一种灵敏高选择性好的检测水体中BPA的方法

摘要

本发明公开了一种灵敏高选择性好的检测水体中BPA的方法，当水体中有目标物BPA存在时，标记荧光染料AHN的适配体，从与捕获探针互补而成的双螺旋结构中释放出来，与BPA特异性结合并将其包裹，磁分离后上清液中能检测到荧光；在没有BPA的情况下，AHN标记的适配体仍然与捕获探针杂交，磁分离后上清液中没有荧光信号。本发明的方法，在450nm激发波长下，感应系统的荧光强度随BPA浓度变化而变化，其检测BPA的线性范围为0~8.00ng/mL，检测限为0.047ng/mL，具有很强的抗干扰能力，可用于检测低浓度的BPA，具有高的灵敏度。此外，NH2‑Fe3O4可以回收再利用，可以节省成本。

权利要求

1.一种灵敏高选择性好的检测水体中BPA的方法，其特征在于，当水体中有目标物BPA存在时，标记荧光染料AHN的适配体，从与捕获探针互补而成的双螺旋结构中释放出来，与BPA特异性结合并将其包裹，磁分离后上清液中能检测到荧光；在没有BPA的情况下，AHN标记的适配体仍然与捕获探针杂交，磁分离后上清液中没有荧光信号；所述适配体较之与捕获探针杂交互补，更倾向于与目标污染物BPA特异性结合并将其包裹；所述磁分离是利用磁铁对磁性纳米颗粒的磁性吸附，从而达到富集的效果，容易分离。

2.根据权利要求1所述的灵敏高选择性好的检测水体中BPA的方法，其特征在于，所述荧光染料AHN的分子式为：C16H17O3N3，结构式为：

3.根据权利要求1所述的灵敏高选择性好的检测水体中BPA的方法，其特征在于，所述荧光染料AHN通过酰胺键标记在适配体任一端。

4.根据权利要求1所述的灵敏高选择性好的检测水体中BPA的方法，其特征在于，所述捕获探针是依据BPA适配体碱基互补配对的原则设计。

5.根据权利要求1所述的灵敏高选择性好的检测水体中BPA的方法，其特征在于，所述捕获探针与带氨基的磁性纳米颗粒通过酰胺键相连。

说明书

一种灵敏高选择性好的检测水体中BPA的方法

技术领域

[0001] 本发明主要涉及到环境监测技术领域，具体涉及一种利用磁性分离荧光适配体传感器高灵敏、有选择的检测水中双酚A(BPA)的方法。技术背景

[0002] 如今，环境内分泌激素已成为危害人类的污染物，其中BPA起着重要的作用。BPA的结构类似于内分泌激素的结构，由于存在苯酚基团，可以结合雌激素受体。BPA主要用于生产聚碳酸酯、环氧树脂、聚苯醚树脂、不饱和聚酯树脂等高分子材料；并广泛应用于增塑剂、阻燃剂、抗氧化剂、热稳定剂、橡胶抗氧化剂、农药、涂料等精细化工产品中。虽然双酚A在生产生活中有很多用途，但双酚A对人体仍然具有较强危害性，其可能导致内分泌紊乱，威胁到胎儿和儿童的健康，并且由癌症和代谢紊乱引起的肥胖也被认为与之相关。

[0003] 由于上述这些危害，对BPA的有效检测是非常有必要的。BPA的传统分析技术，包括高效液相色谱、液相色谱-质谱、气相色谱-质谱、酶联免疫吸附测定、免疫测定和生化分析。虽然有多种检测BPA的方法，但仍然需要寻找新的、简单的、反应温和且灵敏度高的监测方法。

[0004] 荧光分析是一种极具吸引力的分析方法。荧光方法的最重要特点是灵敏度高、选择性好、使用方便。最近，涉及磁性纳米材料，特别是磁性石墨烯氧化物或/和改性的Fe3O4纳米颗粒的荧光方法已被用于生化分析研究。超顺磁磁性材料由于其特殊的磁性和低毒性，在生化分析和药物中应用相当广泛。检测过程中的磁分离和浓缩是提高分析方法灵敏度的重要途径。它不仅增加了目标监测物的浓度，而且能使目标与复杂环境或生物样品分离，降低了干扰物质的浓度。如今，新型传感和生物传感技术的发展已经成为关注的焦点，与其同时建立起的适配体技术也引起了很多关注。适配体是一种短单链DNA或RNA序列，可以在体外筛选，并可以与相应配体进行高亲和力和特异性结合。此外，基于适配体策略的方法可以有效地提供简单快速、低成本的并且能得到令人满意的选择性的检测效果。适配体相较于抗体而言，已广泛用于检测各种目标物。因此，基于适配体的传感系统已被广泛用于分子分析和医学诊断。考虑到并结合了磁性纳米粒子和适配体的优点，本发明构建了一种用于高灵敏检测双酚A的磁性分离荧光法。

发明内容

[0005] 发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种灵敏高选择性好的检测水体中BPA的方法，高灵敏、有选择，可以用于BPA低浓度的检测，所用到材料可以回收再利用。

[0006] 技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

[0007] 一种灵敏高选择性好的检测水体中BPA的方法，当水体中有目标物BPA存在时，标记荧光染料AHN的适配体，从与捕获探针互补而成的双螺旋结构中释放出来，与BPA特异性结合并将其包裹，磁分离后上清液中能检测到荧光；在水体中没有BPA的情况下，AHN标记的适配体仍然与捕获探针杂交，磁分离后上清液中没有荧光信号。

[0008] 所述荧光染料AHN具有良好的水溶性和热稳定性，具有强烈的荧光，其分子式为：C16H17O3N3，结构式为：

[0009]

