一种聚丙烯酰胺凝胶及其试剂盒

摘要

本发明涉及一种聚丙烯酰胺凝胶，由分离胶和浓缩胶组成，分离胶为6～15wt％聚丙烯酰胺、0.35～0.4M三羟甲基氨基甲烷、0.03～0.2wt％四乙基乙二胺、0.1～1wt％亚硫酸氢钠和0.08～0.15wt％过硫酸铵；浓缩胶为4～5wt％聚丙烯酰胺、0.1～0.15M三羟甲基氨基甲烷、0.08～0.4wt％四乙基乙二胺、0.05～0.5wt％亚硫酸氢钠和0.08～0.15wt％过硫酸铵。本发明的聚丙烯酰胺凝胶因多种成份协同作用，保证稳定的凝胶凝固速度又提升溶液的长期稳定性，凝胶电泳分离蛋白的效果良好，蛋白条带清晰，不添加挥发性有毒加速剂TEMED的设计保证实验人员不受挥发性有毒化合物的伤害。

权利要求

1.一种聚丙烯酰胺凝胶，其特征在于，所述聚丙烯酰胺凝胶由分离胶和浓缩胶组成，所述分离胶由6～15wt％聚丙烯酰胺、0.35～0.4M三羟甲基氨基甲烷、0.03～0.2wt％四乙基乙二胺、0.1～1wt％亚硫酸氢钠和0.08～0.15wt％过硫酸铵组成；所述浓缩胶由4～5wt％聚丙烯酰胺、0.1～0.15M三羟甲基氨基甲烷、0.08～0.4wt％四乙基乙二胺、0.05～0.5wt％亚硫酸氢钠和0.08～0.15wt％过硫酸铵组成。

2.根据权利要求1所述的聚丙烯酰胺凝胶，其特征在于，所述分离胶还包括0.01～

0.1wt％SDS，所述浓缩胶还包括0.01～0.1wt％SDS。

3.根据权利要求1或2所述的聚丙烯酰胺凝胶，其特征在于，所述聚丙烯酰胺由丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺质量比为29～30:0.8～1聚合而成。

4.根据权利要求3所述的聚丙烯酰胺凝胶，其特征在于，所述分离胶的pH值为8.6～

9.2，所述浓缩胶的pH值为6.7～7.5。

5.根据权利要求1所述的聚丙烯酰胺凝胶，其特征在于，所述浓缩胶还包括0.1～

0.5wt％的着色剂。

6.根据权利要求5所述的聚丙烯酰胺凝胶，其特征在于，所述着色剂为类胡萝卜素。

7.制备权利要求1所述的聚丙烯酰胺凝胶的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由分离胶溶液A、分离胶溶液B、浓缩胶溶液A、浓缩胶溶液B和过硫酸铵组成，所述分离胶溶液A由质量百分比之和为12％～30％的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺组成，所述分离胶溶液B为0.7～

0.8M三羟甲基氨基甲烷、0.06～0.4wt％四乙基乙二胺和0.2～2wt％亚硫酸氢钠，所述浓缩胶溶液A由质量百分比之和为8％～10％的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺组成，所述浓缩胶溶液B为0.2～0.3M三羟甲基氨基甲烷、0.16～0.8wt％四乙基乙二胺和0.1～1wt％亚硫酸氢钠。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的质量比为29～30:0.8～1。

9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述分离胶的pH值为8.6～9.2，所述浓缩胶的pH值为6.7～7.5。

10.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述浓缩胶溶液B还包括0.2～1wt％的着色剂。

说明书

一种聚丙烯酰胺凝胶及其试剂盒

技术领域

[0001] 本发明属于聚丙烯酰胺凝胶电泳，具体涉及一种聚丙烯酰胺凝胶及其试剂盒。

背景技术

[0002] 聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE),是目前生物试验中应用最为广泛也是最为基础的实验,它有两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)和聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)。目前传统的PAGE主要是单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺以过硫酸铵(APS)为催化剂，以四甲基乙二胺(TEMED)为加速剂聚合而成，在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，自由基引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构，制成凝胶。但是，传统的凝胶有以下几个缺点：

