本发明公开了一种基于电化学发光体系的透明质酸酶检测方法，借助透明质酸‑六水合三(2,2‑联吡啶)氯化钌体系，构建了一个用于检测透明质酸酶的电化学发光体系。透明质酸酶可以对透明质酸进行酶切反应，酶切后的透明质酸片段连同静电吸附在透明质酸片段上的六水合三(2,2‑联吡啶)氯化钌可以通过离心超滤进入到超滤液中。因此当透明质酸酶存在时，超滤液中的发光物质六水合三(2,2‑联吡啶)氯化钌的量会增加，发光体系的电化学发光强度会增强，基于此可以实现对透明质酸酶浓度的检测。本发明方法原料易得、操作简单、耗时较短而且灵敏度高，有望在生命科学及医学临床检测等领域得到广泛应用。
1.一种基于电化学发光体系的透明质酸酶检测方法，其特征在于：其包括以下步骤：步骤S1：制备透明质酸-六水合三(2,2-联吡啶)氯化钌混合液组成的电化学发光体系；
步骤S2：将不同浓度的透明质酸酶分别加入到上述发光体系内，进行酶切反应，反应后所得的各混合溶液分别进行离心超滤，收集各超滤液，将各超滤液分别与PBS缓冲液混合均匀，或者将各超滤液分别与正三丙胺和PBS缓冲液混合均匀，得到不同的混合体系，使用BPCL微弱化学发光测量仪测量各混合体系的电化学发光信号；
步骤S3：根据收集的各混合体系的电化学发光信号，绘制标准曲线；
步骤S4：将待测样品加入根据步骤S1制备的发光体系内，反应后所得的混合溶液进行离心超滤，收集待测超滤液，将待测超滤液与正三丙胺、PBS缓冲液混合均匀，得到待测体系，使用BPCL微弱化学发光测量仪测量该待测体系的电化学发光信号，将该电化学发光信号结合标准曲线，得出待测样品中透明质酸酶浓度。
2.根据权利要求1所述的一种基于电化学发光体系的透明质酸酶检测方法，其特征在于：所述步骤S1具体如下：步骤S1-1：将1.4 mg/mL的透明质酸溶液与4 mg/mL的六水合三(2,2-联吡啶)氯化钌溶液按照体积比495∶5混合均匀，室温反应40-50分钟，得到体积为V的混合液；
步骤S1-2：将上述混合液置于超滤管中，离心，收集浓缩液；
步骤S1-3：将上述浓缩液用浓度为10 mM的 PBS缓冲液进行离心洗涤，重复2-3次，将最终得到的浓缩液用浓度为10 mM、pH为7.4的 PBS缓冲液稀释至体积为0.6V，得到透明质酸-六水合三(2,2-联吡啶)氯化钌混合液组成的电化学发光体系。
3.根据权利要求2所述的一种基于电化学发光体系的透明质酸酶检测方法，其特征在于：步骤S1-2的离心转速为13000-15000rpm，离心时间为 25-35分钟。
4.根据权利要求1所述的一种基于电化学发光体系的透明质酸酶检测方法，其特征在于：所述步骤S2具体如下：步骤S2-1：将不同浓度的透明质酸酶分别加入到透明质酸-六水合三(2,2-联吡啶)氯化钌混合液组成的电化学发光体系中，在37 ℃下进行酶切反应110-130分钟，得到第一溶液；
步骤S2-2：将第一溶液置于超滤管中，离心，收集超滤液；
步骤S2-3：将超滤液与PBS缓冲液混合均匀，或者将超滤液与正三丙胺溶液以及PBS缓冲液混合均匀，立即用BPCL微弱化学发光测量仪测量其电化学发光信号。
5.根据权利要求4所述的一种基于电化学发光体系的透明质酸酶检测方法，其特征在于：所述透明质酸酶、透明质酸-六水合三(2,2-联吡啶)氯化钌混合液、正三丙胺溶液、PBS缓冲液的用量比为100µL∶300µL∶8µL∶2 mL。
6.根据权利要求4所述的一种基于电化学发光体系的透明质酸酶检测方法，其特征在于：所述PBS缓冲液的浓度为10 mM，pH为7.4。
7.根据权利要求1所述的一种基于电化学发光体系的透明质酸酶检测方法，其特征在于：所述步骤S4具体如下：步骤S4-1：将待测样品加入到透明质酸-六水合三(2,2-联吡啶)氯化钌混合液组成的电化学发光体系中，在37 ℃下反应110-130分钟，得到第一溶液；
步骤S4-2：将第一溶液置于超滤管中，离心，收集超滤液；
