干扰长链非编码RNA PVT1表达的试剂及其应用

摘要

本发明公开了一种干扰长链非编码RNA PVT1表达的试剂在制备鼻咽癌辅助治疗制剂中的应用。本发明在鼻咽癌细胞系CNE2和5‑8F中转入靶向PVT1的干扰载体，抑制PVT1的表达后，凋亡细胞比例明显增加，说明干扰长链非编码RNA PVT1表达的试剂能够用于鼻咽癌辅助治疗，具有显著的临床治疗意义。

权利要求

1.干扰长链非编码RNA PVT1表达的试剂在制备鼻咽癌辅助治疗制剂中的应用；该长链非编码RNA的序列如SEQ NO: 1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的干扰长链非编码RNA PVT1表达的试剂所需的3条干扰靶点序列如下：shRNA-1：GGACTTGAGAACTGTCCTTAshRNA-2：GCTTCTCCTGTTGCTGCTAGTshRNA-3：GCTCCACCCAGAAGCAATTCA。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的干扰长链非编码RNA PVT1表达的试剂是利用干扰靶点序列制备的RNA干扰短发夹RNA表达载体。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，针对3条干扰靶点序列，以及载体，设计可形成发夹结构的寡核苷酸单链及其反向互补序列，它们退火后即可形成两端分别带限制性酶切位点粘性末端的DNA双链；具体序列如下：shRNA-1：

5’

-GATCCCCGGACTTGAGAACTGTCCTTATTCAAGAGAGTAAGGACAGTTCTCAAGTCC TTTTTA-3’

3’

-GGGCCTGAACTCTTGACAGGAATGAAGTTCTCTCATTCCTGTCAAGAGTTCAGGAAAAATTCGA-5’

shRNA-2：

5’

-GATCCCCGCTTCTCCTGTTGCTGCTAGT TTCAAGAGA ACTAGCAGCAACAGGAGAAGC TTTTTA-3’

3’

-GGGCGAAGAGGACAACGACGATCAAAGTTCTCTTGATCGTCGTTGTCCTCTTCG AAAAATTCGA-5’shRNA-3：

5’

-GATCCCCGCTCCACCCAGAAGCAATTCA TTCAAGAGA TGAATTGCTTCTGGGTGGAGC TTTTTA-3’

3’-GGG CGAGGTGGGTCTTCGTTAAGT AAGTTCTCT ACTTAACGAAGACCCACCTCG AAAAATTCGA-

5’。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的用于RNA干扰的短发夹RNA表达载体的制备方法具体如下：

1) shRNA的设计

首先根据长链非编码RNA基因PVT1，寻找shRNA靶点，3条靶点序列如下：shRNA-1：GGACTTGAGAACTGTCCTTAshRNA-2：GCTTCTCCTGTTGCTGCTAGTshRNA-3：GCTCCACCCAGAAGCAATTCA以广泛使用的在人类基因组中没有任何靶点的Scramble序列作为阴性对照，其序列如下：Scramble：GACACGCGACTTGTACCAC

2）针对这3条靶点序列，及Scramble序列，以及OligoEngine公司pSUPER载体，设计可形成发夹结构的寡核苷酸单链及其反向互补序列，它们退火后即可形成两端分别带限制性酶切位点BglII和 HindIII粘性末端的DNA双链；具体需合成的各条寡核苷酸序列及它们配对退回后形成的DNA双链如下：shRNA-1：

5’

-GATCCCCGGACTTGAGAACTGTCCTTATTCAAGAGAGTAAGGACAGTTCTCAAGTCC TTTTTA-3’

3’

-GGGCCTGAACTCTTGACAGGAATGAAGTTCTCTCATTCCTGTCAAGAGTTCAGG AAAAATTCGA-5’shRNA-2：

5’

-GATCCCCGCTTCTCCTGTTGCTGCTAGTTTCAAGAGAACTAGCAGCAACAGGAGAAGC TTTTTA-3’

3’

-GGGCGAAGAGGACAACGACGATCAAAGTTCTCTTGATCGTCGTTGTCCTCTTCG AAAAATTCGA-5’shRNA-3：

5’

-GATCCCCGCTCCACCCAGAAGCAATTCATTCAAGAGATGAATTGCTTCTGGGTGGAGC TTTTTA-3’

3’-GGGCGAGGTGGGTCTTCGTTAAGTAAGTTCTCTACTTAACGAAGACCCACCTCG AAAAATTCGA-5’Scramble

5’-GATCCCCGACACGCGACTTGTACCACTTCAAGAGAGTGGTACAAGTCGCGTGTC TTTTTA-3’ 3’-GGGCTGTGCGCTGAACATGGTGAAGTTCTCTCACCATGTTCAGCGCACAG AAAAATTCGA-5’

3) shRNA载体构建

化学合成上述3个shRNA和对照的8条单链oligo序列，将合成好的oligo用oligo annealing buffer溶解成20μM，互补单链各取10μl混合；然后将oligo混合物在PCR仪中95℃加热5分钟，然后自然冷却至室温，形成双链oligo片段；

用Bgl II和Hind III双酶切pSUPER质粒，回收3.1kb的载体片段，将退火后的粘性末端的DNA和酶切回收的载体按照3:1的物质的量的比例混合，用T4连接酶，16℃连接过夜；转化E.coil感受态，挑选转化子，菌落PCR以及测序鉴定，再用Cla Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切构建好的pSUPER质粒，2%的琼脂糖DNA凝胶电泳，以空白pSUPER为空白对照，判断插入了目的片段的阳性克隆，将得到的包含PVT1干扰序列的pcSUPER质粒转化感受态大肠杆菌，以扩增质粒。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，将所述的表达载体负载到多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒上制成纳米球。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，

