鸭新城疫、鸭瘟和鸭坦布苏病毒病的多重PCR检测引物

摘要

本发明公开了一种鸭新城疫、鸭瘟和鸭坦布苏病毒病的多重PCR检测引物，包括针对鸭新城疫病毒的引物、针对鸭瘟病毒的引物和针对鸭坦布苏病毒的引物，各类引物的序列如下：针对鸭新城疫病毒的引物：NDV‑F：5’‑TCCCAGYACCYYTGACMCTG‑3’，NDV‑R：5’‑CTGCCACTGCTAGTTGTGATAAT‑3’；针对鸭瘟病毒的引物：DPV‑F：5’‑TAGCGCATACTCGTTCTCCA‑3’，DPV‑R：5’‑TTACACACAGCGGTTGCAAG‑3’；针对鸭坦布苏病毒的引物：DTMUV‑F：5’‑TACTTGAGGCCAAGAATACG‑3’，DTMUV‑R：5’‑TTTGCCGTGATGGTCACACA‑3’。本发明建立的多重PCR体系可准确检测水禽NDV、DPV、DTMUV的单一或混合感染，并对该多重PCR体系进行了优化，确定了最佳的引物比例、引物浓度和Premix rTaq酶，使得NDV、DPV、DTMUV3种病毒的DNA扩增效果更好，检测精度更高，在病毒鉴别领域具有重要优势。

权利要求

1.一种鸭新城疫、鸭瘟和鸭坦布苏病毒病的多重PCR检测试剂组合，其特征在于，该试剂组合包括针对鸭新城疫病毒、鸭瘟病毒和鸭坦布苏病毒的三对引物、Premix rTaq酶和Nd2O3-TiO2纳米颗粒；

所述三对引物的序列如下：

针对鸭新城疫病毒的引物：

NDV-F：5’ -TCCCAGYACCYYTGACMCTG -3’，NDV-R：5’ - CTGCCACTGCTAGTTGTGATAAT -3’；

针对鸭瘟病毒的引物：

DPV-F：5’ - TAGCGCATACTCGTTCTCCA -3’，DPV-R：5’ - TTACACACAGCGGTTGCAAG -3’；

针对鸭坦布苏病毒的引物：

DTMUV-F：5’ - TACTTGAGGCCAAGAATACG -3’，DTMUV-R：5’ - TTTGCCGTGATGGTCACACA -3’。

2.根据权利要求1所述的一种多重PCR检测试剂组合，其特征在于，所述检测试剂组合用于检测水禽NDV、DPV、DTMUV的单一感染或混合感染。

3.根据权利要求1所述的一种多重PCR检测试剂组合，其特征在于，所述检测试剂组合总体积为20μL，其中：所述Premix rTaq酶10μL；所述针对鸭新城疫病毒的引物0  .5μL，NDV-F和NDV-R各0  .25μL；针对鸭瘟病毒的引物3μL，DPV-F和DPV-R各1 .5μL；针对鸭坦布苏病毒的引物2μL，DTMUV-F和DTMUV-R各1μL；DNA模板3μL；加灭菌水至总体积为20 μL；所述Premix rTaq酶中溶质的浓度为10μmoL/L。

4.根据权利要求1所述的一种多重PCR检测试剂组合，其特征在于，所述Nd2O3-TiO2纳米颗粒的含量≤1 .52μmol/L，所述Nd2O3-TiO2纳米颗粒的制备方法为：

1) 将TiO2粉末浸泡在溶质质量分数为5%～10%的Nd(NO3)3溶液中，对溶液进行超声波分散10min以上；

2) 将步骤1)中的溶液过滤收集固相，固相在100～120℃环境下烘干处理，烘干后将固相400℃煅烧10min，煅烧后的固相自然冷却至室温，再浸泡在步骤1)所述的Nd (NO3)3溶液中，超声波分散10min以上；

3) 浸泡完成后过滤收集固相，固相在100～120℃环境下烘干处理，烘干后将固相于

400℃煅烧1h，煅烧后自然冷却，即获得Nd2O3-TiO2颗粒；

4) 将所述Nd2O3-TiO2颗粒进行球磨，球磨后过10000目以上的筛网，收集过筛粉末，即为Nd2O3-TiO2纳米颗粒。

5.根据权利要求1所述的一种多重PCR检测试剂组合，其特征在于，所述Nd2O3-TiO2纳米颗粒加入多重PCR检测试剂组合前，先做表面处理，处理步骤为：(1) 配制处理液：所述处理液为浓度为0 .03～0 .06mol/L的硝酸溶液；

