一种阿霉素与ABT-263双药纳米载体及其制备方法

摘要

本发明公开了一种阿霉素与ABT‑263双药纳米载体，按质量百分比由以下原料的有效组分组成：医用明胶为52～60％，ABT‑263为1.5～3％，透明质酸为35～42％，阿霉素为1.5～3％，以上各组分的质量百分比之和为100％，本发明还公开了一种阿霉素与ABT‑263双药纳米载体的制备方法，利用明胶包裹脂溶性药物ABT‑263获得内核载药纳米颗粒，再通过透明质酸‑盐酸阿霉素载药纳米粒子，以戊二醛交联表面透明质酸，最后以EDC/NHS交联法将两种载药纳米颗粒进行连接，从而获得结构稳固的双药纳米载体颗粒，本发明解决了现有技术中存在的双药同时包裹困难以及粒径达不到要求且载药性能比较差的问题。

权利要求

1.一种阿霉素与ABT-263双药纳米载体的制备方法，其特征在于，阿霉素与ABT-263双药纳米载体，按质量百分比由以下原料的有效组分组成：医用明胶为52％～60％，ABT-263为1.5％～3％，透明质酸为35％～42％，阿霉素为1.5％～3％，以上各组分的质量百分比之和为100％，所述透明质酸分子量为6000～8000道尔顿，具体按照以下步骤实施：步骤1、按质量百分比称取医用明胶52％～60％，ABT-263 1.5％～3％，透明质酸35％～42％，阿霉素1.5％～3％，以上各组分的质量百分比之和为100％；

步骤2、将称取的医用明胶加入10ml水中，浸泡一段时间后，加热搅拌后降温至30℃；

步骤3、将ABT-263和聚山梨酯-80溶入乙醇中后，滴加至步骤2所制明胶溶液中，搅拌至溶液出现浑浊以后加入戊二醛溶液，提升搅拌速度，避光反应一段时间，获得ABT-263明胶载药纳米颗粒分散液，通过透析，除去分散液中的乙醇溶剂、戊二醛和其他可溶性杂质，最后用水定容至18～22ml；

步骤4、将阿霉素水溶液缓慢滴入透明质酸水溶液中，搅拌一段时间后，加入戊二醛溶液，避光一段时间，获得阿霉素载药纳米颗粒；

步骤5、将步骤4中得到的阿霉素载药纳米颗粒分散液用冰醋酸调节至pH＝4，之后加入EDC和NHS，搅拌均匀后静置一段时间，之后将纳米药载颗粒分散液透析去除杂质和溶剂，之后在搅拌状态下，滴加步骤3得到的ABT-263明胶载药纳米颗粒分散液，搅拌，室温反应；

步骤6、将步骤5最终得到的纳米药载颗粒分散液进行过滤以除去非溶解性杂质及微生物，之后等量分装，然后预冻、干燥、去除水分获得最终纳米制剂干粉。

2.根据权利要求1所述的一种阿霉素与ABT-263双药纳米载体的制备方法，其特征在于，所述步骤2中医用明胶为300～500mg，浸泡水温控制在25℃，浸泡时间为1小时，加热至

50～55℃，搅拌时间为20min。

3.根据权利要求1所述的一种阿霉素与ABT-263双药纳米载体的制备方法，其特征在于，所述步骤3中ABT-263为10～15mg，聚山梨酯-80为100～200μl，乙醇为12-20ml，戊二醛溶液浓度为25％，体积为200～400μl，ABT-263乙醇溶液滴加速度为2～4ml/min，搅拌速度

200～400rpm，搅拌速度提升至800～1000rpm，避光反应时长为2～4小时，透析是将纳米药载颗粒分散液装入截留分子量为3.5kDa的透析袋内，以纯水为外液，透析时间为12～24小时，期间更换外液3～5次。

4.根据权利要求1所述的一种阿霉素与ABT-263双药纳米载体的制备方法，其特征在于，所述步骤4中阿霉素水溶液浓度为10mg/ml、加入量为1～1.5ml，透明质酸水溶液浓度为

2～3mg/ml，体积为100ml，阿霉素水溶液滴入速度5～10ml/分钟，搅拌速度800～1500rpm，搅拌时间为20min，戊二醛溶液浓度为25％，加入量为200～400μl，避光时长为2～4小时。

5.根据权利要求1所述的一种阿霉素与ABT-263双药纳米载体的制备方法，其特征在于，所述步骤5中EDC的量为40～60mg，NHS量为4～6mg，静置时长为4～6小时，透析是将纳米药载颗粒分散液装入截留分子量为100kDa的透析袋内，以纯水为外液，透析时间为12～24小时，期间更换外液3～5次，ABT-263明胶载药纳米颗粒分散液滴加速度为2～4ml/分钟，搅拌速度200～400rpm，室温反应时长为4～8小时。

6.根据权利要求1所述的一种阿霉素与ABT-263双药纳米载体的制备方法，其特征在于，所述步骤6中预冻是在-70至-80℃超低温度下进行，预冻时间为12～24小时，干燥利用冷冻干燥机，控制压力低于0.1帕斯卡。