[0003] 1、TEMED有挥发性易燃，有腐蚀性，而且具有强神经毒性以及刺激性气味。

[0004] 2、制备过程复杂，需要混合多种溶液。制胶过程费时，大大降低实验人员的实验效率，而且后加入的TEMED强烈刺激性气味会对实验人员健康产生不好的影响。

[0005] 3、凝胶速度慢，传统分离胶凝胶速度为30min～1h，浓缩胶为30min左右。

[0006] 4、浓缩胶无色，上样时容易将样品加到样品孔外去，样品之间易造成污染，影响蛋白分离后的结果判定。

[0007] 目前市面也有类似的PAGE凝胶快速配制试剂，但另外产生种种不佳体验，如需要额外添加TEMED、电泳速度明显下降、丙烯酰胺溶液易水解稳定性不佳等。

[0008] 申请人也尝试将TEMED预先加入分离胶液体中，但这会导致溶液性能不稳定，易分解，3～4天就失去效果。

[0009] 综上，对于传统的聚丙烯酰胺凝胶亟需一种制备快速简便、不含易燃，有腐蚀性，具强神经毒性成份TEMED、长期保存稳定的快速聚丙烯酰胺凝胶配制试剂盒。

发明内容

[0010] 有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种聚丙烯酰胺凝胶，本发明的目的之二在于提供上述聚丙烯酰胺凝胶的试剂盒。

[0011] 为达上述目的，本发明采取如下技术方案：

[0012] 1.一种聚丙烯酰胺凝胶，所述聚丙烯酰胺凝胶由分离胶和浓缩胶组成，所述分离胶为6～15wt％聚丙烯酰胺、0.35～0.4M三羟甲基氨基甲烷、0.03～0.2wt％四乙基乙二胺、0.1～1wt％亚硫酸氢钠和0.08～0.15wt％过硫酸铵；所述浓缩胶为4～5wt％聚丙烯酰胺、
0.1～0.15M三羟甲基氨基甲烷、0.01～0.1wt％SDS、0.08～0.4wt％四乙基乙二胺、0.05～
0.5wt％亚硫酸氢钠和0.08～0.15wt％过硫酸铵。

[0013] 进一步，所述分离胶还包括0.01～0.1wt％SDS，所述浓缩胶还包括0.01～0.1wt％SDS。

[0014] 进一步，所述聚丙烯酰胺由丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺质量比为29～30:0.8～1聚合而成。

[0015] 进一步，所述分离胶的pH值为8.6～9.2，所述浓缩胶的pH值为6.7～7.5。

[0016] 进一步，所述分离胶的pH值为8.8，所述浓缩胶的pH值为6.8。

[0017] 进一步，所述浓缩胶还包括0.1～0.5wt％的着色剂。

[0018] 进一步，所述着色剂为类胡萝卜素。

[0019] 进一步，所述类胡萝卜素为番茄红素。

[0020] 2.制备聚丙烯酰胺凝胶的试剂盒，所述试剂盒由分离胶溶液A、分离胶溶液B、浓缩胶溶液A、浓缩胶溶液B和过硫酸铵组成，所述分离胶溶液A由质量百分比的和为12％～30％的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺组成，所述分离胶溶液B为0.7～0.8M三羟甲基氨基甲烷、0.06～0.4wt％四乙基乙二胺和0.2～2wt％亚硫酸氢钠，所述浓缩胶溶液A由质量百分比的和为8％～10％的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺组成，所述浓缩胶溶液B为0.2～0.3M三羟甲基氨基甲烷、0.16～0.8wt％四乙基乙二胺和0.1～1wt％亚硫酸氢钠。

[0021] 进一步，所述分离胶溶液B还含有0.02～0.2wt％SDS，所述浓缩胶溶液B还含有0.02～0.2wt％SDS。

[0022] 进一步，所述丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的质量比为29～30:0.8～1。