(2) 表面处理：将所述Nd2O3-TiO2纳米颗粒加入所述硝酸溶液中，对溶液充分搅拌，搅拌过程中向溶液中加入柠檬酸，使得溶液中柠檬酸的浓度为0 .01～0 .02mol/L；

(3) 柠檬酸充分溶解后，再对溶液搅拌5～10min，搅拌完成后固液分离，固相用去离子水洗净烘干，即获得表面处理后的Nd2O3-TiO2纳米颗粒。

6.一种利用如权利要求1～5任一项所述的多重PCR检测试剂组合进行的不以疾病诊断治疗为目的的病毒检测方法，其特征在于，步骤包括：

1) 提取待检测临床样品组织中的病毒DNA和RNA；

2) 将所述RNA反转录为cDNA；

3) 利用所述多重PCR反应体系对所述病毒DNA和cDNA进行扩增；

4) 判断临床样品是否为NDV、DPV、DTMUV的单一感染或混合感染。

7.根据权利要求6所述的一种检测方法，其特征在于，所述步骤1)的提取方法具体为：采集死亡水禽的内脏组织作为待检测临床样品，将内脏组织与生理盐水按照质量比1:3的比例进行研磨后离心，使用离心柱型病毒DNA/RNA提取试剂盒提取组织中的病毒DNA和RNA。

8.根据权利要求6所述的一种检测方法，其特征在于，所述步骤2)的反转录反应条件为：用HiScript cDNA第一链合成试剂盒对所述RNA进行反转录：采用40 μL体系，于EP管中依次加入RNA模板16μL、随机引物2μL、2×RTMIX 20μL、HiScript Enzyme Mix 2μL，总体积共40μL，置于PCR仪中进行cDNA合成，以25℃5min、50℃ 45 min、85℃ 5 min、4℃ 5min的程序进行一个循环。

9.根据权利要求6所述的一种检测方法，其特征在于，所述步骤3)的扩增反应条件为：反应总体积为20μL：向所述多重PCR反应体系中加入所述组织中的病毒DNA和cDNA各1μL，加灭菌水至总体积为20 μL，扩增程序为95℃2min，95℃30s，53℃30 s，72℃45s，40个循环；然后72℃5min，再降温到4℃结束反应。

10.根据权利要求6所述的一种检测方法，其特征在于，测试扩增产物的电泳图，通过观察扩增产物电泳图是否包含相应病毒对应的预期条带，来判断临床样品是否为NDV、DPV、DTMUV的单一感染或混合感染，其中鸭新城疫病毒对应的预期条带为510bp，鸭瘟病毒对应的预期条带为400bp，鸭坦布苏病毒对应的预期条带为300bp。

说明书

鸭新城疫、鸭瘟和鸭坦布苏病毒病的多重PCR检测引物

技术领域

[0001] 本发明属于病毒检测技术领域，尤其涉及一种鸭新城疫、鸭瘟和鸭坦布苏病毒病的多重PCR检测引物。

背景技术

[0002] 鸭新城疫(Newcastle Disease，ND)是由鸭源新城疫病毒（NDV）引起的以消化道病变为主要特征、具有高度发病率和致死率的烈性传染病。传统理论认为新城疫病毒不感染水禽，即使感染也不发病，近年来新城疫病毒的致病力和宿主范围发生了变化，对鸭表现为高致病性，鸭群中流行的新城疫会给养鸭业造成较大损失。鸭瘟（Duck plague，DP）又称鸭病毒性肠炎（Duck viral enteritis，DVE），是由疱疹病毒科的鸭瘟病毒（DPV）引起的一种急性、热性、败血性传染病。该病流行广泛、传播迅速、发病率和死亡率均很高，严重威胁养鸭业的发展。ND和DP都有相同的临床症状，精神沉郁，两腿无力，呼吸困难，角弓反张，下痢，在临床上较难做出诊断。鸭坦布苏病毒病(Duck Tembusu virus disease，DTMUVD)是由鸭坦布苏病毒(DTMUV)引起的一种急性传染病。该病以高热、产蛋量骤降甚至停产和卵泡出血为主要特征，病程可长达数周。ND、DP、DTMUVD病与均能引起蛋鸭产蛋下降。