说明书

一种阿霉素与ABT-263双药纳米载体及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于纳米医药技术领域，具体涉及一种阿霉素与ABT-263双药纳米载体,本发明还涉及一种阿霉素与ABT-263双药纳米载体的制备方法。

背景技术

[0002] 化学治疗是利用药物杀灭肿瘤细胞或者抑制其增殖、浸润和转移来达到治疗效果的。其对原发灶和转移灶均有治疗效果，这是现今临床上唯一一种广泛使用的全身性肿瘤治疗手段。但是化疗药物选择性差毒性强，进入体内后除了杀伤肿瘤细胞，也会对正常组织细胞产生伤害作用。此外，耐药性是化疗中无法避免的另一个问题，其会造成疗效降低，增加用量，毒副作用更强的恶性循环。所以现在经常通过多种药物同时进行肿瘤化疗已经普遍应用于临床。因为不同药物之间存在的协同作用，可使其在治疗效果、毒副作用、剂量控制和减少耐药方面展现明显的优势。然而联合化疗中，最关键的问题就是如何克服药物因理化性质和代谢不同导致协同作用难以发挥的问题。我们的前期研究发现阿霉素和Bcl-2蛋白家族抑制剂ABT-263在细胞水平上具有显著的协同作用，但是两种药物亲疏水性不同，导致其在体内实验中没有展示出明显的协同作用。

[0003] 纳米药物载体在此方面具有很大的优势，通过该技术将两种或多种药物整合到同一个载体上，使得药物之间不存在代谢动力差异，可将它们同步递送至肿瘤组织和细胞内，再将载体内药物调节至最佳协同作用的剂量比，就可最大限度的发挥协同作用。为了达到这一系列功能，首先需要对纳米药物载体进行合理的设计，再根据需求制备功能化的包裹材料，最终构建获得完整的复合纳米药物载体。该过程需要通过新的构建工艺中结合实际经验不断探索测试，对关键节点进行优化和变革。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一种阿霉素与ABT-263双药纳米载体，使两种理化性质不同药物可同时积累在肿瘤部位，从而发挥协同治疗作用。

[0005] 本发明的另一目的是提供一种阿霉素与ABT-263双药纳米载体的制备方法。

[0006] 本发明所采用的第一技术方案是，一种阿霉素与ABT-263双药纳米载体，按质量百分比由以下原料的有效组分组成：医用明胶为52％～60％，ABT-263为1.5％～3％，透明质酸为35％～42％，阿霉素为1.5％～3％，以上各组分的质量百分比之和为100％。

[0007] 本发明第一技术方案的特点还在于，

[0008] 透明质酸分子量为6000～8000道尔顿。

[0009] 本发明所采用的第二技术方案是，一种阿霉素与ABT-263双药纳米载体的制备方法，其特征在于，具体按照以下步骤实施：

[0010] 步骤1、按质量百分比称取医用明胶52％～60％，ABT-263 1.5％～3％，透明质酸35％～42％，阿霉素1.5％～3％，以上各组分的质量百分比之和为100％；

[0011] 步骤2、将称取的医用明胶加入10ml水中，浸泡一段时间后，加热搅拌后降温至30℃；

[0012] 步骤3、将ABT-263和聚山梨酯-80溶入乙醇中后，滴加至步骤2所制明胶溶液中，搅拌至溶液出现浑浊以后加入戊二醛溶液，提升搅拌速度，避光反应一段时间，获得ABT-263明胶载药纳米颗粒分散液，通过透析，除去分散液中的乙醇溶剂、戊二醛和其他可溶性杂质，最后用水定容至18-22ml；

[0013] 步骤4、将阿霉素水溶液缓慢滴入透明质酸水溶液中，搅拌一段时间后，加入戊二醛溶液，避光一段时间，获得阿霉素载药纳米颗粒；

[0014] 步骤5、将步骤4中得到的阿霉素载药纳米颗粒分散液用冰醋酸调节至pH＝4，之后加入EDC和NHS，搅拌均匀后静置一段时间，之后将纳米药载颗粒分散液透析去除杂质和溶剂，之后在搅拌状态下，滴加步骤3得到的ABT-263明胶载药纳米颗粒分散液，搅拌，室温反应；

[0015] 步骤6、将步骤5最终得到的纳米药载颗粒分散液进行过滤以除去非溶解性杂质及微生物等，之后等量分装，然后预冻、干燥、去除水分获得最终纳米制剂干粉。

[0016] 本发明第二技术方案的特点还在于，

[0017] 步骤2中医用明胶为300～500mg，浸泡水温控制在25℃，浸泡时间为1小时，加热至50～55℃，搅拌时间为20min。

[0018] 步骤3中ABT-263为10～15mg，聚山梨酯-80为100～200μl，乙醇为12-20ml，戊二醛溶液浓度为25％，体积为200～400μl，ABT-263乙醇溶液滴加速度为2～4ml/min，搅拌速度200～400rpm，搅拌速度提升至800～1000rpm，避光反应时长为2～4小时，透析是将纳米药载颗粒分散液装入截留分子量为3.5kDa的透析袋内，以纯水为外液，透析时间为12～24小时，期间更换外液3～5次。