[0023] 进一步，所述分离胶的pH值为8.6～9.2，所述浓缩胶的pH值为6.7～7.5。

[0024] 进一步，所述浓缩胶溶液B还包括0.2～1wt％的着色剂。。

[0025] 进一步，所述过硫酸铵为固体。

[0026] 本发明的有益效果在于：1.多种加速剂协同作用，保证了稳定的凝胶凝固速度，所制备的凝胶电泳分离蛋白的效果也很好，蛋白条带清晰。2.减少加速剂毒性的设计保证了实验人员不受到挥发性有毒化合物的伤害，先预混在分离胶溶液B和浓缩胶溶液B的缓冲液中，更加方便凝胶的配制，而且这种预混的条件下，放置十几天或者一个月之后还能保持催化作用促进丙烯酰胺单体聚合。3.着色剂可以直接添加在浓缩胶溶液B内，制备胶时更便捷，也方便使用者更加清楚上样且不影响蛋白的分离效果。4.制备成配套的试剂盒中小包装固体的过硫酸铵，存放时室温放置更方便，在使用时配制成液体也十分方便使用。

附图说明

[0027] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：

[0028] 图1为实施例6制备的10％聚丙烯酰胺凝胶，上层为带粉色的浓缩胶，下层为无色透明分离胶；

[0029] 图2为对比实施例加入TEMED制备而成的10％聚丙烯酰胺凝胶；

[0030] 图3为实施例6制备的10％聚丙烯酰胺凝胶加入Marker和蛋白样品电泳后的图，泳道1为Marker，泳道2为蛋白样品；

[0031] 图4为对比实施例所制备的10％聚丙烯酰胺凝胶加入Marker和蛋白样品电泳后的图，泳道1为Marker，泳道2为蛋白样品；

[0032] 图5为实施列1所制备的6％聚丙烯酰胺凝胶电泳后图片，泳道1为Marker，泳道2为蛋白样品。

[0033] 图6为实施列2所制备的8％聚丙烯酰胺凝胶电泳后图片，泳道1为Marker，泳道2为蛋白样品。

[0034] 图7为实施列4所制备的12％聚丙烯酰胺凝胶电泳后图片，泳道1为Marker，泳道2为蛋白样品。

[0035] 图8为实施列5所制备的15％聚丙烯酰胺凝胶电泳后图片，泳道1为Marker，泳道2为蛋白样品。

[0036] 图9为实施例7制备的10％非变性聚丙烯酰胺凝胶加入Marker电泳后的图。

具体实施方式

[0037] 下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

[0038] 实施例所用Marker为ThermoFisher的PageRulerTMPrestained Protein Ladder,10to 180kDa，货号26616；蛋白样品为牛血清白蛋白(BSA)和转角蛋白(TRF)。

[0039] 根据不同蛋白样品所需最佳分离范围不同，实验人员一般会选择不同浓度的凝胶来达到实验要求，本发明能在6％～15％的浓度范围内都能配制出凝胶。

[0040] 实施例1 6％聚丙烯酰胺凝胶配制

[0041] 1.各混合储备液组分：

[0042] 1)分离胶溶液A:100ml，取丙烯酰胺11.6克，甲叉双丙烯酰胺0.4克，加水搅拌溶解后定容至100ml混匀；

[0043] 2)分离胶溶液B:100ml，其中0.75MTris，0.2wt％SDS，0.06wt％四乙基乙二胺,0.3wt％亚硫酸氢钠，pH值为8.8。

[0044] 3)浓缩胶溶液A:20ml，取丙烯酰胺2克，甲叉双丙烯酰胺0.0533克，加水搅拌溶解后定容至20ml混匀；

[0045] 4)浓缩胶溶液B:20ml其中0.25MTris，0.2wt％SDS，0.1wt％亚硫酸氢钠，0.2wt％四乙基乙二胺，pH值为6.8。

[0046] 5)过硫酸铵(AP)：10wt％，取过硫酸铵0.1克，加1ml水溶解混匀。

[0047] 以上试剂配制后4℃放置10天后再配制凝胶。

[0048] 2. 6％聚丙烯酰胺分离胶配制方法

[0049] 取分离胶溶液A 2ml，再取分离胶溶液B 2ml充分混匀后，加入过硫酸铵(AP)10wt％40ul，充分混匀，迅速注入两玻璃板间隙中，再加入醇或水覆盖于分离胶之上。