多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒是运用OP-10、环己烷、氨水的微乳液自组装技术进行硅纳米颗粒的合成，并利用硅纳米颗粒的表面能和离子静电作用进行多聚赖氨酸表面修饰，制备得到。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，制备多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒：

1)将OP-10、环己烷和氨水混合，室温搅拌均匀后加入正硅酸异酯，继续搅拌至聚合完成，加入等体积丙酮，超声分散，离心，双蒸水洗涤三次，离心收集沉淀于80℃干燥，研细得粒径范围10-50 nm的硅纳米颗粒；其中H2O与OP-10及H2O与正硅酸异酯的摩尔比为2~10、氨水浓度为1.6 28%、正硅酸异酯在环己烷中的摩尔浓度为0.1 3 mol/L；

~ ~

将硅纳米颗粒按0.1~10mg/ml重悬于0.6 M Na2CO3溶液中，超声分散，离心，弃上清，再将沉淀物按0.1 10mg/ml重悬于pH 7.4的PBS中，超声分散，加多聚赖氨酸，终浓度为4~ ~

15nmol/mL，充分混匀，室温混摇；离心，弃上清，沉淀按0.1 10mg/ml重悬于双蒸水中，得到~多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒。

9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，将多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒超声分散，每毫升纳米颗粒悬液加入10 50µg长链非编码RNA PVT1的干扰载体，混合，室温静置~使其结合。

说明书

干扰长链非编码RNA PVT1表达的试剂及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及干扰长链非编码RNA PVT1表达的试剂在制备鼻咽癌辅助治疗制剂中的应用方法。

背景技术

[0002] 人类基因组计划及其后续的DNA元件百科全书计划(The Encyclopedia of DNA Elements Project,ENCODE)研究成果表明，蛋白编码基因序列仅占人类基因组序列的1-3％，而人基因组中绝大部分可转录的序列为长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)。LncRNA广泛地存在于各种生物中，且随着生物复杂程度的升高，基因组中lncRNA序列的比例也相应地增大，提示lncRNA在生物进化过程中有重要意义。随着lncRNA不断被发现，它们的功能逐渐被诠释，科学家们发现lncRNA广泛而活跃地参与到生命活动不同层面的功能调控中，作为一个崭新的领域，已经成为国际生命科学研究领域新的前沿与热点。

[0003] LncRNA可作为功能蛋白质的信号(signal)、诱导(guide)、诱饵(decoy)或支架 (scaffold)分子等多种方式，在染色质重构、基因转录、翻译及蛋白修饰等多重水平调控基因的表达，并在包括发育、免疫、生殖等基本生理过程中扮演了不可替代的角色，更重要的是，lncRNA的表达与功能失调已经与包括恶性肿瘤在内的人类多种疾病紧密联系在了一起。因此，深入研究lncRNA的功能，揭示由lncRNA 介导的遗传信息传递方式和表达调控网络，不仅可以从蛋白编码基因以外的角度重新注释和阐明基因组的结构与功能，深入发现生命活动的本质和规律，还有望从一个新的视角认识包括肿瘤在内的多种人类常见疾病的发病机理，并为这些疾病的诊断与治疗提供新的分子标志物与治疗靶点。

[0004] 鼻咽癌是常见高发的头颈部恶性肿瘤，容易发生颈部淋巴结转移，预后较差，放射治疗是目前鼻咽癌临床上主要的治疗方案，部分鼻咽癌患者由于癌细胞存在放射抵抗(Radioresistance)，也就是对放射治疗不敏感，放射线不能完全杀死肿瘤细胞，残存的肿瘤细胞最终复发，转移，导致患者的死亡。研究表明，这种肿瘤的发生发展是多基因参与、多步骤、多阶段的复杂过程，LncRNA在鼻咽癌的发生发展过程中可能也起到了重要的作用，同时lncRNA也可能参与了鼻咽癌细胞反射敏感性的调控。最近我们利用lncRNA芯片，构建了鼻咽癌活检组织及正常对照样品中lncRNA的表达谱，从中筛选了一些在鼻咽癌中差异表达的 lncRNAs，经扩大样本实时荧光定量PCR验证，证实lncRNA PVT1在鼻咽癌中表达显著上调，表明针对该lncRNA的检测制剂可以用于鼻咽癌的辅助诊断。随后，我们进一步增加样本，在94例有临床随访资料的鼻咽癌石蜡存档标本中，通过原位杂交(in  situ hybridization)的方法检测了PVT1的表达水平，发现PVT1表达高的患者更容易发生放疗抵抗，其生存时间短于该lncRNA表达低的患者，因此针对该lncRNA的检测制剂也可以用于鼻咽癌的疗效预测和预后判断。

[0005] 我们通过设计并合成靶向PVT1的短发夹RNA(short-hairpin RNA,shRNAs) 序列，构建了靶向PVT1的RNA干扰载体，转染到鼻咽癌细胞株中，并证实了靶向干扰PVT1的表达可明显增强鼻咽癌细胞的放疗敏感性。将PVT1的RNA 干扰载体负载到多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒上制成纳米基因转运体，多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒可保护PVT1的RNA干扰载体免受核酸酶降解，延长作用时间，且有更高的转染效率。因此针对该lncRNA的干扰制剂靶向抑制该lncRNA 在鼻咽癌细胞中的表达可以诱导鼻咽癌细胞对放疗更加敏感，从而可以作为新型放疗增敏剂，用于鼻咽癌的辅助治疗。