[0019] 步骤4中阿霉素水溶液浓度为10mg/ml、加入量为1～1.5ml，透明质酸水溶液浓度为2～3mg/ml，体积为100ml，阿霉素水溶液滴入速度5～10ml/分钟，搅拌速度800～1500rpm，搅拌时间为20min，戊二醛溶液浓度为25％，加入量为200～400μl，避光时长为2～
4小时。

[0020] 步骤5中EDC的量为40～60mg，NHS量为4～6mg，静置时长为4～6小时，透析是将纳米药载颗粒分散液装入截留分子量为100kDa的透析袋内，以纯水为外液，透析时间为12～24小时，期间更换外液3～5次，ABT-263明胶载药纳米颗粒分散液滴加速度为2～4ml/分钟，搅拌速度200～400rpm，室温反应时长为4～8小时。

[0021] 步骤6中预冻是在-70至-80℃超低温度下进行，预冻时间为12～24小时，干燥利用冷冻干燥机，控制压力低于0.1帕斯卡。

[0022] 本发明的有益效果是，一种阿霉素与ABT-263双药纳米载体，粒径小于300纳米，包裹效率高，稳定性好，释放稳定等优势，能有效保证药物在体内的长效循环，可显著降低用药剂量，可用于该双药的肿瘤联合治疗，所建立的工艺体系简单实用，各步骤均可进行精密的质量控制，获得的纳米药载颗粒具有非常高的包裹率和载药量，冻干后的制剂干粉可以稳定存放一年以上。

附图说明

[0023] 图1是本发明一种阿霉素与ABT-263双药纳米载体的制备方法的流程示意图；

[0024] 图2是本发明一种阿霉素与ABT-263双药纳米载体的制备方法中实施例1所制备纳米制剂重溶后透射电子显微镜照片；

[0025] 图3是本发明一种阿霉素与ABT-263双药纳米载体的制备方法中实施例1所制备纳米制剂重溶后粒径分析结果图；

[0026] 图4是本发明一种阿霉素与ABT-263双药纳米载体的制备方法中实施例1所制备纳米制剂溶液粒径稳定性测试结果图；

[0027] 图5是本发明一种阿霉素与ABT-263双药纳米载体的制备方法中实施例1所制备纳米制剂体外抗肿瘤实验结果；

[0028] 图6是本发明一种阿霉素与ABT-263双药纳米载体的制备方法中实施例1所制备的纳米制体内抗肿瘤实验结果。

具体实施方式

[0029] 下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。

[0030] 本发明一种阿霉素与ABT-263双药纳米载体，按质量百分比由以下原料的有效组分组成：医用明胶为52％～60％，ABT-263为1.5％～3％，透明质酸为35％～42％，阿霉素为1.5％～3％，以上各组分的质量百分比之和为100％，其中，透明质酸分子量为6000～8000道尔顿。

[0031] 一种阿霉素与ABT-263双药纳米载体的制备方法，如图1所示，具体按照以下步骤实施：

[0032] 步骤1、称量原料：按质量百分比称取医用明胶为52～60％，ABT-263为1.5～3％，透明质酸为35～42％，阿霉素为1.5～3％，以上各组分的质量百分比之和为100％；

[0033] 步骤2、将称取的300～500mg医用明胶加入10ml水中，25℃浸泡1小时，加热至50～55℃搅拌20分钟后降温至30℃；

[0034] 步骤3、将10～15mg ABT-263和100～200μl聚山梨酯-80溶入12-20ml乙醇后，滴加至搅拌的步骤2所制明胶溶液中，ABT-263乙醇溶液滴加速度为2～4ml/分钟，搅拌速度200～400rpm，溶液出现浑浊以后加入200～400μl25％戊二醛溶液，将搅拌速度提升至800～1000rpm，避光反应2～4小时，获得ABT-263明胶载药纳米颗粒分散液，通过透析，除去分散液中的乙醇溶剂、戊二醛和其他可溶性杂质，将纳米药载颗粒分散液装入截留分子量为
3.5kDa的透析袋内，以纯水为外液，透析时间为12～24小时，期间更换外液3～5次，最后用水定容至18～22ml；

[0035] 步骤4、将1～1.5ml浓度为10mg/ml的阿霉素水溶液缓慢滴入100ml浓度为2～3mg/ml的透明质酸水溶液中，阿霉素水溶液滴入速度5～10ml/分钟，搅拌速度800～1500rpm，搅拌20分钟后，加入200～400μl浓度为25％的戊二醛溶液，避光2～4小时，获得阿霉素载药纳米颗粒；