[0003] PCR全称为聚合酶链式反应，是目前应用广泛、简便、快速且特异性高的一种检测方法。PCR利用DNA高温变性、低温复性、适温延伸的特性，设计变性、退火、延伸为一个周期，不断循环复制DNA，使得到大量的PCR产物易于检测。多重PCR与常规PCR的原理相同，但在同一反应管加入多对引物，使之同时扩增出多条目的DNA片段。该法既克服了常规PCR一次只能检测一种病毒、检测结果易出现假阳性的不足，具有较高的灵敏度和特异性。目前检测鸭新城疫、鸭瘟和鸭坦布苏病毒病这3种病毒大多采用常规PCR方法，要做多次检测，不仅费时费力，还可能造成误诊。

[0004] 另外，由于纳米粒子的特殊效应，纳米科学是当今世界投入最多发展最快的科技之一，目前纳米粒子可以用到许多方面。一些学者把寻找新型添加剂的目光投向了纳米粒子。例如中国发明专利申请CN107058619A公开了一种牛呼吸道合胞体病毒nano-PCR检测试剂盒，该试剂盒包括：MightyAmp酶、2xBuffer Mix缓冲液、金纳米颗粒溶胶、无菌双蒸水、一对特异性引物和一个牛呼吸道合胞体病毒阳性对照质粒，该试剂盒灵敏度高；专利CN101134975A中使用的优化PCR扩增的纳米材料为纳米碳粉，与已有的PCR 扩增优化剂相比，纳米碳粉优化扩增的效果明显；专利CN101792787A公开了一种组合纳米材料优化PCR的方法，通过向扩增体系中加入胶体HAuCl4和有机试剂，实现扩增目的基因的特异性，效果非常明显。但是金纳米颗粒溶胶的制造成本较高，较难大规模推广应用，纳米碳粉虽然成本较低，但是对扩增反应的优化有限，效果常常不够理想；另外，申请人通过大量试验发现，鸭新城疫、鸭瘟和鸭坦布苏病毒病的cDNA或DNA具有一定的特异性，现有的金纳米颗粒溶胶和纳米碳粉对其扩增的优化效果不佳，不能满足扩增要求。

发明内容

[0005] 针对现有技术的不足之处，本发明通过优化扩增条件，建立了一种可准确检测NDV、DPV、DTMUV的单一或混合感染的多重PCR检测引物和检测方法。

[0006] 为实现上述目的，本发明提供了一种鸭新城疫、鸭瘟和鸭坦布苏病毒病的多重PCR检测引物，包括针对鸭新城疫病毒的引物、针对鸭瘟病毒的引物和针对鸭坦布苏病毒的引物，各类引物的序列如下：

[0007] 针对鸭新城疫病毒的引物：

[0008] NDV-F：5’ -TCCCAGYACCYYTGACMCTG -3’，

[0009] NDV-R：5’ - CTGCCACTGCTAGTTGTGATAAT -3’；

[0010] 针对鸭瘟病毒的引物：

[0011] DPV-F：5’ - TAGCGCATACTCGTTCTCCA -3’，

[0012] DPV-R：5’ - TTACACACAGCGGTTGCAAG -3’；

[0013] 针对鸭坦布苏病毒的引物：

[0014] DTMUV-F：5’ - TACTTGAGGCCAAGAATACG -3’，

[0015] DTMUV-R：5’ - TTTGCCGTGATGGTCACACA -3’。

[0016] 本发明还公开了一种多重PCR反应体系，所述反应体系包含上述各类引物，所述反应体系用于检测水禽NDV、DPV、DTMUV的单一感染或混合感染。

[0017] 本发明还公开了一种多重PCR反应体系，所述多重PCR反应体系总体积为20μL，其中：所述Premix rTaq酶10μL；所述针对鸭新城疫病毒的引物0.5μL，NDV-F和NDV-R各0.25μL；针对鸭瘟病毒的引物3μL，DPV-F和DPV-R各1.5μL；针对鸭坦布苏病毒的引物2μL，DTMUV-F和DTMUV-R各1μL；DNA模板3μL；加灭菌水至总体积为20 μL；所述Premix rTaq酶中溶质的浓度为10μmoL/L。

