体不溶杂质后得到含环孢菌素H的溶液，并按溶液体积比20％加入水进行搅
拌稀释，制成待分离液；搅拌加入20％水使得上样液含有水，且样品不会析出。

[0037] 层析柱制备：将苯基氨基甲酸酯化β‑环糊精硅胶用甲醇浸泡后装柱，再用体积百分比浓度40％的甲醇平衡层析柱；层析柱柱径高比H/D＝15，

[0038] 上样：将待分离液上样层析柱，形成含有环孢菌素H的层析柱；环孢菌素H粗品与苯基氨基甲酸酯化β‑环糊精硅胶的重量比为1：50。

[0039] 洗脱：用含有质量百分比0.1％甲酸的洗脱液对层析柱进行梯度洗脱，洗脱液中甲醇的体积百分比浓度由40％逐步提高至50％，洗脱流速为每小时4个柱体积，第一个洗脱浓
度40％洗12个柱体积，然后45％洗20个柱体积，然后50％洗脱，洗脱液经HPLC进行跟踪监
测，收集环孢菌素H含量95％以上的洗脱液；

[0040] 浓缩结晶：将洗脱步骤中收集的环孢菌素H含量95％以上的洗脱液减压浓缩至无水后，用乙酸乙酯进行萃取，取上相萃取液减压浓缩后得到稠状浓缩物，稠状浓缩物加入丙
酮溶解过滤后，再依次加入甲基叔丁基醚和去离子水，所述稠状浓缩物与丙酮、甲基叔丁基
醚、去离子水的重量比为1:2：1:0.001；最后逐步加入5倍体积的正己烷至溶液中出现白色
不溶物后，降温至4℃，析出白色固体。

[0041] 干燥：过滤浓缩结晶步骤中析出的白色固体，将白色固体在50℃下进行干燥，得到环孢菌素H成品。

[0042] 实施例2：

[0043] 实施例2中的环孢菌素H粗品来自多孔木霉的发酵液，多次层析纯化环孢菌素A获得的含环孢菌素交叉杂质，其中环孢菌素H含量为30％。

[0044] 本实施例的分离纯化方法，包括以下步骤：

[0045] 待分离液的制备：将环孢菌素H含量30％的环孢菌素H粗品溶解于10倍重量的乙腈，过滤去除固体不溶杂质后得到含环孢菌素H的溶液，并按溶液体积比15％加入水进行搅
拌稀释，制成待分离液；搅拌加入少量水使得上样液含有水，且样品不会析出。

[0046] 层析柱制备：将苯基氨基甲酸酯化β‑环糊精硅胶用甲醇浸泡后装柱，再用体积百分比浓度35％的乙腈平衡层析柱；层析柱柱径高比H/D＝15，

[0047] 上样：将待分离液上样层析柱，形成含有环孢菌素H的层析柱；环孢菌素H粗品与苯基氨基甲酸酯化β‑环糊精硅胶的重量比为1：100。

[0048] 洗脱：用含有质量百分比0.1％乙酸的洗脱液对层析柱进行梯度洗脱，洗脱液中乙腈的体积百分比浓度由35％逐步提高至45％，洗脱流速为每小时5个柱体积，第一个洗脱浓
度35％洗10个柱体积，38％洗15个柱体积，然后41％洗脱20个柱体积，最后45％洗脱，洗脱
液经HPLC进行跟踪监测，收集环孢菌素H含量95％以上的洗脱液；浓缩结晶：

[0049] 浓缩结晶：将洗脱步骤中收集的环孢菌素H含量95％以上的洗脱液用截留分子量不大于200的聚醚砜纳滤膜进行浓缩，滤液用等体积的水进行稀释三次浓缩至原体积的五
分一后，再用乙酸乙酯进行萃取，取上相萃取液减压浓缩后得到稠状浓缩物，所述稠状浓缩
物加入丙酮溶解过滤后，再依次加入甲基叔丁基醚和去离子水，所述稠状浓缩物与丙酮、甲
基叔丁基醚、去离子水的重量比为1:2：1:0.001；最后逐步加入4倍体积的正己烷至溶液中
出现白色不溶物，降温至4℃，析出白色固体；

[0050] 干燥：过滤浓缩结晶步骤中析出的白色固体，将白色固体在60℃下进行干燥，得到环孢菌素H成品。

[0051] 实施例3：

[0052] 实施例3中的环孢菌素H粗品来自用环孢菌素A反应制备得环孢菌素H，经过前处理后环孢菌素H含量为21.4％，其HPLC图见图5，背景技术所述一种环孢菌素A合成制备含环孢
菌素H粗品的HPLC图。

[0053] 本实施例的分离纯化方法，包括以下步骤：

[0054] 待分离液的制备：将环孢菌素H含量50％的环孢菌素H粗品溶解于8倍重量的乙醇，过滤去除固体不溶杂质后得到含环孢菌素H的溶液，并按溶液体积比25％加入水进行搅拌
稀释，制成待分离液；搅拌加入少量水使得上样液含有水，且样品不会析出。

[0055] 层析柱制备：将苯基氨基甲酸酯化β‑环糊精硅胶用甲醇浸泡后装柱，再用体积百分比浓度40％的乙醇平衡层析柱；层析柱柱径高比H/D＝20，

[0056] 上样：将待分离液上样层析柱，形成含有环孢菌素H的层析柱；环孢菌素H粗品与苯基氨基甲酸酯化β‑环糊精硅胶的重量比为1：10。

[0057] 洗脱：用含有质量百分比0.1％乙酸的洗脱液对层析柱进行梯度洗脱，洗脱液中乙醇的体积百分比浓度由40％逐步提高至50％，洗脱流速为每小时3个柱体积，第一个洗脱浓
度40％洗9个柱体积，43％洗12个柱体积，然后47％洗脱15个柱体积，最后50％洗脱，洗脱液
经HPLC进行跟踪监测，收集环孢菌素H含量95％以上的洗脱液；浓缩结晶：

[0058] 浓缩结晶：将洗脱步骤中收集的环孢菌素H含量95％以上的洗脱液用截留分子量不大于200的聚醚砜纳滤膜浓缩，浓缩至原体积的五分之一后，再用乙酸乙酯进行萃取，取
上相萃取液减压浓缩后得到稠状浓缩物，所述稠状浓缩物加入丙酮溶解过滤后，再依次加
入甲基叔丁基醚和去离子水，所述稠状浓缩物与丙酮、甲基叔丁基醚、去离子水的重量比为
1:3：1:0.001；最后逐步加入6倍体积的正己烷至溶液中出现白色不溶物，降温至4℃，析出
白色固体；

[0059] 干燥：过滤浓缩结晶步骤中析出的白色固体，将白色固体在40℃下进行干燥，得到环孢菌素H成品。

[0060] 将实施例3得到的环孢菌素H成品用HPLC和质谱仪进行检测分析，环孢菌素H，RT＝78min纯度99.4％。具体可见图6实施例3中制备的环孢菌素H成品的HPLC图和图7实施例3中
制备的环孢菌素H成品的质谱图。

[0061] 按照本方案纯化方法，可将环孢菌素H的纯度提高至99％以上，适合医药工业化的生产要求。

[0062] 需要说明的是，尽管在本文中已经对上述各实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修
改，或利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以
上技术方案运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围之内。