[0036] 步骤5、将步骤4中所获阿霉素载药纳米颗粒分散液用冰醋酸调节pH至4，之后加入40～60mg EDC和4～6mg NHS，搅拌均匀后静置4～6小时，之后将纳米药载颗粒分散液装入截留分子量为100kDa的透析袋内，以纯水为外液，透析时间为12～24小时，期间更换外液3～5次以去除杂质和溶剂，之后在搅拌状态下，滴加步骤3所得ABT-263明胶载药纳米颗粒分散液，滴加速度为2～4ml/分钟，搅拌速度200～400rpm，室温反应4～8小时；

[0037] 步骤6、将纳米药载颗粒分散液进行过滤以除去非溶解性杂质及微生物等，之后等量分装，然后预冻、干燥、去除水分获得最终纳米制剂干粉，其中预冻是在-70至-80℃超低温度下进行，预冻时间为12～24小时，干燥利用冷冻干燥机，控制压力低于0.1帕斯卡。

[0038] 实施例1

[0039] 一种阿霉素与ABT-263双药纳米载体的制备方法，如图1所示，具体按照以下步骤实施：

[0040] 步骤1、称量原料：按质量百分比称取医用明胶为55％，ABT-263为2％，透明质酸为41％，阿霉素为2％，以上各组分的质量百分比之和为100％；

[0041] 步骤2、将称取的300mg医用明胶加入10ml水中，25℃浸泡1小时，加热至50℃搅拌20分钟后降温至30℃；

[0042] 步骤3、将11mg ABT-263和110μl聚山梨酯-80溶入12ml乙醇后，滴加至搅拌的步骤2所制明胶溶液中，ABT-263乙醇溶液滴加速度为2ml/分钟，搅拌速度200rpm，溶液出现浑浊以后加入200μl 25％戊二醛溶液，将搅拌速度提升至800rpm，避光反应2小时，获得ABT-263明胶载药纳米颗粒分散液，通过透析，除去分散液中的乙醇溶剂、戊二醛和其他可溶性杂质，将纳米药载颗粒分散液装入截留分子量为3.5kDa的透析袋内，以纯水为外液，透析时间为12小时，期间更换外液3次，最后用水定容至18ml；

[0043] 步骤4、将1.1ml浓度为10mg/ml的阿霉素水溶液缓慢滴入100ml浓度为2.2mg/ml的透明质酸水溶液中，阿霉素水溶液滴入速度5ml/分钟，搅拌速度800rpm，搅拌20分钟后，加入200μl浓度为25％的戊二醛溶液，避光2小时，获得阿霉素载药纳米颗粒；

[0044] 步骤5、将步骤4中所获阿霉素载药纳米颗粒分散液用冰醋酸调节pH至4，之后加入40mg EDC和4mg NHS，搅拌均匀后静置4小时，之后将纳米药载颗粒分散液装入截留分子量为100kDa的透析袋内，以纯水为外液，透析时间为12小时，期间更换外液3次以去除杂质和溶剂，之后在搅拌状态下，滴加步骤3所得ABT-263明胶载药纳米颗粒分散液，滴加速度为
2ml/分钟，搅拌速度200rpm，室温反应4小时；

[0045] 步骤6、将纳米药载颗粒分散液进行过滤以除去非溶解性杂质及微生物等，之后等量分装，然后预冻、干燥、去除水分获得最终纳米制剂干粉，其中预冻是在-70℃超低温度下进行，预冻时间为12小时，干燥利用冷冻干燥机，控制压力低于0.1帕斯卡。

[0046] 将本实施例所获得的部分纳米制剂干粉用灭菌纯水溶解，利用马尔文粒度仪测定其粒径，分析其性能，本实施例所得纳米制剂，平均粒径为273±16.3nm，包裹率：ABT-263为74.3±5.1％，DOX为71.1±3.8％。

[0047] 实施例2

[0048] 一种阿霉素与ABT-263双药纳米载体的制备方法，具体按照以下步骤实施：

[0049] 步骤1、称量原料：按质量百分比称取医用明胶为60％，ABT-263为1.5％，透明质酸为37％，阿霉素为1.5％，以上各组分的质量百分比之和为100％；

[0050] 步骤2、将称取的400mg医用明胶，加入10ml水中，25℃浸泡1小时，加热至55℃搅拌20分钟后降温至30℃；

[0051] 步骤3、将10mg ABT-263和100μl聚山梨酯-80溶入12ml乙醇后，滴加至搅拌的步骤2所制明胶溶液中，ABT-263乙醇溶液滴加速度为4ml/分钟，搅拌速度400rpm，溶液出现浑浊以后加入400μl 25％戊二醛溶液，将搅拌速度提升至1000rpm，避光反应4小时，获得ABT-
263明胶载药纳米颗粒分散液，通过透析，除去分散液中的乙醇溶剂、戊二醛和其他可溶性杂质，将纳米药载颗粒分散液装入截留分子量为3.5kDa的透析袋内，以纯水为外液，透析时间为24小时，期间更换外液5次，最后用水定容至19ml；

