一种抗寒防伪型种衣剂及其应用

摘要

本发明公开了一种抗寒防伪型种衣剂及其应用，该抗寒防伪型种衣剂包括抗寒防伪剂和包衣辅料，所述抗寒防伪剂包括负载罗丹明B的温敏凝胶，所述温敏凝胶为N‑异丙基丙烯酰胺与甲基丙烯酸丁酯的共聚物。本发明将罗丹明B负载于温敏凝胶中，并与包衣辅料进行混合，得到具有抗寒和防伪双重功能的种衣剂，该种衣剂不仅利用罗丹明B的荧光特性实现种子真伪的标记和鉴别，还利用罗丹明B与温敏凝胶结合后的抗寒特性，实现种子抗寒能力的提高，使种子具备较为显著的抗寒和防伪双重效果。

权利要求

1.一种抗寒防伪型种衣剂，其特征在于，包括：抗寒防伪剂和包衣辅料，所述抗寒防伪剂包括负载罗丹明B的温敏凝胶，所述“负载”是指罗丹明B嵌入温敏凝胶的孔隙中，所述罗丹明B的负载量为10～25wt％，所述温敏凝胶为N-异丙基丙烯酰胺与甲基丙烯酸丁酯的共聚物。

2.如权利要求1所述的抗寒防伪型种衣剂，其特征在于，所述抗寒防伪剂与包衣辅料的质量体积比为0.04～0.5:0.8～1.2。

3.如权利要求1所述的抗寒防伪型种衣剂，其特征在于，所述包衣辅料为聚乙烯醇。

4.如权利要求1所述的抗寒防伪型种衣剂，其特征在于，所述抗寒防伪剂由负载罗丹明B的温敏凝胶和负载水杨酸的温敏凝胶组成。

5.如权利要求4所述的抗寒防伪型种衣剂，其特征在于，所述水杨酸的负载量为40～

60％。

6.如权利要求1～5任一项所述的抗寒防伪型种衣剂在制备同时具有抗寒和防伪功能的包衣种子中的应用，以种子的质量计，所述罗丹明B的用量为0.0005～0.0025g/g，所述水杨酸的用量为0.0025～0.005g/g。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述种衣剂应用于玉米种子。

说明书

一种抗寒防伪型种衣剂及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及植物种子处理和包衣技术领域，尤其涉及一种抗寒防伪型种衣剂及其应用。

背景技术

[0002] 玉米是一种源自热带和亚热带的喜温作物，最适发芽温度为25-28℃。发芽期间对低温较敏感，当温度低于10℃，种子一般很难发芽。播种后非适宜的低温环境造成的胁迫伤害会直接影响种子的质量，间接阻碍玉米的营养和生殖生长，最终导致粮食产量的下降。另一方面，种子市场常出现假冒伪劣种子，扰乱市场秩序，目前国内外种子防伪的研究重点在防伪包装上，生产上亟需一种针对种子本身的防伪技术，因此对有效抗寒防伪剂的研发显得尤为重要。

[0003] 热缩型温敏水凝胶聚N-异丙基丙烯酰胺P(NIPAm-co-BMA)具有智能控制药物释放的特性，药物分子可装载于温敏凝胶中，通过温度调节实现对药物的控制释放；当溶液温度高于低临界溶解温度(Lower Critical Solution Temperature，LCST)时，凝胶处于收缩状态，形成致密表层阻止药物的释放；而在温度低于LCST时，凝胶膨胀使药物分子较快释放；当温度在LCST上下范围交替变化时，凝胶体系可开关式地控制药物释放。已有研究报道显示，装载水杨酸(SA)的聚N-异丙基丙烯酰胺P(NIPAm-co-BMA)以丸化方式处理玉米种子具有显著的抗寒效果。

[0004] 申请人的前期研究已经筛选出可以直接用于处理种子的荧光化合物罗丹明B(RB)，使种子内部或幼苗某些部位在特定激发光下显示特征性荧光，以此作为鉴别种子真伪的标记，达到种子防伪的目的。但有关RB对玉米种子其他影响的探索尚未开展。

发明内容

[0005] 本发明提供了一种抗寒防伪型种衣剂及其应用，该抗寒防伪型种衣剂不仅利用荧光化合物罗丹明B的荧光特性实现种子真伪的标记和鉴别，还利用罗丹明B与温敏凝胶结合后的抗寒性能，实现了抗寒和防伪的双重功效，且抗寒效果明显。

[0006] 具体技术方案如下：

[0007] 一种抗寒防伪型种衣剂，包括：抗寒防伪剂和包衣辅料，所述抗寒防伪剂包括负载罗丹明B的温敏凝胶，所述温敏凝胶为N-异丙基丙烯酰胺与甲基丙烯酸丁酯的共聚物。