[0050] 3. 5％聚丙烯酰胺浓缩胶配制方法

[0051] 取浓缩胶溶液A 1ml，再取浓缩胶溶液B 1ml充分混匀后，加入过硫酸铵(AP)10wt％20ul，充分混匀，待分离胶聚合完全后，倒出覆盖层液体，用去离子水洗涤，然后将配制好的浓缩胶灌注在分离胶上，立即插入干净的配套梳子，避免气泡，待浓缩胶聚合后，拔出梳子，形成加样孔,即可进行下一步聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。

[0052] 图5为实施列1所制备的6％聚丙烯酰胺凝胶电泳后图片，泳道1为Marker，泳道2为蛋白样品。

[0053] 实施例2 8％聚丙烯酰胺凝胶配制

[0054] 1.各混合储备液组分：

[0055] 1)分离胶溶液A:50ml，取丙烯酰胺8克，甲叉双丙烯酰胺0.2133克，加水搅拌溶解后定容至50ml混匀；

[0056] 2)分离胶溶液B:50ml，其中0.7MTris，0.2wt％SDS，0.08wt％四乙基乙二胺，0.35wt％亚硫酸氢钠，pH值为8.8。

[0057] 3)浓缩胶溶液A:10ml，取丙烯酰胺0.9733克，甲叉双丙烯酰胺0.0267克，加水搅拌溶解后定容至10ml混匀；

[0058] 4)浓缩胶溶液B:10ml其中0.3MTris，0.2wt％SDS，1wt％亚硫酸氢钠，0.2wt％亚硫酸氢钠，0.16wt％四乙基乙二胺，pH值为6.8。

[0059] 5)过硫酸铵(AP)：10wt％，取过硫酸铵0.1克，加1ml水溶解混匀。

[0060] 以上试剂配制后4℃放置15天后再配制凝胶。

[0061] 2. 8％聚丙烯酰胺分离胶配制方法

[0062] 取分离胶溶液A 3ml，再取分离胶溶液B 3ml充分混匀后，加入10wt％过硫酸铵(AP)60ul，充分混匀，迅速注入两玻璃板间隙中，再加入醇或水覆盖于分离胶之上。

[0063] 3. 5％聚丙烯酰胺浓缩胶配制方法

[0064] 取浓缩胶溶液A 1ml，再取浓缩胶溶液B 1ml充分混匀后，加入10wt％过硫酸铵(AP)20ul，充分混匀；待分离胶聚合完全后，倒出覆盖层液体，用去离子水洗涤，然后将配制好的浓缩胶灌注在分离胶上，立即插入干净的配套梳子，避免气泡，待浓缩胶聚合后，拔出梳子，形成加样孔，即可进行下一步聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。