[0052] 步骤4、将1ml浓度为10mg/ml的阿霉素水溶液缓慢滴入100ml浓度为2.5mg/ml的透明质酸水溶液中，阿霉素水溶液滴入速度10ml/分钟，搅拌速度1000rpm，搅拌20分钟后，加入400μl浓度为25％的戊二醛溶液，避光4小时，获得阿霉素载药纳米颗粒；

[0053] 步骤5、将步骤4中所获阿霉素载药纳米颗粒分散液用冰醋酸调节pH至4，之后加入60mg EDC和6mg NHS，搅拌均匀后静置6小时，之后将纳米药载颗粒分散液装入截留分子量为100kDa的透析袋内，以纯水为外液，透析时间为24小时，期间更换外液5次以去除杂质和溶剂，之后在搅拌状态下，滴加步骤3所得ABT-263明胶载药纳米颗粒分散液，滴加速度为
4ml/分钟，搅拌速度400rpm，室温反应8小时；

[0054] 步骤6、将纳米药载颗粒分散液进行过滤以除去非溶解性杂质及微生物等，之后等量分装，然后预冻、干燥、去除水分获得最终纳米制剂干粉，其中预冻是在-80℃超低温度下进行，预冻时间为24小时，干燥利用冷冻干燥机，控制压力低于0.1帕斯卡。

[0055] 将本实施例所获得的部分纳米制剂干粉用灭菌纯水溶解，利用马尔文粒度仪测定其粒径，分析其性能，本实施例所得纳米制剂，平均粒径为266±12.7nm，包裹率：ABT-263为71.4±5.3％，DOX为74.3±4.1％。

[0056] 实施例3

[0057] 一种阿霉素与ABT-263双药纳米载体的制备方法，具体按照以下步骤实施：

[0058] 步骤1、称量原料：按质量百分比称取医用明胶为60％，ABT-263为2.5％，透明质酸为35％，阿霉素为2.5％，以上各组分的质量百分比之和为100％；

[0059] 步骤2、将称取的360mg医用明胶，加入10ml水中，25℃浸泡1小时，加热至52℃搅拌20分钟后降温至30℃；

[0060] 步骤3、将15mg ABT-263和150μl聚山梨酯-80溶入20ml乙醇后，滴加至搅拌的步骤2所制明胶溶液中，ABT-263乙醇溶液滴加速度为3ml/分钟，搅拌速度400rpm，溶液出现浑浊以后加入300μl 25％戊二醛溶液，将搅拌速度提升至900rpm，避光反应3小时，获得ABT-263明胶载药纳米颗粒分散液，通过透析，除去分散液中的乙醇溶剂、戊二醛和其他可溶性杂质，将纳米药载颗粒分散液装入截留分子量为3.5kDa的透析袋内，以纯水为外液，透析时间为18小时，期间更换外液4次，最后用水定容至20ml；

[0061] 步骤4、将1.5ml浓度为10mg/ml的阿霉素水溶液缓慢滴入100ml浓度为2.1mg/ml的透明质酸水溶液中，阿霉素水溶液滴入速度8ml/分钟，搅拌速度1200rpm，搅拌20分钟后，加入300μl浓度为25％的戊二醛溶液，避光3小时，获得阿霉素载药纳米颗粒；

[0062] 步骤5、将步骤4中所获阿霉素载药纳米颗粒分散液用冰醋酸调节pH至4，之后加入50mg EDC和5mg NHS，搅拌均匀后静置5小时，之后将纳米药载颗粒分散液装入截留分子量为100kDa的透析袋内，以纯水为外液，透析时间为20小时，期间更换外液4次以去除杂质和溶剂，之后在搅拌状态下，滴加步骤3所得ABT-263明胶载药纳米颗粒分散液，滴加速度为
3ml/分钟，搅拌速度300rpm，室温反应6小时；

[0063] 步骤6、将纳米药载颗粒分散液进行过滤以除去非溶解性杂质及微生物等，之后等量分装，然后预冻、干燥、去除水分获得最终纳米制剂干粉，其中预冻是在-75℃超低温度下进行，预冻时间为20小时，干燥利用冷冻干燥机，控制压力低于0.1帕斯卡。

[0064] 将本实施例所获得的部分纳米制剂干粉用灭菌纯水溶解，利用马尔文粒度仪测定其粒径，分析其性能，本实施例所得纳米制剂，平均粒径为286±13.1nm，包裹率：ABT-263为70.9±5.3％，DOX为73.7±7.7％。

[0065] 实施例4

[0066] 一种阿霉素与ABT-263双药纳米载体的制备方法，具体按照以下步骤实施：

[0067] 步骤1、称量原料：按质量百分比称取医用明胶为52％，ABT-263为3％，透明质酸为42％，阿霉素为3％，以上各组分的质量百分比之和为100％；

[0068] 步骤2、将称取的260mg医用明胶，加入10ml水中，25℃浸泡1小时，加热至54℃搅拌20分钟后降温至30℃；

[0069] 步骤3、将15mg ABT-263和120μl聚山梨酯-80溶入15ml乙醇后，滴加至搅拌的步骤2所制明胶溶液中，ABT-263乙醇溶液滴加速度为2ml/分钟，搅拌速度200rpm，溶液出现浑浊以后加入200μl 25％戊二醛溶液，将搅拌速度提升至800rpm，避光反应2小时，获得ABT-263明胶载药纳米颗粒分散液，通过透析，除去分散液中的乙醇溶剂、戊二醛和其他可溶性杂质，将纳米药载颗粒分散液装入截留分子量为3.5kDa的透析袋内，以纯水为外液，透析时间为18小时，期间更换外液4次，最后用水定容至21ml；