步骤S4-3：将超滤液与正三丙胺溶液、PBS缓冲液混合均匀得到待测体系，立即用BPCL微弱化学发光测量仪测量该待测体系的电化学发光信号，将该电化学发光信号结合标准曲线，得出待测样品中透明质酸酶浓度。
8.根据权利要求7所述的一种基于电化学发光体系的透明质酸酶检测方法，其特征在于：所述待测样品、透明质酸-六水合三(2,2-联吡啶)氯化钌混合液、正三丙胺溶液、PBS缓冲液的用量比为100µL∶300µL∶8µL∶2 mL。
9.根据权利要求7所述的一种基于电化学发光体系的透明质酸酶检测方法，其特征在于：所述PBS缓冲液的浓度为10 mM，pH为7.4。
一种基于电化学发光体系的透明质酸酶检测方法
技术领域
[0001] 本发明属于分析化学领域，具体涉及一种基于电化学发光体系的透明质酸酶检测方法。
背景技术
[0002] 透明质酸（HA）是一种线性阴离子糖胺聚糖，透明质酸的结构由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰基-D-葡萄糖胺形成的重复二糖单元组成。透明质酸的合成和降解与各种生物过程，如胚胎发生，炎症，伤口愈合，细胞增殖，分化和迁移密切相关，并可能参与某些恶性肿瘤的发展。透明质酸酶（HAase）是一种内切葡聚糖酶，可将透明质酸切割成小片段，可通过降解透明质酸调节肿瘤细胞的转移。 据报道，透明质酸酶的过表达与许多恶性肿瘤如前列腺癌，膀胱癌，脑癌和结肠直肠癌有关。因此，透明质酸酶作为潜在的肿瘤标志物，对其进行早期检测对癌症的临床诊断和治疗具有重要意义。现阶段，研究人员开发出的主要检测方法有粘度法、酶谱法、比浊法、荧光法、比色法、免疫测定法等。但是这些方法均需要复杂而漫长的前期准备工作或贵重繁琐的仪器操作。因此，发展一种简单快捷的透明质酸酶检测方法是迫切需要的。
发明内容
[0003] 本发明的目的在于提供一种操作简单、灵敏度高的基于电化学发光体系的透明质酸酶的检测方法。
[0004] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0005] 一种基于电化学发光体系的透明质酸酶检测方法，包括以下步骤：
[0006] 步骤S1：制备透明质酸-六水合三(2,2-联吡啶)氯化钌混合液组成的电化学发光体系；
[0007] 步骤S2：将不同浓度的透明质酸酶分别加入到上述发光体系内，进行酶切反应，反应后所得的各混合溶液分别进行离心超滤，收集各超滤液，将各超滤液分别与正三丙胺、PBS缓冲液混合均匀，得到不同的混合体系，使用由CHI660D电化学工作站和BPCL微弱化学发光测量仪组成的电化学发光检测系统测量各混合体系的电化学发光信号；
[0008] 步骤S3：根据收集的各混合体系的电化学发光信号，绘制标准曲线；
[0009] 步骤S4：将待测样品加入根据步骤S1制备的发光体系内，反应后所得的混合溶液进行离心超滤，收集待测超滤液，将待测超滤液与正三丙胺、PBS缓冲液混合均匀，得到待测体系，使用由CHI660D电化学工作站和BPCL微弱化学发光测量仪组成的电化学发光检测系统测量该待测体系的电化学发光信号，将该电化学发光信号结合标准曲线，得出待测样品中透明质酸酶浓度。
[0010] 所述步骤S1具体如下：
[0011] 步骤S1-1：将1.4 mg/mL的透明质酸溶液与4 mg/mL的六水合三(2,2-联吡啶)氯化钌溶液按照体积比495∶5混合均匀，室温反应40-50分钟，得到体积为V的混合液；
[0012] 步骤S1-2：将上述混合液置于超滤管中，在13000-15000rpm转速下离心25-35分钟，收集浓缩液；
[0013] 步骤S1-3：将上述浓缩液用浓度为10 mM的 PBS缓冲液进行离心洗涤，重复2-3次，将最终得到的浓缩液用浓度为10 mM、pH为7.4的 PBS缓冲液稀释至体积为0.6V，得到透明质酸-六水合三(2,2-联吡啶)氯化钌混合液组成的电化学发光体系。
[0014] 所述步骤S2具体如下：