[0065] 图6为实施列2所制备的8％聚丙烯酰胺凝胶电泳后图片，泳道1为Marker，泳道2为蛋白样品。

[0066] 实施例3 10％聚丙烯酰胺凝胶配制

[0067] 1.各混合储备液组分：

[0068] 1)分离胶溶液A:100ml，取丙烯酰胺19.4667克，甲叉双丙烯酰胺0.5333克，加水搅拌溶解后定容至100ml混匀；

[0069] 2)分离胶溶液B:100ml，其中0.8MTris，0.2wt％SDS，0.064wt％四乙基乙二胺，0.25wt％亚硫酸氢钠，pH值为8.8。

[0070] 3)浓缩胶溶液A:20ml，取丙烯酰胺1.5573克，甲叉双丙烯酰胺0.04267克，加水搅拌溶解后定容至20ml混匀；

[0071] 4)浓缩胶溶液B:20ml其中0.2MTris，0.2wt％SDS，0.16wt％四乙基乙二胺，0.1wt％亚硫酸氢钠，pH值为6.8。

[0072] 5)过硫酸铵(AP)：10wt％，取过硫酸铵0.1克，加1ml水溶解混匀。

[0073] 以上试剂配制后4℃放置10天后再配制凝胶。

[0074] 2. 10％聚丙烯酰胺分离胶配制方法

[0075] 取分离胶溶液A 2.5ml，再取分离胶溶液B 2.5ml充分混匀后，加入过硫酸铵(AP)10wt％50ul，充分混匀，迅速注入两玻璃板间隙中，再加入醇或水覆盖于分离胶之上。

[0076] 3. 4％聚丙烯酰胺浓缩胶配制方法

[0077] 取浓缩胶溶液A 1ml，再取浓缩胶溶液B 1ml充分混匀后，加入过硫酸铵(AP)10wt％20ul，充分混匀，待分离胶聚合完全后，倒出覆盖层液体，用去离子水洗涤，然后将配制好的浓缩胶灌注在分离胶上，立即插入干净的配套梳子，避免气泡，待浓缩胶聚合后，拔出梳子，形成加样孔，即可进行下一步聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。

[0078] 实施例4 12％聚丙烯酰胺凝胶配制

[0079] 1.各混合储备液组分：

[0080] 1)分离胶溶液A:50ml，取丙烯酰胺11.6克，甲叉双丙烯酰胺0.4克，加水搅拌溶解后定容至50ml混匀；

[0081] 2)分离胶溶液B:50ml，其中0.725MTris，0.2wt％SDS，0.1wt％四乙基乙二胺，1wt％亚硫酸氢钠，pH值为8.8。

[0082] 3)浓缩胶溶液A:10ml，取丙烯酰胺0.8克，甲叉双丙烯酰胺0.0213克，加水搅拌溶解后定容至10ml混匀；

[0083] 4)浓缩胶溶液B:10ml其中0.275MTris，0.2wt％SDS，0.3wt％四乙基乙二胺，1wt％亚硫酸氢钠，pH值为6.8。

[0084] 5)过硫酸铵(AP)：10wt％，取过硫酸铵0.1克，加1ml水溶解混匀。

[0085] 以上试剂配制后4℃放置13天后再配制凝胶。

[0086] 2. 12％聚丙烯酰胺分离胶配制方法

[0087] 取分离胶溶液A 2ml，再取分离胶溶液B 2ml充分混匀后，加入过硫酸铵(AP)10wt％40ul，充分混匀，迅速注入两玻璃板间隙中，再加入醇或水覆盖于分离胶之上。

[0088] 3. 4％聚丙烯酰胺浓缩胶配制方法

[0089] 取浓缩胶溶液A 1ml，再取浓缩胶溶液B 1ml充分混匀后，加入过硫酸铵(AP)10wt％20ul，充分混匀，待分离胶聚合完全后，倒出覆盖层液体，用去离子水洗涤，然后将配制好的浓缩胶灌注在分离胶上，立即插入干净的配套梳子，避免气泡，待浓缩胶聚合后，拔出梳子，形成加样孔，即可进行下一步聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。