[0070] 步骤4、将1.5ml浓度为10mg/ml的阿霉素水溶液缓慢滴入100ml浓度为2.1mg/ml的透明质酸水溶液中，阿霉素水溶液滴入速度7ml/分钟，搅拌速度900rpm，搅拌20分钟后，加入250μl浓度为25％的戊二醛溶液，避光3小时，获得阿霉素载药纳米颗粒；

[0071] 步骤5、将步骤4中所获阿霉素载药纳米颗粒分散液用冰醋酸调节pH至4，之后加入45mg EDC和4.5mg NHS，搅拌均匀后静置5小时，之后将纳米药载颗粒分散液装入截留分子量为100kDa的透析袋内，以纯水为外液，透析时间为18小时，期间更换外液4次以去除杂质和溶剂，之后在搅拌状态下，滴加步骤3所得ABT-263明胶载药纳米颗粒分散液，滴加速度为
4ml/分钟，搅拌速度300rpm，室温反应5小时；

[0072] 步骤6、将纳米药载颗粒分散液进行过滤以除去非溶解性杂质及微生物等，之后等量分装，然后预冻、干燥、去除水分获得最终纳米制剂干粉，其中预冻是在-70℃超低温度下进行，预冻时间为18小时，干燥利用冷冻干燥机，控制压力低于0.1帕斯卡。

[0073] 将本实施例所获得的部分纳米制剂干粉用灭菌纯水溶解，利用马尔文粒度仪测定其粒径，分析其性能，本实施例所得纳米制剂，平均粒径为291±14.5nm，包裹率：ABT-263为70.2±6.8％，DOX为71.7±8.1％。

[0074] 实施例5

[0075] 一种阿霉素与ABT-263双药纳米载体的制备方法，具体按照以下步骤实施：

[0076] 步骤1、称量原料：按质量百分比称取医用明胶为58％，ABT-263为1.2％，透明质酸为38％，阿霉素为1.2％，以上各组分的质量百分比之和为100％；

[0077] 步骤2、将称取的348mg医用明胶，加入10ml水中，25℃浸泡1小时，加热至54℃搅拌20分钟后降温至30℃；

[0078] 步骤3、将12mg ABT-263和150μl聚山梨酯-80溶入18ml乙醇后，滴加至搅拌的步骤2所制明胶溶液中，ABT-263乙醇溶液滴加速度为2ml/分钟，搅拌速度200rpm，溶液出现浑浊以后加入200μl 25％戊二醛溶液，将搅拌速度提升至1000rpm，避光反应4小时，获得ABT-
263明胶载药纳米颗粒分散液，通过透析，除去分散液中的乙醇溶剂、戊二醛和其他可溶性杂质，将纳米药载颗粒分散液装入截留分子量为3.5kDa的透析袋内，以纯水为外液，透析时间为20小时，期间更换外液4次，最后用水定容至22ml；

[0079] 步骤4、将1.2ml浓度为10mg/ml的阿霉素水溶液缓慢滴入100ml浓度为2.3mg/ml的透明质酸水溶液中，阿霉素水溶液滴入速度7ml/分钟，搅拌速度1300rpm，搅拌20分钟后，加入350μl浓度为25％的戊二醛溶液，避光2小时，获得阿霉素载药纳米颗粒；

[0080] 步骤5、将步骤4中所获阿霉素载药纳米颗粒分散液用冰醋酸调节pH至4，之后加入55mg EDC和5mg NHS，搅拌均匀后静置4小时，之后将纳米药载颗粒分散液装入截留分子量为100kDa的透析袋内，以纯水为外液，透析时间为20小时，期间更换外液4次以去除杂质和溶剂，之后在搅拌状态下，滴加步骤3所得ABT-263明胶载药纳米颗粒分散液，滴加速度为
3ml/分钟，搅拌速度400rpm，室温反应7小时；

[0081] 步骤6、将纳米药载颗粒分散液进行过滤以除去非溶解性杂质及微生物等，之后等量分装，然后预冻、干燥、去除水分获得最终纳米制剂干粉，其中预冻是在-70℃超低温度下进行，预冻时间为16小时，干燥利用冷冻干燥机，控制压力低于0.1帕斯卡。

[0082] 将本实施例所获得的部分纳米制剂干粉用灭菌纯水溶解，利用马尔文粒度仪测定其粒径，分析其性能，本实施例所得纳米制剂，平均粒径为276±11.3nm，包裹率：ABT-263为78.3±5.0％，DOX为75.3±6.1％。