发明内容

[0006] 本发明的目的是提供干扰长链非编码RNA PVT1表达的试剂在制备鼻咽癌辅助治疗制剂中的应用；该长链非编码RNA的序列如SEQ NO:1所示。

[0007] 所述的干扰长链非编码RNA PVT1表达的试剂所需的3条干扰靶点序列如下：

[0008] shRNA-1：GGACTTGAGAACTGTCCTTA

[0009] shRNA-2：GCTTCTCCTGTTGCTGCTAGT

[0010] shRNA-3：GCTCCACCCAGAAGCAATTCA。

[0011] 所述的干扰长链非编码RNA PVT1表达的试剂是利用干扰靶点序列制备的 RNA干扰短发夹RNA表达载体。

[0012] 针对3条干扰靶点序列，以及载体，设计可形成发夹结构的寡核苷酸单链及其反向互补序列，它们退火后即可形成两端分别带限制性酶切位点粘性末端的 DNA双链；具体序列如下：

[0013] shRNA-1：

[0014]

[0015] shRNA-2：

[0016]

[0017] shRNA-3：

[0018]

[0019] 所述的用于RNA干扰的短发夹RNA表达载体的制备方法具体如下：

[0020] 1)shRNA的设计

[0021] 首先根据长链非编码RNA基因PVT1，寻找shRNA靶点，3条靶点序列如下：

[0022] shRNA-1：GGACTTGAGAACTGTCCTTA

[0023] shRNA-2：GCTTCTCCTGTTGCTGCTAGT

[0024] shRNA-3：GCTCCACCCAGAAGCAATTCA

[0025] 以广泛使用的在人类基因组中没有任何靶点的Scramble序列作为阴性对照，其序列如下：

[0026] Scramble：GACACGCGACTTGTACCAC

[0027] 2)针对这3条靶点序列，及Scramble序列，以及OligoEngine公司pSUPER 载体，设计可形成发夹结构的寡核苷酸单链及其反向互补序列，它们退火后即可形成两端分别带限制性酶切位点BglII和HindIII粘性末端的DNA双链；具体需合成的各条寡核苷酸序列及它们配对退回后形成的DNA双链如下：

[0028] shRNA-1：

[0029]

[0030] shRNA-2：

[0031]

[0032] shRNA-3：

[0033]

[0034] Scramble

[0035]

[0036] 3)shRNA载体构建

[0037] 化学合成上述3个shRNA和对照的8条单链oligo序列，将合成好的oligo 用oligo annealing buffer溶解成20μM，互补单链各取10μl混合；然后将oligo混合物在PCR仪中95℃加热5分钟，然后自然冷却至室温，形成双链oligo片段；

[0038] 用Bgl II和Hind III双酶切pSUPER质粒，回收3.1kb的载体片段，将退火后的粘性末端的DNA和酶切回收的载体按照3:1的物质的量的比例混合，用T4 连接酶，16℃连接过夜；转化E.coil感受态，挑选转化子，菌落PCR以及测序鉴定，再用ClaⅠ和EcoRⅠ酶切构建好的pSUPER质粒，2％的琼脂糖DNA凝胶电泳，以空白pSUPER为空白对照，判断插入了目的片段的阳性克隆，将得到的包含PVT1干扰序列的pcSUPER质粒转化感受态大肠杆菌，以扩增质粒。

[0039] 将所述的表达载体负载到多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒上制成纳米球。

[0040] 多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒是运用OP-10、环己烷、氨水的微乳液自组装技术进行硅纳米颗粒的合成，并利用硅纳米颗粒的表面能和离子静电作用进行多聚赖氨酸表面修饰，制备得到。

[0041] 制备多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒：

[0042] 1)将OP-10、环己烷和氨水混合，室温搅拌均匀后加入正硅酸异酯，继续搅拌至聚合完成，加入等体积丙酮，超声分散，离心，双蒸水洗涤三次，离心收集沉淀于80℃干燥，研细得粒径范围10-50nm的硅纳米颗粒；其中H2O与OP-10及H2O与正硅酸异酯的摩尔比为2～10、氨水浓度为 1.6～28％、正硅酸异酯在环己烷中的摩尔浓度为0.1～3mol/L；

[0043] 2)将硅纳米颗粒按0.1～10mg/ml重悬于0.6M NaCO3溶液中，超声分散，离心，弃上清，再将沉淀物按0.1～10mg/ml重悬于pH 7.4的PBS中，超声分散，加多聚赖氨酸，终浓度为4～15nmol/mL，充分混匀，室温混摇；离心，弃上清，沉淀按0.1～10mg/ml重悬于双蒸水中，得到多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒。

[0044] 将多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒超声分散，每毫升纳米颗粒悬液加入10～50 ug长链非编码RNA PVT1的干扰载体，混合，室温静置使其结合。

[0045] 本发明在鼻咽癌细胞系CNE2和5-8F中转入靶向PVT1的干扰载体，抑制 PVT1的表达后，凋亡细胞比例明显增加，说明干扰长链非编码RNA PVT1表达的试剂能够用于鼻咽癌辅助治疗，具有显著的临床治疗意义。

附图说明

[0046] 图1为实时荧光定量PCR技术验证lncRNA PVT1在鼻咽癌和正常鼻咽上皮中的表达情况，PVT1在鼻咽癌(T)中的表达比正常鼻咽上皮(N)中显著提高。