[0090] 图7为实施列4所制备的12％聚丙烯酰胺凝胶电泳后图片，泳道1为Marker，泳道2为蛋白样品。

[0091] 实施例5 15％聚丙烯酰胺凝胶配制

[0092] 1.各混合储备液组分：

[0093] 1)分离胶溶液A:50ml，取丙烯酰胺14.5克，甲叉双丙烯酰胺0.5，加水搅拌溶解后定容至50ml混匀；

[0094] 2)分离胶溶液B:50ml，其中0.775M Tris，0.2wt％SDS，0.15％四乙基乙二胺，0.5wt％亚硫酸氢钠，pH值为8.8；

[0095] 3)浓缩胶溶液A:10ml，取丙烯酰胺0.773克，甲叉双丙烯酰胺0.0267克，加水搅拌溶解后定容至10ml混匀；

[0096] 4)浓缩胶溶液B:10ml其中0.3MTris，0.2wt％SDS，0.25％四乙基乙二胺，0.5wt％亚硫酸氢钠，pH值为6.8。

[0097] 5)过硫酸铵(AP)：10wt％，取过硫酸铵0.1克，加1ml水溶解混匀。

[0098] 以上试剂配制后4℃放置15天后再配制凝胶。

[0099] 2. 15％聚丙烯酰胺分离胶配制方法

[0100] 取分离胶溶液A 2ml，再取分离胶溶液B 2ml充分混匀后，加入过硫酸铵(AP)10wt％40ul，充分混匀，迅速注入两玻璃板间隙中，再加入醇或水覆盖于分离胶之上。

[0101] 3. 4％聚丙烯酰胺浓缩胶配制方法

[0102] 取浓缩胶溶液A 1ml，再取浓缩胶溶液B 1ml充分混匀后，加入过硫酸铵(AP)10wt％20ul，充分混匀，待分离胶聚合完全后，倒出覆盖层液体，用去离子水洗涤，然后将配制好的浓缩胶灌注在分离胶上，立即插入干净的配套梳子，避免气泡，待浓缩胶聚合后，拔出梳子，形成加样孔，即可进行下一步聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。

[0103] 图8为实施列5所制备的15％聚丙烯酰胺凝胶电泳后图片，泳道1为Marker，泳道2为蛋白样品。

[0104] 由图5-图8可以看出，由本发明所制备不同浓度的聚丙烯酰胺凝胶在各自对应的蛋白分子量的分离范围内，分离度都很好，且蛋白条带清晰。

[0105] 实施例6 10％聚丙烯酰胺凝胶配制

[0106] 各种浓度的聚丙烯酰胺凝胶的上层浓缩胶还可以加入色素，让浓缩胶着色而方便上样。

[0107] 1.各混合储备液组分：

[0108] 1)分离胶溶液A:100ml，取丙烯酰胺20克，甲叉双丙烯酰胺0.667克，加水搅拌溶解后定容至100ml混匀；

[0109] 2)分离胶溶液B:100ml，其中0.78MTris，0.2wt％SDS，0.2wt％四乙基乙二胺1.5wt％亚硫酸氢钠，pH值为8.8；

[0110] 3)浓缩胶溶液A:20ml，取丙烯酰胺1.933克，甲叉双丙烯酰胺0.0667克，加水搅拌溶解后定容至20ml混匀；

[0111] 4)浓缩胶溶液B:20ml其中0.2MTris，0.2wt％SDS，0.16wt％四乙基乙二胺，0.75wt％亚硫酸氢钠，pH值为6.8，加入番茄红素0.2wt％。

[0112] 5)过硫酸铵(AP)：10wt％，取过硫酸铵0.1克，加1ml水溶解混匀。

[0113] 以上试剂配制后4℃放置12天后再配制凝胶。

[0114] 2. 10％聚丙烯酰胺分离胶配制方法

[0115] 取分离胶溶液A 2.5ml，再取分离胶溶液B 2.5ml充分混匀后，加入过硫酸铵(AP)10wt％50ul，充分混匀，迅速注入两玻璃板间隙中，再加入醇或水覆盖于分离胶之上。

[0116] 3. 5％聚丙烯酰胺浓缩胶配制方法

[0117] 取浓缩胶溶液A 1ml，再取浓缩胶溶液B 1ml充分混匀后，加入过硫酸铵(AP)10wt％20ul，充分混匀，待分离胶聚合完全后，倒出覆盖层液体，用去离子水洗涤，然后将配制好的浓缩胶灌注在分离胶上，立即插入干净的配套梳子，避免气泡，待浓缩胶聚合后，拔出梳子，形成加样孔，即可进行下一步聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。