[0083] 实施例6

[0084] 一种阿霉素与ABT-263双药纳米载体的制备方法，具体按照以下步骤实施：

[0085] 步骤1、称量原料：按质量百分比称取医用明胶为55％，ABT-263为13％，透明质酸为39.5％，阿霉素为2.5％，以上各组分的质量百分比之和为100％；

[0086] 步骤2、将称取的320mg医用明胶，加入10ml水中，25℃浸泡1小时，加热至54℃搅拌20分钟后降温至30℃；

[0087] 步骤3、将12mg ABT-263和180μl聚山梨酯-80溶入16ml乙醇后，滴加至搅拌的步骤2所制明胶溶液中，ABT-263乙醇溶液滴加速度为4ml/分钟，搅拌速度350rpm，溶液出现浑浊以后加入300μl 25％戊二醛溶液，将搅拌速度提升至800rpm，避光反应2小时，获得ABT-263明胶载药纳米颗粒分散液，通过透析，除去分散液中的乙醇溶剂、戊二醛和其他可溶性杂质，将纳米药载颗粒分散液装入截留分子量为3.5kDa的透析袋内，以纯水为外液，透析时间为18小时，期间更换外液5次，最后用水定容至21ml；

[0088] 步骤4、将1ml浓度为10mg/ml的阿霉素水溶液缓慢滴入100ml浓度为2.4mg/ml的透明质酸水溶液中，阿霉素水溶液滴入速度8ml/分钟，搅拌速度1400rpm，搅拌20分钟后，加入300μl浓度为25％的戊二醛溶液，避光4小时，获得阿霉素载药纳米颗粒；

[0089] 步骤5、将步骤4中所获阿霉素载药纳米颗粒分散液用冰醋酸调节pH至4，之后加入50mg EDC和4.5mg NHS，搅拌均匀后静置6小时，之后将纳米药载颗粒分散液装入截留分子量为100kDa的透析袋内，以纯水为外液，透析时间为18小时，期间更换外液5次以去除杂质和溶剂，之后在搅拌状态下，滴加步骤3所得ABT-263明胶载药纳米颗粒分散液，滴加速度为
3ml/分钟，搅拌速度350rpm，室温反应6小时；

[0090] 步骤6、将纳米药载颗粒分散液进行过滤以除去非溶解性杂质及微生物等，之后等量分装，然后预冻、干燥、去除水分获得最终纳米制剂干粉，其中预冻是在-75℃超低温度下进行，预冻时间为12～24小时，干燥利用冷冻干燥机，控制压力低于0.1帕斯卡。

[0091] 将本实施例所获得的部分纳米制剂干粉用灭菌纯水溶解，利用马尔文粒度仪测定其粒径，分析其性能，本实施例所得纳米制剂，平均粒径为283±13.8nm，包裹率：ABT-263为74.2±6.5％，DOX为70.7±5.7％。

[0092] 实施例7

[0093] 一种阿霉素与ABT-263双药纳米载体的制备方法，具体按照以下步骤实施：

[0094] 步骤1、称量原料：按质量百分比称取医用明胶为60％，ABT-263为2.5％，透明质酸为35.5％，阿霉素为2％，以上各组分的质量百分比之和为100％；

[0095] 步骤2、将称取的336mg医用明胶，加入10ml水中，25℃浸泡1小时，加热至51℃搅拌20分钟后降温至30℃；

[0096] 步骤3、将14mg ABT-263和160μl聚山梨酯-80溶入20ml乙醇后，滴加至搅拌的步骤2所制明胶溶液中，ABT-263乙醇溶液滴加速度为4ml/分钟，搅拌速度300rpm，溶液出现浑浊以后加入300μl 25％戊二醛溶液，将搅拌速度提升至800rpm，避光反应4小时，获得ABT-263明胶载药纳米颗粒分散液，通过透析，除去分散液中的乙醇溶剂、戊二醛和其他可溶性杂质，将纳米药载颗粒分散液装入截留分子量为3.5kDa的透析袋内，以纯水为外液，透析时间为20小时，期间更换外液5次，最后用水定容至20ml；

[0097] 步骤4、将11.2ml浓度为10mg/ml的阿霉素水溶液缓慢滴入100ml浓度为2mg/ml的透明质酸水溶液中，阿霉素水溶液滴入速度6ml/分钟，搅拌速度1400rpm，搅拌20分钟后，加入240μl浓度为25％的戊二醛溶液，避光4小时，获得阿霉素载药纳米颗粒；

[0098] 步骤5、将步骤4中所获阿霉素载药纳米颗粒分散液用冰醋酸调节pH至4，之后加入55mg EDC和5mg NHS，搅拌均匀后静置6小时，之后将纳米药载颗粒分散液装入截留分子量为100kDa的透析袋内，以纯水为外液，透析时间为24小时，期间更换外液5次以去除杂质和溶剂，之后在搅拌状态下，滴加步骤3所得ABT-263明胶载药纳米颗粒分散液，滴加速度为
4ml/分钟，搅拌速度360rpm，室温反应8小时；