[0047] 图2为原位杂交检测PVT1在鼻咽癌及正常鼻咽上皮中的表达情况，

[0048] 正常鼻咽上皮(NPE)中表达水平较低(仅在6例正常鼻咽上皮组织中检测到有高表达，其余27例中检测表达低或不表达)，而在63.8％的鼻咽癌(94例鼻咽癌组织中的60例)中检测到有PVT1的高表达；P<0.001。

[0049] 图3为鼻咽癌中PVT1的表达与鼻咽癌患者放疗敏感性相关，

[0050] 在92例有临床随访资料的鼻咽癌患者中，44例为放疗抵抗(Radioresistant，即对放疗不够敏感)，48例为放疗敏感(Radiosensitive)，在放疗敏感组60.4％的患者(29例)鼻咽癌组织中PVT1低表达，而在放疗抵抗组仅11.4％(5例)中检测到有PVT1的高表达；P<0.001。

[0051] 图4为鼻咽癌中PVT1的表达与鼻咽癌患者预后的关系，

[0052] 鼻咽癌中PVT1的高表达与鼻咽癌患者的不良预后相关，即PVT1高表达 (high)的患者总的生存时间(Over-all survival，左)和无复发生存时间(Relapse-free sruvival，右)要明显低于PVT1低表达或不表达的患者(Low)。

[0053] 图5为在鼻咽癌细胞中导入PVT1的干扰载体，可显著抑制PVT1在鼻咽癌细胞中的表达，

[0054] 在鼻咽癌细胞系CNE2和5-8F中导入靶向PVT1的干扰载体(siPVT1)后，实时荧光定量PCR方法检测了鼻咽癌细胞中PVT1的表达情况，PVT1的表达均受到明显的抑制。阴性对照(NC)为scramble干扰载体。

[0055] 图6为在鼻咽癌细胞中导入PVT1的干扰载体抑制PVT1表达后，细胞对放射治疗更加敏感，

[0056] 鼻咽癌细胞系CNE2和5-8F中导入靶向PVT1的干扰载体(siPVT1)抑制 PVT1的表达后，细胞分别接受0，2，4，6，8Gy剂量的放射线照射，随后细胞继续培养12天，克隆集落形成实验表明与阴性对照(NC，转染scramble干扰载体的细胞)相比，抑制PVT1表达后，CNE2和5-8F细胞形成的集落数明显减少，表明细胞对放射治疗更加敏感。

[0057] 图7为在鼻咽癌细胞中导入PVT1的干扰载体抑制PVT1表达后，细胞凋亡显著增加，[0058] 放射线照射诱导肿瘤细胞凋亡是放疗发挥杀伤肿瘤细胞的主要原因，在鼻咽癌细胞系CNE2和5-8F中转入靶向PVT1的干扰载体，抑制PVT1的表达后，流式细胞仪检测鼻咽癌细胞的凋亡情况，发现抑制了PVT1表达的鼻咽癌细胞在受到放射线照射后，凋亡细胞的比例明显升高，进一步证实了抑制PVT1的表达可以达到放疗增敏的作用。

具体实施方式

[0059] 以下结合具体实施方式进一步说明本发明，而非限制本发明。

[0060] 实施例1，实时荧光定量PCR法检测证实PVT1在鼻咽癌中表达上调

[0061] 1.材料与方法：

[0062] 收集32例正常鼻咽上皮组织和61例鼻咽癌组织，抽提总RNA，2μg RNA 经逆转录成cDNA后，进行实时荧光定量PCR。PVT1正向引物为5’-TGG CTG AGA GGG TTG AGA TC-3’如SEQ NO:2所示，和反向引物5’-GCT GTA TGT GCC AAG GTC AC-3’如SEQ NO:3所示。

[0063] 用于对照的GAPDH正向引物为5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’如 SEQ NO:4所示，和反向引物5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’，如SEQ NO:5 所示。

[0064] 实时荧光定量PCR反应体系

[0065]

[0066] 实时荧光定量PCR反应步骤

[0067] 1 94℃          5min

[0068] 2 95℃          10sec

[0069] 3 58℃          30sec

[0070] 4 72℃          20sec

[0071] 5 Plate read

[0072] 6 82℃          30sec

[0073] 7 Plate read

[0074] 8 Go to step 2 for more 39 times

[0075] 9 Perform melting curve from 55.0℃to 95.0℃，read every 0.2℃，hold for 1 sec

[0076] 反应结束后确认实时荧光定量PCR的扩增曲线和熔解曲线，各基因的表达强度根据CT值(threshold cycle values)、内参基因(GAPDH)标化后，采用 group t-test检验计算P值。

[0077] 2.结果

[0078] PVT1在正常对照组织中不表达或者表达很低，而在鼻咽癌组织中高表达 P<0.001(图1)

[0079] 实施例2，原位杂交检测发现PVT1在鼻咽癌中的表达情况，及其与患者预后和放疗敏感性的相关性

[0080] 1.材料方法

[0081] 1.1设计并合成杂交探针

[0082] 为了采用原位杂交方法检测PVT1的表达情况，我们设计了针对原位杂交检测PVT1表达的寡核苷酸探针及阳性对照两组原位杂交寡核苷酸探针各3条。

[0083] 用于原位杂交检测PVT1表达的寡核苷酸探针：

[0084] PVT1探针1：5’-GGTCGGACTAGAAAACCGGTCTTCCTCTAATTTT-3’如 SEQ NO:6所示，[0085] PVT1探针2：5’-GAGACTGTAAAAACTTCTCAGGTCTTAGGA-3’如SEQ NO:7所示，[0086] PVT1探针3：5’-CTCATAAAACTCTAACCTCTTAATTCTCGGTCAG-3’如SEQ NO:8所示。