[0118] 图1为实施例6制备的10％聚丙烯酰胺凝胶，因添加着色剂番茄红素，上层为带粉色的浓缩胶，下层为无色透明分离胶；当凝胶放入Tris-Glycine电泳缓冲液中上样时，因添加有着色剂，浓缩胶和周围透明液体环境区别开，很明显能看见加样孔而方便加入样品。

[0119] 图3为实施例6制备的10％聚丙烯酰胺凝胶加入Marker和蛋白样品电泳后的图，泳道1为Marker，泳道2为蛋白样品(BSA：66KD和转角蛋白：74KD)。

[0120] 经试验发现，类胡萝卜素因不带电荷，都可以用于浓缩胶而不影响蛋白分离，如：α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、叶黄素、玉米黄质、番茄红素以及β-隐黄素等，类胡萝卜素的纯度越高越好，比如95～99.9％。且经过实验比较，番茄红素不会影响聚丙烯酰胺聚合的速度，也不会在电泳时析出而影响蛋白样品的分离效果。着色剂同样适合6～15％聚丙烯酰胺凝胶。

[0121] 实施例7 10％非变性聚丙烯酰胺凝胶配制

[0122] 1.各混合储备液组分：

[0123] 1)分离胶溶液A:100ml，取丙烯酰胺19.4667克，甲叉双丙烯酰胺0.5333克，加水搅拌溶解后定容至100ml混匀；

[0124] 2)分离胶溶液B:100ml，其中0.8MTris，0.064wt％四乙基乙二胺，0.25wt％亚硫酸氢钠，pH值为8.8。

[0125] 3)浓缩胶溶液A:20ml，取丙烯酰胺1.5573克，甲叉双丙烯酰胺0.04267克，加水搅拌溶解后定容至20ml混匀；

[0126] 4)浓缩胶溶液B:20ml其中0.2MTris，0.16wt％四乙基乙二胺，0.1wt％亚硫酸氢钠，pH值为6.8。

[0127] 5)过硫酸铵(AP)：10wt％，取过硫酸铵0.1克，加1ml水溶解混匀。

[0128] 以上试剂配制后4℃放置10天后再配制凝胶。

[0129] 2. 10％非变性聚丙烯酰胺分离胶配制方法

[0130] 取分离胶溶液A 2.5ml，再取分离胶溶液B 2.5ml充分混匀后，加入过硫酸铵(AP)10wt％50ul，充分混匀，迅速注入两玻璃板间隙中，再加入醇或水覆盖于分离胶之上。

[0131] 3. 5％非变性聚丙烯酰胺浓缩胶配制方法

[0132] 取浓缩胶溶液A 1ml，再取浓缩胶溶液B 1ml充分混匀后，加入过硫酸铵(AP)10wt％20ul，充分混匀，待分离胶聚合完全后，倒出覆盖层液体，用去离子水洗涤，然后将配制好的浓缩胶灌注在分离胶上，立即插入干净的配套梳子，避免气泡，待浓缩胶聚合后，拔出梳子，形成加样孔，即可进行下一步聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。

[0133] 图9为实施例7制备的10％非变性聚丙烯酰胺凝胶加入Marker电泳后的图。基于6～15％其他浓度的非变性聚丙烯酰胺凝胶是溶液中丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的浓度决定的，所以这个浓度范围的非变性聚丙烯酰胺凝胶按照本发明的配方都是可以实现的，其他具体步骤一样，这里不再赘述。