[0099] 步骤6、将纳米药载颗粒分散液进行过滤以除去非溶解性杂质及微生物等，之后等量分装，然后预冻、干燥、去除水分获得最终纳米制剂干粉，其中预冻是在-80℃超低温度下进行，预冻时间为24小时，干燥利用冷冻干燥机，控制压力低于0.1帕斯卡。

[0100] 将本实施例所获得的部分纳米制剂干粉用灭菌纯水溶解，利用马尔文粒度仪测定其粒径，分析其性能，本实施例所得纳米制剂，平均粒径为279±15.8nm，包裹率：ABT-263为73.5±7.4％，DOX为71.8±8.1％。

[0101] 实施例8

[0102] 一种阿霉素与ABT-263双药纳米载体的制备方法，具体按照以下步骤实施：

[0103] 步骤1、称量原料：按质量百分比称取医用明胶为52.5％，ABT-263为2.5％，透明质酸为42％，阿霉素为3％，以上各组分的质量百分比之和为100％；

[0104] 步骤2、将称取的315mg医用明胶，加入10ml水中，25℃浸泡1小时，加热至50℃搅拌20分钟后降温至30℃；

[0105] 步骤3、将10mg ABT-263和120μl聚山梨酯-80溶入15ml乙醇后，滴加至搅拌的步骤2所制明胶溶液中，ABT-263乙醇溶液滴加速度为3ml/分钟，搅拌速度400rpm，溶液出现浑浊以后加入300μl 25％戊二醛溶液，将搅拌速度提升至9000rpm，避光反应4小时，获得ABT-
263明胶载药纳米颗粒分散液，通过透析，除去分散液中的乙醇溶剂、戊二醛和其他可溶性杂质，将纳米药载颗粒分散液装入截留分子量为3.5kDa的透析袋内，以纯水为外液，透析时间为18小时，期间更换外液3次，最后用水定容至19ml；

[0106] 步骤4、将1.2ml浓度为10mg/ml的阿霉素水溶液缓慢滴入100ml浓度为2.5mg/ml的透明质酸水溶液中，阿霉素水溶液滴入速度8ml/分钟，搅拌速度1200rpm，搅拌20分钟后，加入300μl浓度为25％的戊二醛溶液，避光2小时，获得阿霉素载药纳米颗粒；

[0107] 步骤5、将步骤4中所获阿霉素载药纳米颗粒分散液用冰醋酸调节pH至4，之后加入45mg EDC和4.5mg NHS，搅拌均匀后静置4小时，之后将纳米药载颗粒分散液装入截留分子量为100kDa的透析袋内，以纯水为外液，透析时间为12小时，期间更换外液3次以去除杂质和溶剂，之后在搅拌状态下，滴加步骤3所得ABT-263明胶载药纳米颗粒分散液，滴加速度为
3ml/分钟，搅拌速度200rpm，室温反应4小时；

[0108] 步骤6、将纳米药载颗粒分散液进行过滤以除去非溶解性杂质及微生物等，之后等量分装，然后预冻、干燥、去除水分获得最终纳米制剂干粉，其中预冻是在-80℃超低温度下进行，预冻时间为18小时，干燥利用冷冻干燥机，控制压力低于0.1帕斯卡。

[0109] 将本实施例所获得的部分纳米制剂干粉用灭菌纯水溶解，利用马尔文粒度仪测定其粒径，分析其性能，本实施例所得纳米制剂，平均粒径为302±15.1nm，包裹率：ABT-263为75.2±7.1％，DOX为70.9±3.5％。

[0110] 对实施例1所制备的阿霉素与ABT-263与阿霉素双药纳米载体的粒径分布及稳定性进行测定，并通过透射电子显微镜观察其形态特征。所得结果表明：该纳米制剂具形态特征均一，单分散性良好，稳定性高，药物包裹能力强，参见图2、图3、图4。阿霉素与ABT-263与阿霉素双药纳米载体的体外细胞毒性效果进行了检测，结果发现其针对人乳腺癌细胞MCF-7、人胃癌细胞SGC7901和人前列腺癌细胞PC-3都具有很明显的细胞毒性，结果见图5。通过对裸鼠SGC7901荷瘤模型进行干预，结果发现该纳米制剂可有效抑制肿瘤生长，参见图6。

[0111] 前期预实验发现，这两种药物可对人乳腺癌细胞MCF-7、人胃癌细胞SGC7901和人前列腺癌细胞PC-3起到协同治疗作用，但是因理化性质的差异无法有效的发挥体内协同治疗，通过常规的乳化增溶办法无法保证结果重复性，所获得制剂质量难以进行控制。而本发明所使用的明胶是广为使用的药物辅料，可有效增加ABT-263在水中的分散度，而透明质酸除了作为包材以外，还具有一定的肿瘤靶向性。本发明依托前期经验，通过大量实验对试剂配比，制备工艺等关键参数进行反复测试修改，克服了其在制备过程中存在的稳定性不足和重复性较差的缺点，最终获得最优的制备工艺。保证了制剂的质量控制。