[0008] 所述“负载”是指罗丹明B嵌入温敏凝胶的孔隙中；具体方法是：将温敏凝胶固体置于罗丹明B水溶液中，在温度低于LCST的条件下浸泡至溶胀平衡，取出温敏凝胶干燥后，得到负载罗丹明B的温敏凝胶。

[0009] 进一步地，所述抗寒防伪剂与包衣辅料的质量体积比为0.04～0.5:0.8～1.2；更进一步地，质量体积比为0.05～0.25:0.8～1.2；更优选，质量体积比为0.25:1。

[0010] 进一步地，所述罗丹明B的负载量为10～25wt％；更进一步地，所述罗丹明B的负载量为18～22wt％。

[0011] 故，所述罗丹明B与包衣辅料的质量比为0.01～0.05:0.8～1.2；更优选，罗丹明B与包衣辅料的质量比为0.05:1。

[0012] 进一步地，所述包衣辅料为聚乙烯醇。

[0013] 作为优选，所述抗寒防伪剂由负载罗丹明B的温敏凝胶和负载水杨酸的温敏凝胶组成。将负载罗丹明B的温敏凝胶和负载水杨酸的温敏凝胶进行组合可进一步提高种衣剂的抗寒性能。

[0014] 作为优选，所述负载罗丹明B的温敏凝胶和负载水杨酸的温敏凝胶的质量比为0.25：0.30。

[0015] 进一步地，所述罗丹明B的负载量为10～25wt％，所述水杨酸的负载量为40～60％；更进一步地，所述罗丹明B的负载量为18～22wt％，水杨酸的负载量44～55wt％。

[0016] 故，所述罗丹明B与水杨酸的质量比为0.01～0.05:0.05～0.1；更优选，所述罗丹明B与水杨酸的质量比为1:2。

[0017] 本发明还提供了所述的抗寒防伪型种衣剂在制备同时具有抗寒和防伪功能的包衣种子中的应用。

[0018] 进一步地，所述种衣剂应用于玉米种子。

[0019] 本发明中抗寒防伪型种衣剂的制备和种子包衣的方法如下：

[0020] (1)将温敏凝胶固体置于罗丹明B/水杨酸水溶液中，温度低于LCST下浸泡至溶胀平衡，取出温敏凝胶干燥后，得到负载罗丹明B/水杨酸的温敏凝胶；

[0021] (2)将所述负载罗丹明B/水杨酸的温敏凝胶粉碎后，与种子、包衣辅料混合，得到包衣种子后的种子产品。

[0022] 以种子的质量计，所述罗丹明B的用量为0.0005～0.0025g/g；更优选，罗丹明B的用量为0.0025g/g。

[0023] 以种子的质量计，所述水杨酸的用量为0.0025～0.005g/g；更优选，水杨酸的用量为0.005g/g。

[0024] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

[0025] 本发明将罗丹明B负载于温敏凝胶中，并与包衣辅料进行混合，得到具有抗寒和防伪双重功能的种衣剂，该种衣剂不仅利用罗丹明B的荧光特性实现种子真伪的标记和鉴别，还利用罗丹明B与温敏凝胶结合后的抗寒特性，实现种子抗寒能力的提高，抗寒和防伪效果显著。此外，将负载罗丹明B的温敏凝胶和负载水杨酸的温敏凝胶进行组合在实现种子有效防伪的同时，还可进一步提高种子的抗寒性能。

附图说明

[0026] 图1为实施例3中低温胁迫对不同种衣剂包衣的玉米幼苗丙二醛(MDA)含量的影响。

[0027] 其中，每处理4次重复，柱子上方的字母表示不同处理间的差异显著性(LSD，α＝0.05)，

[0028] 图2为实施例4中在低温胁迫过程(生长第3、5、8和11天)中采用不同种衣剂包衣的玉米种子表面的荧光强度变化情况。

具体实施方式

[0029] 以下结合实施例对本发明作进一步描述。

[0030] 下列实施例所需试剂：水杨酸(SA)，罗丹明B(RB)以及制备温控缓释材料(即：N-异丙基丙烯酰胺与甲基丙烯酸丁酯的共聚物，以下简称温敏凝胶P(NIPAm-co-BMA)或温敏凝胶)所需的药剂，均购自于Aladdin公司。

[0031] 下列实施例中，种衣剂的制备和种子包衣过程如下：

[0032] (1)取干燥至恒重的温敏凝胶，浸入含有罗丹明B(RB)溶液或水杨酸(SA)溶液或两者混合溶液的烧杯中，5℃下溶胀3天后，取出，用酒精轻轻冲洗凝胶表面以去除外壁残留成分，放入真空干燥器中干燥10-15d，得到罗丹明B(RB)溶液或水杨酸(SA)溶液或两者混合溶液成功装载进温敏凝胶的试剂。