[0134] 对比实施例1 10％聚丙烯酰胺凝胶配制

[0135] 1.各储备液组分

[0136] 1)30％丙烯酰胺溶液：100ml，取丙烯酰胺29.2克，甲叉双丙烯酰胺0.8，加水搅拌溶解后定容至100ml混匀。

[0137] 2)2M Tris-HCl缓冲液：100ml，取Tris 24.228克，加适量水溶解，用HCl调pH至8.8，定容至100ml混匀。

[0138] 3)1M Tris-HCl缓冲液：50ml，取Tris 6.057克，加适量水溶解，用HCl调pH至6.8，定容至50ml混匀。

[0139] 4)SDS：10wt％，5ml，取SDS 0.5克，加水溶解，定容至5ml。

[0140] 5)过硫酸铵(AP)：10wt％，取过硫酸铵0.1克，加1ml水溶解混匀。

[0141] 2. 10％聚丙烯酰胺分离胶配制方法

[0142] 取蒸馏水2.2ml，30％丙烯酰胺溶液1.7ml，2M Tris-HCl溶液1ml，10％SDS 50ul充分混匀后，加入过硫酸铵(AP)10wt％50ul，充分混匀，再加入TEMED 2ul充分混匀，迅速注入两玻璃板间隙中，再加入醇或水覆盖于分离胶之上。

[0143] 3. 5％聚丙烯酰胺浓缩胶配制方法

[0144] 取蒸馏水1.4ml，30％丙烯酰胺溶液330ul，1M Tris-HCl溶液250ul，10％SDS 20ul充分混匀后，加入过硫酸铵(AP)10wt％20ul，充分混匀，再加入TEMED 2ul充分混匀，待分离胶聚合完全后，倒出覆盖层液体，用去离子水洗涤，然后将配制好的浓缩胶灌注在分离胶上，立即插入干净的配套梳子，避免气泡，待浓缩胶聚合后，拔出梳子，形成加样孔，即可进行下一步聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。

[0145] 图2为对比实施例加入TEMED制备而成的10％聚丙烯酰胺凝胶。

[0146] 图4为对比实施例所制备的10％聚丙烯酰胺凝胶加入Marker和蛋白样品电泳后的图，泳道1为Marker，泳道2为蛋白样品(BSA：66KD和转角蛋白：74KD)。从图3和图4的Marker和蛋白样品的分离效果来看，本发明所制备的聚丙烯酰胺凝胶优于传统的聚丙烯酰胺凝胶，且蛋白条带的清晰度也比较好。

[0147] 对比实施例2

[0148] 1.各储备液组分

[0149] 1)30％丙烯酰胺溶液：100ml，取丙烯酰胺29.2克，甲叉双丙烯酰胺0.8，加水搅拌溶解后定容至100ml混匀。

[0150] 2)2M Tris-HCl缓冲液：100ml，取Tris 24.228克，加适量水溶解，用HCl调pH至8.8，定容至100ml混匀。

[0151] 3)1M Tris-HCl缓冲液：50ml，取Tris 6.057克，加适量水溶解，用HCl调pH至6.8，定容至50ml混匀。

[0152] 4)SDS：10wt％，5ml，取SDS 0.5克，加水溶解，定容至5ml。

[0153] 5)过硫酸铵(AP)：10wt％，取过硫酸铵0.1克，加1ml水溶解混匀。

[0154] 以上试剂配制后4℃放置10天后再配制凝胶。

[0155] 2. 10％聚丙烯酰胺分离胶配制方法

[0156] 取蒸馏水2.2ml，30％丙烯酰胺溶液1.7ml，2M Tris-HCl溶液1ml，10％SDS 50ul充分混匀后，加入过硫酸铵(AP)10wt％50ul，充分混匀，再加入TEMED 2ul充分混匀，迅速注入两玻璃板间隙中，再加入醇或水覆盖于分离胶之上，聚丙烯酰胺凝胶未完全聚合。

[0157] 3. 5％聚丙烯酰胺浓缩胶配制方法

[0158] 取蒸馏水1.4ml，30％丙烯酰胺溶液330ul，1M Tris-HCl溶液250ul，10％SDS 20ul充分混匀后，加入过硫酸铵(AP)10wt％20ul，充分混匀，再加入TEMED 2ul充分混匀，待分离胶聚合完全后，倒出覆盖层液体，用去离子水洗涤，然后将配制好的浓缩胶灌注在分离胶上，立即插入干净的配套梳子，避免气泡，聚丙烯酰胺凝胶未完全聚合。

[0159] 最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。