[0018] 进一步地，所述多重PCR反应体系还包括Nd2O3-TiO2纳米颗粒，反应体系中，所述Nd2O3-TiO2纳米颗粒的含量≤1.52μmol/L，所述Nd2O3-TiO2纳米颗粒的制备方法为：

[0019] 1) 将TiO2粉末浸泡在溶质质量份数为5%～10%的Nd(NO3)3溶液中，对溶液进行超声波分散10min以上；

[0020] 2) 将步骤1)中的溶液过滤收集固相，固相在100～120℃环境下烘干处理，烘干后将固相400℃煅烧10min，煅烧后的固相自然冷却至室温，再浸泡在步骤1)所述的Nd(NO3)3溶液中，超声波分散10min以上；

[0021] 3) 浸泡完成后过滤收集固相，固相在100～120℃环境下烘干处理，烘干后将固相于400℃煅烧1h，煅烧后自然冷却，即获得Nd2O3-TiO2颗粒；

[0022] 4) 将所述Nd2O3-TiO2颗粒进行球磨，球磨后过10000目以上的筛网，收集过筛粉末，即为Nd2O3-TiO2纳米颗粒。

[0023] 进一步地，所述Nd2O3-TiO2纳米颗粒加入多重PCR反应体系前，先做表面处理，处理步骤为：

[0024] (1) 配制处理液：所述处理液为浓度为0.03～0.06mol/L的硝酸溶液；

[0025] (2) 表面处理：将所述Nd2O3-TiO2纳米颗粒加入所述硝酸溶液中，对溶液充分搅拌，搅拌过程中向溶液中加入柠檬酸，使得溶液中柠檬酸的浓度为0.01～0.02mol/L；

[0026] (3) 柠檬酸充分溶解后，再对溶液搅拌5～10min，搅拌完成后固液分离，固相用去离子水洗净烘干，即获得表面处理后的Nd2O3-TiO2纳米颗粒。

[0027] 本发明还公开了利用上述多重PCR反应体系进行的不以疾病诊断治疗为目的的病毒检测方法，步骤包括：

[0028] 1) 提取待检测临床样品组织中的病毒DNA和RNA；

[0029] 2) 将所述RNA反转录为cDNA；

[0030] 3) 利用所述多重PCR反应体系对所述病毒DNA和cDNA进行扩增；

[0031] 4) 判断临床样品是否为NDV、DPV、DTMUV的单一感染或混合感染。

[0032] 进一步地，所述步骤1)的提取方法具体为：采集死亡水禽的内脏组织作为待检测临床样品，将内脏组织与生理盐水按照质量比1:3的比例进行研磨后离心，使用离心柱型病毒DNA/RNA提取试剂盒提取组织中的病毒DNA和RNA。

[0033] 进一步地，所述步骤2)的反转录反应条件为：用HiScript cDNA第一链合成试剂盒对所述RNA进行反转录：采用40 μL体系，于EP管中依次加入RNA模板16μL、随机引物2μL、2×RTMIX 20μL、HiScript Enzyme Mix 2μL，总体积共40μL，置于PCR仪中进行cDNA合成，以25℃5min、50℃ 45 min、85℃ 5 min、4℃ 5min的程序进行一个循环。

[0034] 进一步地，所述步骤3)的扩增反应条件为：反应总体积为20μL：向所述多重PCR反应体系中加入所述组织中的病毒DNA和cDNA各1μL，加灭菌水至总体积为20 μL，扩增程序为95℃2min，95℃30s，53℃30 s，72℃45s，40个循环；然后72℃5min，再降温到4℃结束反应。

[0035] 进一步地，测试扩增产物的电泳图，通过观察扩增产物电泳图是否包含相应病毒对应的预期条带，来判断临床样品是否为NDV、DPV、DTMUV的单一感染或混合感染，其中鸭新城疫病毒对应的预期条带为510bp，鸭瘟病毒对应的预期条带为400bp，鸭坦布苏病毒对应的预期条带为300bp。

[0036] 从以上技术方案可以看出，本发明的优点是：

[0037] 1. 本发明建立的多重PCR体系可准确检测水禽NDV、DPV、DTMUV的单一或混合感染，并对该多重PCR体系进行了优化，确定了最佳的引物比例、引物浓度和Premix rTaq酶，使得NDV、DPV、DTMUV3种病毒的DNA扩增效果更好，检测精度更高，在病毒鉴别领域具有重要优势；