[0015] 步骤S2-1：将不同浓度的透明质酸酶分别加入到透明质酸-六水合三(2,2-联吡啶)氯化钌混合液组成的电化学发光体系中，在37 ℃下进行酶切反应110-130分钟，得到第一溶液；
[0016] 步骤S2-2：将第一溶液置于超滤管中，离心，收集超滤液；
[0017] 步骤S2-3：将超滤液与正三丙胺溶液、PBS缓冲液混合均匀，立即用由CHI660D电化学工作站和BPCL微弱化学发光测量仪组成的电化学发光检测系统测量其电化学发光信号。
[0018] 进一步，步骤S2中，透明质酸酶、透明质酸-六水合三(2,2-联吡啶)氯化钌混合液、正三丙胺溶液、PBS缓冲液的用量比为100µL∶300µL∶8µL∶2 mL，所述PBS缓冲液的浓度为10 mM，pH为7.4。
[0019] 所述步骤S4具体如下：
[0020] 步骤S4-1：将待测样品加入到透明质酸-六水合三(2,2-联吡啶)氯化钌混合液组成的电化学发光体系中，在37 ℃下反应110-130分钟，得到第一溶液；
[0021] 步骤S4-2：将第一溶液置于超滤管中，离心，收集超滤液；
[0022] 步骤S4-3：将超滤液与正三丙胺溶液、PBS缓冲液混合均匀得到待测体系，立即用由CHI660D电化学工作站和BPCL微弱化学发光测量仪组成的电化学发光检测系统测量该待测体系的电化学发光信号，将该电化学发光信号结合标准曲线，得出待测样品中透明质酸酶浓度。
[0023] 步骤步骤S4中，所述待测样品、透明质酸-六水合三(2,2-联吡啶)氯化钌混合液、正三丙胺溶液、PBS缓冲液的用量比为100µL∶300µL∶8µL∶2 mL，所述PBS缓冲液的浓度为10 mM，pH为7.4。
[0024] 本发明采用以上技术方案，借助透明质酸-六水合三(2,2-联吡啶)氯化钌体系，构建了一个用于检测透明质酸酶的电化学发光体系。透明质酸酶可以对透明质酸进行酶切反应，酶切后的透明质酸片段连同静电吸附在透明质酸片段上的六水合三(2,2-联吡啶)氯化钌可以通过离心超滤进入到超滤液中。因此当透明质酸酶存在时，超滤液中的发光物质六水合三(2,2-联吡啶)氯化钌的量会增加，发光体系的电化学发光强度会增强，基于此可以实现对透明质酸酶浓度的检测。
[0025] 本发明的显著优点在于：
[0026] 1、所需要的原材料简单易得，不需要复杂的合成步骤。
[0027] 2、操作简单，无须昂贵的仪器和复杂的操作，对透明质酸酶的检测简单而又快速。
[0028] 3、本发明方法能够直接用于检测透明质酸酶，从2 U/mL到40 U/mL的浓度范围内对透明质酸酶呈现较好的线性响应。
附图说明
[0029] 图1为本发明的透明质酸酶的检测示意图；
[0030] 图2为不同浓度透明质酸酶的电化学发光光谱，加入不同浓度的透明质酸酶，相应的发光强度会变化，从a到f的透明质酸酶浓度分别为0 U/mL、2 U/mL、10 U/mL、20 U/mL、30 U/mL、40 U/mL；
[0031] 图3为不同浓度透明质酸酶相应的电化学发光强度的变化；
[0032] 图4为本发明方法的检测特异性结果。
具体实施方式
[0033] 以下结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
[0034] 溶液配制：
[0035] 透明质酸溶液：称取4.2 mg透明质酸，加3 mL水溶解于离心管中，得到浓度为1.4 mg/mL的透明质酸溶液，振荡至透明质酸在溶液中混合均匀，使用时分成6份备用。
[0036] 六水合三(2,2-联吡啶)氯化钌溶液：称取4 mg六水合三(2,2-联吡啶)氯化钌，加1 mL水溶解于离心管中，得到浓度为4 mg/mL的六水合三(2,2-联吡啶)氯化钌溶液备用。
[0037] 1x PBS缓冲液：量取2 mL的20x PBS缓冲液(200mM)，用38 mL超纯水溶解，得到40 mL的1x PBS缓冲液（10mM）备用。
[0038] 实施例1
[0039] 透明质酸-六水合三(2,2-联吡啶)氯化钌电化学发光体系的制备