[0087] 阳性对照探针(检测看家基因GAPDH)：

[0088] GAPDH探针1：5'-CCACTTTACCAGAGTTAAAAGCAGCCCTGG-3'，如 SEQ NO:9所示，[0089] GAPDH探针2：5'-CAGTAGAGGCAGGGATGATGTTCTGGAGAG-3'，如 SEQ NO:10所示，[0090] GAPDH探针3：5'-GTCAGAGGAGACCACCTGGTGCTCAGTGTA-3'，如 SEQ NO:11所示。

[0091] 采用化学合成方法合成上述设计的各基因特异性寡核苷酸探针序列。

[0092] 1.2寡核苷酸探针标记试剂盒和原位杂交检测试剂

[0093] 地高辛寡核苷酸加尾试剂(Dig Oligonucleitide Tailing Kit 2nd Generation，Roche公司)，抗地高辛-辣根过氧化物酶复合物检测试剂盒(Anti-Digoxigenin-POD，Fab fragments，Roche公司)，增强原位表达检测信号的TSA信号放大系统(TSATM Biotin System，NEL700试剂盒，PerkinElmer公司)， DAB染色试剂盒(北京中山公司)，20x柠檬酸钠缓冲溶液(saline sodium citrate, SSC)，硫酸葡聚糖(Dextran sulphate)，去离子甲酰胺(Deionized Formamide)，多聚腺苷酸(polyadenylic acid，Poly A)，多聚脱氧腺苷酸(polydeoxyadenylic acid， Poly dA)，变性剪切的蛙精DNA(denatured and sheared salmon sperm DNA， ssDNA)，酵母转运RNA(yeast t-RNA，tRNA)，二硫苏糖醇(DTT)，50x邓罕氏缓冲液(Denhardts’s solution)，磷酸缓冲液(PBS buffer)，胃蛋白酶K，牛血清白蛋白(BSA)，三乙醇胺(TEA)，TNB Buffer(0.1M Tris-HCl，pH7.5，0.15M NaCL，0.5％Blocking Reagent)，TNT Buffer(0.1M Tris-HCl，pH7.5，0.15M NaCL， 0.05％Tween 20)，醋酸酐，阻断试剂(Blocking reagent agent，Roche公司)。

[0094] 1.3其他主要试剂和材料

[0095] 无水乙醇、90％酒精、70％酒精、50％酒精、松节油、双蒸水、PBS缓冲液 (pH7.2～7.4，NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L，KH2PO4 1.4mmol/L)；3％甲醇-双氧水溶液(80％甲醇和30％双氧水配置)；0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液(citrate buffer,CB，pH6.0±0.1，9ml 0.1M柠檬酸溶液和41ml 0.1M 柠檬酸钠溶液加入450ml蒸馏水中临时配置后再校正工作液pH值)；0.1％胰蛋白酶；苏木素；1％盐酸酒精(1ml浓盐酸+99ml 70％酒精配置)；封片胶(PTS Cure MountⅡ)；专用盖玻片(480×240mm2)定制于郑州玻璃仪器厂。Leica低熔点(58℃)石蜡，国产蜂蜡，无水酒精，二甲苯，10％中性多聚甲醛(0.01mol/L, pH7.4，DEPC双蒸水和PBS缓冲液配制)，苏木素，伊红，中性封片树胶，盖玻片，载玻片。

[0096] 1.4标记探针

[0097] 利用3-tailing DIG Olignucleutide Kit进行寡核苷酸探针标记，反应体系如下。

[0098] 100pmol oligonucleotide+ddH2O＝9μl(control:control oligonucleutide 5μl+ ddH2O 4μl)

[0099]

[0100]

[0101] 混匀，稍离心。37℃水浴反应30min，加2μl EDTA(0.2M，PH 8.0)中止反应。

[0102] 1.5寡核苷酸探针标记后纯化

[0103] 为了增加标记探针的纯度，需对已标记的探针进行纯化，具体操作如下：

[0104] 1)探针反应混合物(22μl)+2.5μl 4M LiCL+75μl 100％冷乙醇(-20℃).[0105] 2)-70℃沉淀60min，or-20℃2h。

[0106] 3)13.000×g 4℃离心15min。

[0107] 4)弃上清，用50μl冰冷的70％(V/V)乙醇洗涤。

[0108] 5)13.000xg 4℃，离心5min。

[0109] 6)弃上清，真空4℃干燥。

[0110] 7)用无菌双蒸水重溶探针。

[0111] 1.6原位杂交检测存档石蜡切片中PVT1的表达

[0112] 石蜡切片杂交前处理

[0113] 1)4℃保存的石蜡切片置于58℃烤片30min，熔化表面石蜡。

[0114] 2)二甲苯依次脱蜡3×5min。

[0115] 3)梯级酒精洗涤，100％酒精2×2min→95％酒精1×5min→70％酒精1 ×5min→50％酒精1×5min→DEPC水洗涤2×3min→DEPC-PBS洗涤2×5min。

[0116] 4)滴加300μl胃蛋白酶K(10μg/ml)于切片上，37℃消化20min。

[0117] 5)切片入PBS(0.1M PBS+2mg/ml谷氨酸)洗涤1min，中止反应。

[0118] 6)切片入0.2N HCL，于37℃反应20-30min，增加组织的通透性。

[0119] 7)切片用4％多聚甲醛(0.1M PBS溶解)后固定10min，室温。

[0120] 8)为了增加组织阳性杂交强度，对切片进行乙酰处理。切片入0.25％乙酸酐BufferⅠ(0.1M三乙醇胺)，室温10min。

[0121] 9)1M PBS洗涤2×5min。

[0122] 预杂交和杂交

[0123] 预杂交：-20℃保存的预杂交液，先置于37℃孵育60min，预杂交液的用量为50μl，石蜡膜履盖切片，37℃湿盒中预杂交2小时。(预杂交液成份包括：2XSSC，10％Dextran sulphate，1X Denhardt’s solution，50mM Phosphate Buffer(PH 7.0)， 50mM DTT，250μl，100μg/ml poly A，5μg/ml poly dA，250μg/ml yeast t-RNA， 500μg/ml ssDNA，47％Deionized formamide)。