[0038] 2. 本发明在多重PCR体系中引入Nd2O3-TiO2纳米材料，对扩增反应具有明显的优化效果，且针对鸭新城疫病毒、鸭瘟病毒和鸭坦布苏病毒的DNA或反转录cDNA的扩增反应，比金纳米颗粒溶胶具有更加优良的优化效果。

附图说明

[0039] 图1为初始反应条件下多重PCR反应后检测的电泳图，

[0040] 其中：M：DNA分子量标准；1：鸭新城疫病毒；2：鸭坦布苏病毒；3：鸭瘟病毒；4：鸭新城疫病毒、鸭瘟病毒和鸭坦布苏病毒混合物；

[0041] 图2为最佳多重PCR反应条件下检测的电泳图，

[0042] 其中：M：DNA分子量标准；1：鸭新城疫病毒、鸭瘟病毒和鸭坦布苏病毒混合物；2：鸭新城疫病毒；3：鸭瘟病毒；4：鸭坦布苏病毒；5：阴性对照；

[0043] 图3为多重PCR特异性试验的电泳图，

[0044] 其中：M：DNA分子量标准；1：鸭新城疫病毒、鸭瘟病毒和鸭坦布苏病毒混合物；2：鸭新城疫病毒；3：鸭瘟病毒；4：鸭坦布苏病毒；5：鸭呼肠孤病毒；6：鸭细小病毒；7：鸭圆环病毒；8：鸭肝炎病毒；9：H9亚型禽流感病毒；10：阴性对照；

[0045] 图4为多重PCR敏感性试验的电泳图，

[0046] 其中：

[0047] M为DNA分子量标准(DNA Marker)，8.20×104拷贝/μL、2.86×104拷贝/μL、9.38×104拷贝/μL；

[0048] 1为 8.20×104拷贝/μL鸭新城疫病毒(NDV)，2.86×104拷贝/μL 鸭瘟病毒( DPV)，4
9.38×10拷贝/μL鸭坦布苏病毒(DTMUV)；

[0049] 2为4.10×104拷贝/μL鸭新城疫病毒(NDV)，1.43×104拷贝/μL鸭瘟病毒( DPV)， 4.69×104拷贝/μL鸭坦布苏病毒(DTMUV)；

[0050] 3为2.05×104拷贝/μL鸭新城疫病毒(NDV)，7.15×103拷贝/μL鸭瘟病毒( DPV)，4
2.35×10拷贝/μL鸭坦布苏病毒(DTMUV)；

[0051] 4为1.02×104拷贝/μL鸭新城疫病毒(NDV)，3.50×103拷贝/μL鸭瘟病毒( DPV)，1.17×104拷贝/μL 鸭坦布苏病毒(DTMUV)；

[0052] 5为5.10×103拷贝/μL鸭新城疫病毒(NDV)，1.75×103拷贝/μL鸭瘟病毒( DPV)，3
5.85×10拷贝/μL鸭坦布苏病毒(DTMUV)；

[0053] 6为2.55×103拷贝/μL鸭新城疫病毒(NDV)，8.75×102拷贝/μL鸭瘟病毒( DPV)，2.92×103拷贝/μL鸭坦布苏病毒(DTMUV)；

[0054] 7为阴性对照(Negative control)；

[0055] 图5为单项PCR与多重PCR临床样品检测的电泳图，

[0056] 其中：M：DNA分子量标准；1,2：鸭新城疫单一PCR样品；3,4：鸭新城疫多重PCR样品；5,6：鸭瘟单项PCR样品；7,8：鸭瘟多重PCR样品；9,10：鸭坦布苏单一PCR样品；11,12：鸭坦布苏多重PCR样品。

[0057] 图6为最佳多重PCR反应条件下，添加与不添加纳米材料添加剂、添加剂种类不同的情况下各扩增产物检测的电泳图，

[0058] 其中：DNA分子量标准；1：对比例4所得扩增产物测得的电泳图；2～5：对比例1所得扩增产物测得的电泳图，2对应0.76μmol/L的Nd2O3-TiO2纳米颗粒含量、3对应1.11μmol/L的Nd2O3-TiO2纳米颗粒含量、4对应1.34μmol/L的Nd2O3-TiO2纳米颗粒含量、5对应1.52μmol/L的Nd2O3-TiO2纳米颗粒含量；6：对比例2所得扩增产物测得的电泳图；7：对比例3所得扩增产物测得的电泳图。