[0040] （1）取1.4 mg/mL的透明质酸495 µL和4 mg/mL的六水合三(2,2-联吡啶)氯化钌溶液5 µL在离心管混合，室温反应45分钟，得到混合溶液；
[0041] （2）将得到的混合溶液置于超滤管（Amicon® Ultra-0.5 Centrifugal Filter Devices）中，进行离心（14000rpm, 30 分钟），弃去超滤液，得到含有透明质酸-六水合三(2,2-联吡啶)氯化钌复合物的浓缩液；
[0042] （3）将所得到浓缩液利用1xPBS缓冲液（10 mM）进行离心洗涤（14000 rpm, 30分钟），得到的浓缩液继续重复离心洗涤3次，将最终得到的浓缩液使用1x PBS缓冲液（pH =7.4）稀释至300微升，得到透明质酸-六水合三(2,2-联吡啶)氯化钌混合液组成的电化学发光体系。
[0043] 实施例2
[0044] 标准曲线的绘制
[0045] （1）将不同浓度的透明质酸酶（100 µL）分别与透明质酸-六水合三(2,2-联吡啶)氯化钌混合液组成的电化学发光体系混合均匀，混合液在37 ℃进行酶切反应120分钟；
[0046] （2）然后将各混溶液置于超滤管中进行超滤离心（14000rpm, 30 分钟），弃去浓缩液，所得到的超滤液与8 µL正三丙胺溶液和2 mL 1x PBS缓冲液（pH =7.4）置于发光池中混合均匀；
[0047] （3）立即使用由CHI660D电化学工作站和BPCL微弱化学发光测量仪组成的电化学发光检测系统测量发光池中的电化学发光信号，检测过程使用三电极体系，分别是玻碳电极（工作电极）、银/氯化银电极（参比电极）、铂丝电极（对电极）。
[0048] 根据收集的电化学发光强度信号，记录监测结果。根据记录的读数拟合相关线性方程，得到的线性方程用于待测样品中透明质酸酶浓度的检测。
[0049] 如图2所示，随着透明质酸酶的浓度升高，相对应的电化学发光强度也随之增大。透明质酸酶溶液为a到f，从a到f的透明质酸酶浓度分别为0 U/mL、2 U/mL、10 U/mL、20 U/mL、30 U/mL、40 U/mL，各体系的发光强度会随着透明质酸酶浓度的增加而逐渐增加。因此，本发明可以实现对透明质酸酶浓度的定量检测。图3为不同浓度透明质酸酶的相应的电化学发光强度的变化。
[0050] 实施例3
[0051] 待测样品中透明质酸酶浓度的测定
[0052] （1）将待测样品（100 µL）与透明质酸-六水合三(2,2-联吡啶)氯化钌混合液组成的电化学发光体系混合均匀，混合液在37 ℃反应120分钟；
[0053] （2）然后将混合液置于超滤管中进行超滤离心（14000rpm, 30 分钟），弃去浓缩液，所得到的超滤液与8 µL正三丙胺溶液和2 mL 1x PBS缓冲液（pH =7.4）置于发光池中混合均匀；
[0054] （3）立即使用由CHI660D电化学工作站和BPCL微弱化学发光测量仪组成的电化学发光检测系统测量发光池中的电化学发光信号，检测过程使用三电极体系，分别是玻碳电极（工作电极）、银/氯化银电极（参比电极）、铂丝电极（对电极）。
[0055] 记录待测样品的电化学发光强度信号，代入标准曲线中，计算出待测样品中的透明质酸酶的浓度。
[0056] 实施例4
[0057] 特异性检测
[0058] 为了检测本发明方法对透明质酸酶检测的特异性，将本发明中所使用的透明质酸酶换成其他干扰物质，分别为氯化钠、氯化钾、葡萄糖、牛血清蛋白、碱性磷酸酶和空白溶液，透明质酸酶的浓度为20 U/Ml(0.05 mg/mL)，其他干扰离子的浓度均为1 mg/mL。
[0059] 如图3所示，对于透明质酸-六水合三(2,2-联吡啶)氯化钌电化学发光体系，在透明质酸酶存在的时候检测到明显的增强的荧光信号，但是其它干扰物质的电化学发光强度几乎与空白溶液是相同的，这表明，该体系对其它干扰物质响应较小，并且所提出的透明质酸-六水合三(2,2-联吡啶)氯化钌电化学发光体系有显著的特异性。