[0124] 1)移去石蜡膜，甩掉预杂交液，切片置于2×SSC中5min。

[0125] 2)杂交反应：37℃杂交过夜(18-20h)。每一切片加入250μl杂交液并用石蜡膜履盖。预杂交液中加入相应的探针就成为杂交液。杂交液在预杂交时配制，放置37℃孵育，使探针充分溶解于杂交液中，本实验用多条寡核苷酸探针混合，按每一探针500ng/ml浓度配制成探针杂交液。地高辛加尾标记试剂盒标记探针浓度计算依据：每一探针的浓度按其与阳性定量探针时检测反应时显色进行比对和100pmol 30个碱基的裸探针标记反应理论探针产量为900ng两种标准进行综合计算出标记探针的浓度。

[0126] 3)杂交后洗涤，切片浸入2×SSC，10min，揭去石蜡膜。依次于摇床上摇动洗涤，2×SSC(0.5％SDS)，2×15min→0.25×SSC(0.5％SDS)，2× 15min。

[0127] 杂交后显色检测反应

[0128] 1)采用Anti-Digoxigenin-POD检测地高辛探针与mRNA结合复合物；TSA 放大系统增强原位杂交反应显色反应的阳性信号，DAB显色。

[0129] 2)切片转至TNT缓冲液中，3×5min。

[0130] 3)滴加TNB阻断缓冲液，300μl/TMAs，室温，30min。

[0131] 4)吸去多余阻断剂，1:100稀释的Anti-Digoxigenin-POD(TBS+0.1％Triton X-100+1％阻断剂)，室温4小时。

[0132] 5)TNT Buffer(0.1M Tris-CL，pH7.5，0.15M NaCL，0.05％Tween 20)洗涤， 3x5min。

[0133] 6)切片上滴加信号放大试剂Biotinyl Tyamid，300μl/TMAs，(Biotinyl Tyramid贮存液：Biotinyl Tyramid溶解于0.2ml DMSO，Biotinyl Tyramid 工作液：1×稀释液，1:50稀释Biotinyl Tyramid贮存液)，室温10分钟。

[0134] 7)TNT洗，3×5min。

[0135] 8)切片滴加SA-HRP(链霉卵白素-辣根过氧化物酶)，300μl/TMAs，室温 30min。

[0136] 9)TNT洗，3×5min。

[0137] 10)蒸溜水洗涤，1×1min。

[0138] 11)DAB显色，显微镜下控制显色反应。

[0139] 12)苏木素复染，

[0140] 13)酒精梯级脱水，切片干燥。

[0141] 14)滴加封片胶，相应规格的盖玻片盖片，紫外灯下交联切片1min。

[0142] 1.7结果判断及标准

[0143] 应用光学显微镜分别在低倍和高倍镜下进行观察，首先观察目标RNA的阳性表达信号在观察目标细胞内的定位：位于细胞核、细胞浆或细胞膜。

[0144] 再分别以该检测RNA表达部位阳性信号的强度和阳性表达的细胞数两种标准进行综合评分，判断标准为：(1)依据阳性细胞染色强度判断：a.细胞无染色，记0分；b.细胞染成浅棕色为弱阳性，记1分；c.细胞染成棕色且无背景着色，或细胞染成深棕色并有浅棕色背景为中等阳性，记2分；d.细胞染成深棕色且无背景着色为强阳性，记3分。(2)依据阳性细胞表达数计分：a.无阳性细胞表达，记0分；b.阳性表达细胞数≤25％，记1分；c.25％＜阳性细胞数＜50％，记2分；d. 阳性表达细胞数≥50％，记3分。

[0145] 为了尽量降低评分结果的主观因素，由两位病理学专家分别按上述标准之一各自进行判断和评分，再将两者评分相乘，结果为：①0分者最终计为0分，认为阴性表达；②1分和2分者最终计为1分，认为弱阳性表达；③3分和4分者最终计为2分，认为中等阳性表达；④6分到9分者最终计为3分，认为强阳性表达。

[0146] 1.8分析和统计软件

[0147] 应用SPSS13.0统计软件对实验结果进行统计学分析，两两比较用χ2test或 Fisher exact test，相关性分析采用Spearmen correlation方法；P＜0.05即差异有统计学意义。生存曲线分析采用Kaplan-Meier method及log-rank test；多变量分析采用Cox’s proportional hazards model；P＜0.05即差异有统计学意义。

[0148] 2结果

[0149] 2.1 PVT1在鼻咽癌中的表达比正常对照组织中的表达显著升高，且与放疗敏感性相关

[0150] PVT1在63.8％的鼻咽癌组织中(60/94例)有高表达，而仅在18.2％(33 例正常组织样本中的6例)的正常鼻咽上皮组织中有高表达(图2)，两者之间具有明显的统计学差异(P<0.001)。在94例鼻咽癌患者中，92例有临床随访资料，  44例为放疗抵抗(Radioresistant，即对放疗不够敏感)，48例为放疗敏感 (Radiosensitive)，在放疗敏感组60.4％的患者(29例)鼻咽癌组织中PVT1低表达，而在放疗抵抗组仅11.4％(5例)中检测到有PVT1的低表达；P<0.001。 (图3)