具体实施方式

实施例

[0059] 1 材料与方法

[0060] 1.1 病毒株 鸭新城疫毒株(NDV)、鸭瘟毒株(DPV)、鸭坦布苏毒株(DTMUV)、鸭肝炎病毒(DHV)、H9亚型禽流感(H9 AIV)、鸭圆环病毒(DuCV)、番鸭细小病毒(MDPV)、番鸭呼肠孤病毒(MDRV)，均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所禽病研究室提供。

[0061] 1.2 主要试剂 离心柱型病毒DNA/RNA提取试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；HiScript cDNA第一链合成试剂盒与Premix rTaq酶购自南京诺唯赞生物科技有限公司；DL2000 DNA Marker购自英特生物有限公司。

[0062] 1.3 试验方法

[0063] 1.3.1 引物设计与合成 设计3对能同时扩增3种鸭病原的特异性引物，置-20℃保存备用。3对引物序列如表1所示：

[0064]

[0065] 1.3.2 病毒核酸提取和cDNA合成 利用Easypure Viral DNA/RNA Kit（离心柱型病毒DNA/RNA提取试剂盒）提取DPV DNA、MDPV DNA、DuCV DNA及NDV RNA、DTMUV RNA、MDRV RNA、DHV RNA、H9 AIV RNA，用HiScript cDNA第一链合成试剂盒对NDV RNA、DTMUV RNA、MDRV RNA、DHV RNA及H9 AIV RNA进行反转录：采用40 μL体系，于EP 管中依次加入RNA模板16μL、随机引物2μL、2×RTMIX 20μL、HiScript Enzyme Mix 2μL，总体积共40μL，置于PCR仪中进行cDNA合成，以25℃5min、50℃45 min、85℃5 min、4℃5min的程序进行一个循环，cDNA合成后-20℃保存备用。

[0066] 1.3.3 多重PCR反应条件的确定 多重PCR反应在20μL反应体系中进行。先以初始反应条件进行多重PCR反应，反应后测试电泳图如图1所示，其中初始反应条件为：Premix rTaq酶(溶质的浓度为10μmoL/L)10 μL，NDV引物0.5μL (NDV-F、NDV-R各0.25μL)，DPV引物0.5μL(DPV-F、DPV-R各0.25μL)，DTMUV引物0.5μL(DTMUV-F、DTMUV-R各0.25μL)，DTMUV cDNA、NDV cDNA、DPV DNA各1μL，加灭菌水至总体积为20 μL，扩增程序为95℃2min，95℃
30s，53℃30 s，72℃45s，40个循环；72℃5min，4℃结束反应。如图1所示，鸭瘟病毒和鸭坦布苏病毒对应的条带不清晰，影响试验观测，因此需要对各引物浓度进行调整，以确定最佳的PCR反应条件。

[0067] 1.3.4 多重PCR特异性试验 采用最佳的PCR反应条件，以NDV cDNA、DTMUV cDNA、H9 AIV cDNA、DHV cDNA、MDRV cDNA和DPV DNA、MDPV DNA、DuCV DNA作为待测样品进行检测，并以无菌水作为阴性对照，检测多重PCR特异性。

[0068] 1.3.5 多重PCR的敏感性试验 在确定的最佳PCR反应条件下将提取的DPV DNA、NDV cDNA、DTMUV cDNA，用Thermofisher QBUIT3荧光光度计测定其浓度，并按2倍递增稀释，各取1μL进行PCR检测，以其最高稀释倍数扩增呈阳性为其PCR的敏感度。

[0069] 1.3.6 临床样品的检测 采用最佳的PCR反应条件对江西地区鸭群收集250份临床样品进行临床检测，采集死亡鸭样品的肝脏、胰、脾组织，与生理盐水按照1:3的比例进行研磨后离心，使用Easypure Viral DNA/RNA Kit（离心柱型病毒DNA/RNA提取试剂盒）提取病毒DNA/RNA，采用最佳的PCR反应条件进行反应，计算阳性率。