[0010] 所述荧光染料AHN通过酰胺键标记在适配体任一端。

[0011] 所述捕获探针是依据BPA适配体碱基互补配对的原则设计。

[0012] 所述捕获探针与带氨基的磁性纳米颗粒通过酰胺键相连。

[0013] 所述适配体较之与捕获探针杂交互补，更倾向于与目标污染物BPA特异性结合。

[0014] 所述磁分离是利用磁铁对磁性纳米颗粒的磁性吸附，从而达到富集的效果，提高方法灵敏度。

[0015] 有益效果：与现有技术相比，本发明的灵敏高选择性好的检测水体中BPA的方法，所采用的适配体传感器具有很强的抗干扰能力，可用于检测低浓度的B PA，也具有高的灵敏度。此外，带氨基的磁性纳米颗粒可以回收再利用，这样可以节省成本。

附图说明

[0016] 图1是灵敏高选择性好的检测水体中BPA的方法的原理图；

[0017] 图2是传感器检测不同浓度BPA的荧光发射光谱图；

[0018] 图3是BPA浓度和荧光强度的曲线图；

[0019] 图4是对本发明方法抗干扰能力的结果图。

具体实施方式

[0020] 下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明

[0021] 实施例1

[0022] 捕获探针-纳米颗粒复合物的制备：1nmol捕获探针溶液(DNA片段，购自上海生工，捕获探针序列：5’-COOH-TGGTGCGAACCCGTGATGCG-3’)与0.2mL 5μM EDAC在5mL离心管中混合5分钟，加入0.2mL 5μM NHS混合2分钟，最后加入2mL 1mg/mL氨基四氧化三铁纳米颗粒溶液于离心管中，保持溶液pH为7.2。将离心管置于恒温震荡箱中培育2小时。然后将其转移至4℃的冰箱中过夜以使未反应的EDAC失活。最后，得到了捕获探针-纳米颗粒复合物。

[0023] AHN标记的适配体的制备：2nmol适配体溶液(DNA片段，购自上海生工，适配体序列：5’-COOH-CCGGTGGGTGGTCAGGTGGGATAGCGTTCCGCGT ATGGCCCAGCGCATCACGGGTTCGCACCA-3’)与10μM EDAC在5mL离心管中混合5分钟，加入10μM NHS，混合2分钟，最后加入2.5μM溶于PBS的AHN溶液，保持溶液pH为7.2。将离心管置于恒温震荡箱中培育2小时。然后将其转移至
4℃的冰箱中过夜以使未反应的EDAC失活。最后，透析溶液数次以除去未连接的AHN。这样就将具有良好荧光性质的AHN标记在BPA适配体上。

[0024] 本发明的灵敏高选择性好的检测水体中BPA的方法，过程如下：

[0025] 对于BPA检测，将300μL PBS溶液加入到离心管中，然后加入50μL捕获探针-纳米颗粒复合物和50μL AHN标记的BPA适配体，将混合溶液摇匀，然后在室温下培育20分钟后取出，用磁铁进行磁性分离，将上清液倒掉；加入320μL PBS溶液于离心管中，将捕获探针-纳米颗粒重新悬浮于溶液中，然后向溶液中加入80μL的100ng/mL BPA，并将混合物在室温下培育10分钟。再次将离心管放置在磁体上以分离捕获探针-纳米颗粒与上清液。最后，测定上清液的荧光强度。

[0026] 测定结果如图2所示，从上到下BPA的浓度逐渐递增，分别为0.20，0.60，1.00，1.50，2.00，4.00，6.00，8.00，10.0，20.0，30.0，40.0，50.0，60.0，100ng/mL。荧光仪狭缝宽度各设10nm。

[0027] 如图3所示，BPA浓度越高，检测到的荧光强度也越高，并且当BPA浓度在0～8.00ng/mL范围内时，BPA浓度与荧光强度呈现出了良好的线性关系。

[0028] 检测限根据公式 计算得出，其中S为空白对照的标准偏差，K为回归方程的斜率， 为背景荧光强度的平均值，b为线性回归方程的截距。该方法的线性回归方程为Y＝212716X+1041206，R2＝0.9984。最后算得检测限为0.047ng/mL。

[0029] 实施例2

[0030] 本申请具有很强的选择性和抗干扰能力，可用于检测低浓度的BPA，也具有高的灵敏度。首先，将BPA和联苯胺，二苯甲酮，对苯二酚、间苯二酚和BPB等化学物质单独加入离心管中(这些化学物质在结构上与BPA非常相似，均都含有两个苯环)，然后记录荧光强度。结果如图4所示，只有BPA存在的离心管中的上清液能检测到强荧光信号，而联苯胺，二苯甲酮，对苯二酚，间苯二酚和BPB则只能检测到微弱的荧光信号。这说明BPA相对于其他这几种化学类似物而言具有优异的选择性。另一方面，将BPA和这几种化学类似物加入到同一个离心管中，然后测量荧光强度，结果显示在仅有干扰化学物质存在下不能检测到明显的荧光信号，而在既存在BPA又存在干扰化学物质的离心管中能检测到明显的荧光信号。这说明本发明传感器具有很强的选择性和抗干扰能力。

[0031] 实施例3

[0032] 向自来水，河水和湖水中分别加入0，0.40，0.80和1.20ng/mL的BPA，其中河水和湖水用针式过滤器预先除去大颗粒，每种类型的水样分别设置三个平行样品。利用本发明所提出的传感器方法测量水样中的荧光强度，再根据线性回归方程得到相应的浓度值。为了验证方法可用于实样检测，利用高效液相色谱法(H PLC)进行了相同水样的检测，结果如表1所示。结果表明，本发明所述的传感器能有效用于对实际水样的检测中。

[0033] 表1对比试验结果

[0034]

[0035] 注：浓度的单位均为ng/mL。