[0151] 2.2 PVT1高表达的鼻咽癌患者预后较差

[0152] 我们对92例鼻咽癌患者进行了电话随访，详细询问了他们的首发时间、治疗情况、有无复发、有无再患其他疾病、复发及死亡时间等，并登记了生存时间和状态，并对鼻咽癌组织中PVT1的表达与病人的生存时间和状态进行的生存分析，发现PVT1高表达患者平均生存时间明显短于PVT1低表达或不表达的患者 (图4)。说明PVT1是一个与鼻咽癌预后相关的分子标记，该lncRNA表达高，病人预后差。

[0153] 实施例3，构建shRNA载体干扰PVT1的表达

[0154] 1.材料方法

[0155] 1.1试剂及试剂盒

[0156] 限制性内切酶Hind III、Bgl II、EcoR I及Cla I，T4DNA连接酶等购自TakaRa 公司；

[0157] TRIZOLTM Reagent(Invitrogen)；

[0158] 质粒抽提试剂盒(#D6943-01，OMEGA)；

[0159] 胶回收试剂盒(#M5212，OMEGA)；

[0160] 逆转录试剂盒(#A3500，Promega)；

[0161] 抗生素G418(Ameresc)。

[0162] 1.2 shRNA的设计

[0163] 首先将PVT1序列输入Invitrogen公司的Block-It RNAi designer软件，寻找该lncRNA的shRNA最佳靶点，挑选最佳的3条相应的靶点序列如下：

[0164] shRNA-1：GGACTTGAGAACTGTCCTTA如SEQ NO:12所示，

[0165] shRNA-2：GCTTCTCCTGTTGCTGCTAGT如SEQ NO:13所示，

[0166] shRNA-3：GCTCCACCCAGAAGCAATTCA如SEQ NO:14所示，

[0167] 以广泛使用的在人类基因组中没有任何靶点的Scramble序列作为阴性对照，其序列如下：

[0168] Scramble：5’-GACACGCGACTTGTACCAC-3’如SEQ NO:15所示。

[0169] 针对这3条lncRNA靶点序列，及Scramble序列，根据OligoEngine公司 pSUPER载体说明书，设计可形成发夹结构的寡核苷酸单链及其反向互补序列，它们退火后即可形成两端分别带限制性酶切位点BglII和HindIII粘性末端的 DNA双链。具体需合成的各条寡核苷酸序列及它们配对退火后形成的DNA双链如下：

[0170] shRNA-1：

[0171]

[0172] 如SEQ NO:16、17所示，

[0173] shRNA-2：

[0174]

[0175] 如SEQ NO:18、19所示，

[0176] shRNA-3：

[0177]

[0178] 如SEQ NO:20、21所示，

[0179] Scramble

[0180]

[0181]

[0182] 如SEQ NO:22、23所示。

[0183] 两条互补配对的DNA退火后，左边是限制性内切酶Bgl II的粘性末端，右边是Hind III的粘性末端。

[0184] 1.3 shRNA载体构建

[0185] 化学合成上述4个shRNA对应的8条单链oligo序列，将合成好的oligo用oligo annealing buffer溶解成20μM，互补单链各取10μl混合。然后将oligo混合物在PCR仪中95℃加热5分钟，然后自然冷却至室温，形成双链oligo片段。

[0186] 用Bgl II和Hind III双酶切pSUPER质粒，回收3.1kb的载体片段，将退火后的粘性末端的DNA和酶切回收的载体按照3:1的物质量的比例混合，用T4 连接酶，16℃连接过夜。转化E.coil感受态，挑选转化子，菌落PCR以及测序鉴定，再用ClaⅠ和EcoRⅠ酶切构建好的pSUPER质粒，2％的琼脂糖DNA凝胶电泳，以空白pSUPER为空白对照，判断插入了目的片段的阳性克隆，阳性克隆测序验证后用于干扰细胞内PVT1的表达。

[0187] 1.4细胞培养与转染

[0188] 鼻咽癌细胞系CNE2和5-8F购自中南大学细胞中心，细胞培养所用RPMI 1640培基和胎牛血清，及消化细胞所用的胰蛋白酶均为美国Gibco公司产品。

[0189] 将生长状态良好的鼻咽癌细胞系CNE2和5-8F按2×105个细胞/孔接种于6 孔板中，将6孔板置于37℃，5％CO2培养箱中，待培养细胞生长至50-70％密度即可开始shRNA表达载体的转染；转染过程如下：

[0190] 在无菌EP管中加入3μl的lipofectamine 2000于100μl无血清培养基中混匀静置5min；

[0191] 将构建的shRNA表达载体加入100μl无血清培养基中；然后与上述包含 lipofectamine的100μl无血清培养基温和混匀，室温静置30分钟，使DNA与脂质体形成复合体；

[0192] 用D-Hank's液洗涤细胞3次；

[0193] 将上述混合物中加入800μl无血清培养基(无抗生素)，温和混匀后加入6 孔板中的1个孔；

[0194] 将6孔板置于CO2培养箱中，37℃培养6小时，然后弃上清，加入完全培养基继续培养48小时。

[0195] 1.5实时定量PCR检测shRNA干扰lncRNA表达的效果：

[0196] 将各种shRNA载体转染后的鼻咽癌细胞抽提总RNA，2μg RNA经逆转录成 cDNA后，进行实时荧光定量PCR。PVT1引物为5’-TGG CTG AGA GGG TTG AGA TC-3’，和5’-GCT GTA TGT GCC AAG GTC AC-3’。