[0070] 2 结果

[0071] 2.1 最佳多重PCR反应条件的建立 最佳多重PCR反应条件为总体积20μL：Premix rTaq酶 (10μmoL/L)10μL，NDV引物0.5 μL(NDV-F、NDV-R各0.25μL)，DPV引物3μL(DPV-F、DPV-R各1.5μL)，DTMUV引物2μL(DTMUV-F、DTMUV-R各1μL)，DTMUV cDNA、NDV cDNA、DPV DNA各1μL，加灭菌水至总体积为20 μL。扩增程序为95℃2min，95℃30s，53℃30 s，72℃45s，40个循环；72℃5min，4℃结束反应。结果显示，NDV、DPV、DTMUV的目的条带与预期相符，分别为510bp、400bp、300 bp条带，如图2所示。

[0072] 2.2 特异性试验 对含有NDV、DPV、DTMUV核酸样品进行检测，均能扩增出与预期相符的510bp、400bp、300 bp条带，混合模板扩增的产物条带清晰，亮度相近，在相同条件下，而其他鸭病病原体并未出现特异性条带，表明该方法具有良好的特异性，电泳测试结构如图3所示。

[0073] 2.3 敏感性试验 用Thermofisher Qubit3荧光光度计测得NDV、DPV、DTMUV的浓度分别为8.20×104拷贝/μL、2.86×104拷贝/μL、9.38×104拷贝/μL，应用优化后的多重PCR方法对2倍稀释的混合DNA/cDNA进行检测，结果表明，该多重PCR对NDV、DPV、DTMUV的检测极限分别为1.02×104拷贝/μL、3.50×103拷贝/μL和1.17×104拷贝/μL，如图4所示。

[0074] 2.4 临床样品检测 采用最佳的PCR反应条件对江西地区鸭群收集250份临床样品进行临床检测，结果如表2和图4所示：检测出NDV13份（阳性率为5.20%），DPV4份（阳性率为1.60%），DTMUV12份（阳性率为4.80%），其中NDV和DTMUV混合感染病例2例；利用常规单一PCR方法，对同一组临床样品进行检测，结果如表2和图5所示：同样地，检测出NDV13份（阳性率为5.20%），DPV4份（阳性率为1.60%），DTMUV12份（阳性率为4.80%），其中NDV和DTMUV混合感染病例2例。常规单一与多重 PCR检测对比，结果两者的符合率为100%。

[0075]

[0076] 为了验证Nd2O3-TiO2纳米材料在多重PCR反应体系中对鸭新城疫病毒、鸭瘟病毒和鸭坦布苏病毒的DNA或反转录cDNA扩增反应的优化作用，设计以下对比试验：

[0077] 对比例1

[0078] 多重PCR反应条件为总体积20μL：Premix rTaq酶 (10μmoL/L)10μL，NDV引物0.5 μL(NDV-F、NDV-R各0.25μL)，DPV引物3μL(DPV-F、DPV-R各1.5μL)，DTMUV引物2μL(DTMUV-F、DTMUV-R各1μL)，DTMUV cDNA、NDV cDNA、DPV DNA各1μL。将Nd2O3-TiO2纳米颗粒搅拌并超声波分散在灭菌水中形成悬浮液，向反应体系中加入该悬浮液至体系总体积为20 μL。配制多组PCR反应体系，严格控制Nd2O3-TiO2纳米颗粒的加入量，使得各组PCR反应体系中Nd2O3-TiO2纳米颗粒的含量分别为：0.76μmol/L、1.11μmol/L、1.34μmol/L和1.52μmol/L。

[0079] 各组PCR反应体系中加入的Nd2O3-TiO2纳米颗粒制备方法均相同，方法为：

[0080] 1) 将TiO2粉末浸泡在溶质质量份数为10%的Nd(NO3)3溶液中，对溶液进行超声波分散10min；

[0081] 2) 将步骤1)中的溶液过滤收集固相，固相在100～120℃环境下烘干处理，烘干后将固相400℃煅烧10min，煅烧后的固相自然冷却至室温，再浸泡在步骤1)所述的Nd(NO3)3溶液中，超声波分散10min；

[0082] 3) 浸泡完成后过滤收集固相，固相在100～120℃环境下烘干处理，烘干后将固相于400℃煅烧1h，煅烧后自然冷却，即获得Nd2O3-TiO2颗粒；

[0083] 4) 将所述Nd2O3-TiO2颗粒进行球磨，球磨后过10000目的筛网，收集过筛粉末，即为Nd2O3-TiO2纳米颗粒。

[0084] 各组PCR反应体系的扩增程序均为95℃2min，95℃30s，53℃30 s，72℃45s，20个循环；72℃5min，4℃结束反应。反应结束后对扩增产物进行电泳检测，结果如图6所示。