[0033] (2)将步骤(1)的试剂、聚乙烯醇和种子进行混合包衣，晾干后，得到包衣种子。

[0034] 上述步骤(1)所得试剂的装载率(即负载量)由公式S＝(Mt–M0)/M0计算得到；其中，M0为温敏凝胶的原始重量，Mt为装载后的最终重量，S为装载率。

[0035] 实施例1罗丹明B(RB)和水杨酸(SA)负载量的测定

[0036] 分别配制浓度为5g/L的罗丹明B(RB)水溶液和浓度为50g/L的水杨酸水溶液置于50mL烧杯中；取干燥至恒重的温敏凝胶，浸入罗丹明B水溶液或者水杨酸水溶液中，5℃下溶胀3天后取出，用酒精轻轻冲洗凝胶表面以去除外壁残留成分，放入真空干燥器中干燥10-
15d，直至恒重，获得罗丹明B成功装载进温敏凝胶的试剂和水杨酸成功装载进温敏凝胶的试剂。

[0037] 进行多次重复试验，根据上述公式计算得到：SA的装载率为44～55％，平均为50％；RB的装载率为18～22％，平均为20％(见表1)。

[0038] 表1SA和RB的凝胶装载量

[0039]

[0040] 实施例2罗丹明B(RB)和水杨酸(SA)单独包衣处理对种子发芽的影响

[0041] 本实施例中选用美玉3号糯玉米为供试材料，其种子来自浙江省农科院，经测定，该玉米品种的种子初始水分为10.7％，发芽率为96％。

[0042] 采用不同剂量的RB或SA粉剂包衣处理玉米种子，设置3个处理，分别为：RB处理、SA处理和对照处理；以包衣20g玉米种子计，设置RB的剂量梯度为0.05，0.01，0.005，0.001，0.0005g，SA的剂量梯度为0.25，0.1，0.05，0.025，0.01，0.005g，各处理添加包衣辅料2％(M/V)聚乙烯醇，用量为1.0mL，对照处理仅采用包衣辅料聚乙烯醇，不添加RB或SA。

[0043] 采用纸间发芽法将种子置床，每处理4次重复，每重复100粒种子。在人工气候箱中25℃恒温发芽5天，然后于5℃低温下生长3天，再转入25℃恒温恢复生长3天，保持光照12小时，黑暗12小时。从发芽第2天起每天对萌发种子计数，第8天统计发芽率，计算发芽指数。

[0044] 发芽率(GP，％)＝(7天内种子发芽数/受检种子数)×100％；

[0045] 发芽指数(GI)＝∑(Gt/Dt)，式中，Gt为逐日发芽种子数，Dt为相应发芽日数。

[0046] 表2不同浓度RB包衣处理对玉米种子发芽的影响

[0047]

[0048] 每处理设置4个重复，其中GP：发芽率；GI：发芽指数。数据后面的小写字母表示不同处理间的差异显著性(LSD，α＝0.05)。

[0049] 表3不同浓度SA包衣处理对玉米种子发芽的影响

[0050]

[0051] 每个处理设置4个重复，其中GP：发芽率；GI：发芽指数，数据后面的小写字母表示不同处理间的差异显著性(LSD，α＝0.05)。

[0052] 选用RB剂量为0.01～0.05g(以包衣20g玉米种子计)；SA剂量为0.05～0.1g(以包衣20g玉米种子计)进行下一步凝胶装载试验。

[0053] 实施例3

[0054] 本实施例中以美玉3号糯玉米为供试材料，其种子来自浙江省农科院，经测定，该玉米品种的种子初始水分为10.7％，发芽率为96％。

[0055] 1、处理的设置

[0056] 共设置9个处理，分别是CK、CK+P、R、P+R、PR、S、P+S、PS和PSR；其中，CK为只经包衣辅料聚乙烯醇处理；CK+P是温敏凝胶与包衣辅料的组合处理；R是RB与包衣辅料的组合处理；P+R是温敏凝胶、RB和包衣辅料的非装载混合处理；PR是装载RB的温敏凝胶与包衣辅料的组合处理；S是SA与包衣辅料的组合处理；P+S是温敏凝胶、SA和包衣辅料的非装载混合处理；PS是装载SA的温敏凝胶与包衣辅料的组合处理；PSR是分别装载SA的温敏凝胶和RB的温敏凝胶与包衣辅料的组合处理。