[0197] 用于对照的GAPDH引物为5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’和  5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’,

[0198] 实时荧光定量PCR反应体系

[0199]

[0200] 实时荧光定量PCR反应步骤

[0201] 1 94℃        5min

[0202] 2 95℃        10sec

[0203] 3 58℃        30sec

[0204] 4 72℃        20sec

[0205] 5 Plate read

[0206] 6 82℃        30sec

[0207] 7 Plate read

[0208] 8 Go to step 2 for more 39 times

[0209] 9 Perform melting curve from 55.0℃to 95.0℃，read every 0.2℃，hold for 1 sec

[0210] 反应结束后确认实时荧光定量PCR的扩增曲线和熔解曲线，各基因的表达强度根据CT值(threshold cycle values)、内参基因(GAPDH)标化后，采用 group t-test检验计算P值。

[0211] 2.结果

[0212] 这三个shRNA载体转染鼻咽癌细胞CNE2和5-8F后，均可显著下调鼻咽癌细胞中PVT1的表达水平(图5)。

[0213] 实施例4，制备荷载shRNA干扰载体的纳米颗粒抑制鼻咽癌细胞中PVT1的表达[0214] 1.材料方法

[0215] 1.1制备多聚赖氨酸包被的硅纳米颗粒

[0216] 多聚赖氨酸包被的硅纳米颗粒是运用OP10/环己烷/氨水微乳液自组装技术进行硅纳米颗粒(silica nanoparticle,SiNP)的合成，并利用硅纳米颗粒的表面能和通过离子静电作用，制备多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒；所述的纳米颗粒可以由以下方法制备得到：

[0217] 1)将OP-10、环己烷和氨水混合，室温搅拌均匀后加入正硅酸异酯(TEOS)，继续搅拌至聚合完成，加入等体积丙酮，超声分散，离心，双蒸水洗涤三次，离心收集沉淀于80℃干燥，研细得硅纳米颗粒(SiNP)。其中H2O与OP-10 及H2O与TEOS的摩尔比为2～10、氨水浓度为1.6～28％、TEOS在环己烷中的摩尔浓度为0.1～3mol/L。

[0218] 2)将SiNP按0.1～10mg/ml重悬于0.6M NaCO3溶液中，超声分散，离心，弃上清，再将沉淀物按0.1～10mg/ml重悬于PBS(pH 7.4)中，超声分散，加多聚赖氨酸(终浓度为4～15nmol/mL)，充分混匀，室温混摇；离心，弃上清，沉淀重悬于双蒸水中，得到多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒。多聚赖氨酸的终浓度为4～15nmol/mL。

[0219] 1)将改性硅纳米颗粒超声分散，按质量比5～30:1与实施例3中所述的靶向PVT1的RNA干扰载体混合，室温静置使其结合。

[0220] 1.2细胞培养与转染

[0221] 将生长状态良好的鼻咽癌细胞5-8F、HK2和HNE2按2×105个细胞/孔接种于6孔板中，将6孔板置于37℃，5％CO2培养箱中，待培养细胞生长至50-70％密度即可开始PVT1真核表达载体的转染；转染过程如下：

[0222] 在无菌EP管中加入100μl制备好的携带PVT1真核表达质粒的多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒悬液，与100μl无血清培养基温和混匀；用D-Hank's液洗涤细胞3次；将上述混合物中加入800μl无血清培养基(无抗生素)，温和混匀后加入6孔板中的1个孔；将6孔板置于CO2培养箱中，37℃培养6小时，然后弃上清，加入完全培养基继续培养过夜。用携带Scramble序列的多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒作为实验对照。

[0223] 1.3放疗敏感性实验1——克隆形成

[0224] 抑制PVT1表达对鼻咽癌细胞放疗敏感性的影响用克隆集落实验来证实。转染了PVT1shRNA干扰载体或对照载体(scramble)的鼻咽癌细胞接种于6孔板，分别给予0，2，4，6，8个Gy的放射线照射，随后将细胞置于培养箱中继续培养12天，倒去培养基，活细胞用0.5％的结晶紫染色，在显微镜下拍照，观察并计数克隆形成情况。

[0225] 1.4放疗敏感性实验2——检测细胞凋亡

[0226] 放射线照射诱导肿瘤细胞凋亡是放疗发挥杀伤肿瘤细胞的主要原因。转染了 PVT1shRNA干扰载体或对照载体(scramble)的鼻咽癌细胞接种于6孔板，待细胞贴壁后，分别给予0(相当于空白对照)或者6Gy放射线照射，48小时后消化细胞，用细胞凋亡检测试剂盒(购自BD公司)中的荧光染料与细胞共孵育，随后用流式细胞仪检测，并分析各组细胞凋亡情况。

[0227] 2.结果

[0228] 2.1在鼻咽癌细胞中导入PVT1的干扰载体抑制PVT1后，细胞对放射线照射更加敏感

[0229] 克隆形成实验证实，在鼻咽癌细胞系CNE2和5-8F中转入靶向PVT1的干扰载体，抑制PVT1的表达后，在经相同剂量的放射线照射后，能存活并长成细胞克隆的数目明显减少，表明细胞对放射线更加敏感(图6)。

[0230] 2.2在鼻咽癌细胞中导入PVT1的干扰载体抑制PVT1表达后，细胞凋亡比例增加[0231] 在鼻咽癌细胞系CNE2和5-8F中转入靶向PVT1的干扰载体，抑制PVT1 的表达后，凋亡细胞比例明显增加(图7)。