[0085] 对比例2

[0086] 多重PCR反应条件为总体积20μL：Premix rTaq酶 (10μmoL/L)10μL，NDV引物0.5 μL(NDV-F、NDV-R各0.25μL)，DPV引物3μL(DPV-F、DPV-R各1.5μL)，DTMUV引物2μL(DTMUV-F、DTMUV-R各1μL)，DTMUV cDNA、NDV cDNA、DPV DNA各1μL，金纳米颗粒溶胶0.7μL，加灭菌水至总体积为20 μL。其中金纳米颗粒溶胶的直径为20nm，浓度为0.5μg/μL。

[0087] 本对比例PCR反应体系的扩增程序均为95℃2min，95℃30s，53℃30 s，72℃45s，20个循环；72℃5min，4℃结束反应。反应结束后对扩增产物进行电泳检测，结果如图6所示。

[0088] 对比例3

[0089] 多重PCR反应条件为总体积20μL：Premix rTaq酶 (10μmoL/L)10μL，NDV引物0.5 μL(NDV-F、NDV-R各0.25μL)，DPV引物3μL(DPV-F、DPV-R各1.5μL)，DTMUV引物2μL(DTMUV-F、DTMUV-R各1μL)，DTMUV cDNA、NDV cDNA、DPV DNA各1μL。将表面处理后的Nd2O3-TiO2纳米颗粒搅拌并超声波分散在灭菌水中形成悬浮液，向反应体系中加入该悬浮液至体系总体积为20 μL。该对比例PCR反应体系中，经过表面处理后的Nd2O3-TiO2纳米颗粒的含量为1.11μmol/L。所述Nd2O3-TiO2纳米颗粒的制备方法和对比例1完全相同，表面处理的方法为：

[0090] (1) 配制处理液：所述处理液为浓度为0.03mol/L的硝酸溶液；

[0091] (2) 表面处理：将所述Nd2O3-TiO2纳米颗粒加入所述硝酸溶液中，对溶液充分搅拌，搅拌过程中向溶液中加入柠檬酸，使得溶液中柠檬酸的浓度为0.01mol/L；

[0092] (3) 柠檬酸充分溶解后，再对溶液搅拌8min，搅拌完成后固液分离，固相用去离子水洗净烘干，即获得表面处理后的Nd2O3-TiO2纳米颗粒。

[0093] 本对比例PCR反应体系的扩增程序均为95℃2min，95℃30s，53℃30 s，72℃45s，20个循环；72℃5min，4℃结束反应。反应结束后对扩增产物进行电泳检测，结果如图6所示。

[0094] 对比例4

[0095] 采用本发明所述的最佳多重PCR反应条件(不含纳米材料添加剂)作为对比试验，最佳多重PCR反应条件为总体积20μL：Premix rTaq酶 (10μmoL/L)10μL，NDV引物0.5 μL(NDV-F、NDV-R各0.25μL)，DPV引物3μL(DPV-F、DPV-R各1.5μL)，DTMUV引物2μL(DTMUV-F、DTMUV-R各1μL)，DTMUV cDNA、NDV cDNA、DPV DNA各1μL，加灭菌水至总体积为20 μL。扩增程序为95℃2min，95℃30s，53℃30 s，72℃45s，20个循环(比上述40个循环减少一倍)；72℃5min，4℃结束反应。反应结束后对扩增产物进行电泳检测，结果如图6所示。

[0096] 由图6可知，在多重PCR体系中引入Nd2O3-TiO2纳米材料，对扩增反应具有明显的优化效果，扩增产物电泳图中，鸭新城疫病毒、鸭瘟病毒和鸭坦布苏病毒对应的条带更加清晰，扩增效果更好。另外由图可以看出，Nd2O3-TiO2纳米材料比金纳米颗粒溶胶对这三种病毒的DNA或RNA反转录cDNA的扩增反应具有更加优良的优化效果，表现为对应条带更加清晰。针对这三种病毒，金纳米颗粒溶胶几乎起不到明显地优化效果。经过本发明所述表面处理后的Nd2O3-TiO2纳米材料相比于未进行表面处理的材料，对扩增反应具有进一步地优化效应，尤其是鸭新城疫病毒对应的条带更加清楚。

[0097] 以上对本发明所提供的技术方案进行了详细介绍，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。