[0057] 上述处理涉及的装载方法与实施例1的内容相同，各种衣剂的组分用量见表4(装载量按照实施例1获得平均装载量计，该用量以包衣20g玉米种子计)。对玉米种子进行包衣后，待种衣剂晾干即可进行发芽试验。

[0058] 表4各种衣剂的组分用量

[0059]

[0060] 2、发芽试验和幼苗素质

[0061] 采用纸间发芽法将种子置床，每处理设置4次重复，每个重复100粒种子。在人工气候箱中25℃恒温发芽5天，然后于5℃低温下生长3天，再转入25℃恒温恢复生长3天，保持光照12小时，黑暗12小时。从发芽第2天起每天对萌发种子计数，第8天统计发芽率，并计算发芽指数。发芽第11天，每处理随机选择20株幼苗，在80℃烘箱中烘干24小时后，测定干重，计算活力指数。活力指数(VI)＝GI×DW，式中，GI为发芽指数，DW为苗干重。3、MDA含量测定[0062] 在低温处理后取样，分别称取0.3g玉米叶片和根部鲜样，每个处理4次重复，加入8ml0.1M PBS磷酸缓冲液(PH＝7.8)在冰上研磨至匀浆，然后10000r/min离心15min，取上清液采用TBA-TCA法测定MDA含量。

[0063] 4、试验结果

[0064] 4.1包衣辅料用量筛选

[0065] 在正式包衣前，首先对包衣辅料用量进行筛选。以每种种衣剂包衣20g玉米种子计，9种种衣剂使用药品剂量范围为0.05(CK)～0.55(PSR)g，根据包衣均匀度、包后回干时间以及包衣效果等多方面考虑，试验发现包衣辅料用量在0.8～1.2mL均可(本实施例处理中包衣辅料采用1.0mL)。

[0066] 4.2对种子发芽和幼苗素质的影响

[0067] CK与CK+P在发芽率(GP)、发芽指数(GI)和活力指数(VI)上均无显著性差异，可知温敏凝胶本身对种子发芽并无影响。对比R，P+R和PR三个处理，P+R比R在GP、GI和VI三个发芽指标上略有提高，但都未达到显著水平。PR在发芽指标上均显著高于R和P+R，由此可知，RB经凝胶装载后对种子发芽具有明显的促进作用。对比S，P+S和PS三个处理，PS处理也是显著优于S和P+S，与前人研究结果一致。对比PR、PS和PSR，PSR在GP和GI上与PR、PS无显著差异，但在VI上表现出显著高的水平。

[0068] 表5低温胁迫对不同种衣剂包衣处理的玉米种子发芽的影响

[0069]

[0070]

[0071] 每个处理设置4个重复，其中GP：发芽率；GI：发芽指数；VI：活力指数。数据后面的小写字母表示不同处理间的差异显著性著(LSD，α＝0.05)，具体的种衣剂配方见表4。

[0072] 4.3MDA含量

[0073] 低温胁迫后，叶片中MDA含量PR，PS和PSR显著低于CK，P+R和P+S则高于CK。根部MDA只有P+R高于CK，其余处理均低于CK。其中PR、PS和PSR的MDA含量保持在显著低的水平，特别是PSR，意味着较低水平的质膜损伤，间接反映出其有效的抗寒性。

[0074] 实施例4

[0075] 本实施例采用实施例3所采用的9种玉米包衣种子进行荧光测定。

[0076] 荧光测定方法如下：

[0077] 在种子萌发和幼苗生长过程中，分别选取低温前(第3天、第5天)、低温后(第8天)、恢复后(第11天)的幼苗，使用LeicaMZ16FA体视显微镜，在绿光下(546nm)进行种子表面荧光观测，LeicaDFC420拍照后利用imageJ软件进行荧光强度分析。

[0078] 实验结果：

[0079] 如图2所述，经RB包衣处理(P+R，PR，PSR)的玉米种子表面在绿光下呈现出明亮的荧光，而不含RB处理(CK，P+S，PS)的种子全程都无荧光。随着幼苗的生长，种子表面的荧光强度呈下降趋势。不同的是，P+R的荧光强度在种子萌发和幼苗生长过程中呈连续下降的趋势，而PR和PSR在低温前(第3天和第5天)荧光强度较P+R高且几乎不变，而在低温后即第8天出现荧光骤减现象，表现为温度感应式释放模式。对于种子防伪而言，在低温前和低温后均可对种子进行荧光检测，低温前效果更佳。

[0080] 综合以上结果分析可知，PR在抗寒的同时，荧光表现也完全满足种子防伪的需求，因此可以作为抗寒和防伪双重功能温敏种衣剂，更优选为RB和SA共同装载在温敏凝胶中作为抗寒和防伪双重功能温敏种衣剂。