一种光敏剂复合纳米多功能材料的制备及其应用

摘要

本发明公开了一种光敏剂复合纳米多功能材料的制备及其应用，属于光动力治疗技术领域及生物医学领域。本发明提供的光敏剂复合纳米多功能材料是由尾孢菌素和具有肝肿瘤细胞靶向性、示踪性的酸敏感共聚物多功能材料自组装制备的，其中酸敏感共聚物多功能材料可以为半乳糖修饰的罗丹明B共价键连的聚甲基丙烯酸N,N‑二甲基氨基乙酯与聚3‑叠氮基‑2‑羟丙基甲基丙烯酸酯共聚物。本发明的光敏剂复合纳米多功能材能够特异性识别肝肿瘤细胞并通过半乳糖‑去唾液酸糖蛋白受体相互作用内吞经细胞内，能够在酸性pH条件下触发释放光敏剂尾孢菌素发挥光动力治疗效率。本发明在对肿瘤细胞进行靶向光动力治疗方面具有良好的应用前景。

权利要求

1.一种光敏剂复合纳米多功能材料，其特征在于，光敏剂尾孢菌素与具有肝肿瘤细胞靶向性、示踪性的酸敏感共聚物多功能材料自组装制备而成，其中，所述具有肝肿瘤细胞靶向性、示踪性的酸敏感共聚物多功能材料具有式1所示的结构式，A为选自如下的一个或多个相同或不同的具有荧光示踪功能的荧光分子，包括罗丹明B、异硫氰酸荧光素、氟硼二吡咯；

B为选自如下的一个或多个相同或不同的具有半乳糖或半乳糖胺残基的单糖或寡糖类分子，其能够特异性识别肝癌细胞表面过度表达的去唾液酸糖蛋白受体；

式1中包含DMAEMA的单体结构，m表示其聚合度，m＝42；

式1中包含GMA-N3的单体结构，n表示其聚合度，n＝62。

2.根据权利要求1所述的一种光敏剂复合纳米多功能材料，其特征在于，按照质量分数计，尾孢菌素的的载入量为9％；所述光敏剂复合纳米多功能材料的粒径为103nm。

3.根据权利要求1所述的一种光敏剂复合纳米多功能材料，其特征在于，式1中A为荧光分子罗丹明B，B为半乳糖残基，荧光分子罗丹明B、DMAEMA、GMA-N3的摩尔比例为1:42:62，所述靶向糖分子与GMA-N3的摩尔比例为1:1。

4.制备权利要求1～3任一所述的光敏剂复合纳米多功能材料的方法，其特征在于，如下步骤：

1)将具有肝肿瘤细胞靶向性、示踪性的酸敏感共聚物多功能材料和尾孢菌素分别用DMSO溶解，将两种溶液混合搅拌；

2)将步骤1)所得混合溶液在双蒸水中透析，间歇换水，制得光敏剂复合纳米多功能材料溶液；

3)将光敏剂复合纳米多功能材料溶液经过滤除去未负载的尾孢菌素，经冷冻干燥，制得光敏剂复合纳米多功能材料Cer@Gal-polymer。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：

所述步骤1)中具有肝肿瘤细胞靶向性、示踪性的酸敏感共聚物多功能材料的浓度为

10-50mg mL-1；

所述步骤1)中尾孢菌素的浓度为10-50mg mL-1；

所述步骤1)中DMSO用量为0.5-1mL。

6.权利要求1～3任一所述的光敏剂复合纳米多功能材料在制备用于治疗肝癌的药物中的应用。

7.一种治疗肝癌的药物，其特征在于，含有权利要求1～3任一所述的光敏剂复合纳米多功能材料。

8.权利要求1～3任一所述的光敏剂复合纳米多功能材料在开发用于治疗肝癌的药物中的应用。

说明书

一种光敏剂复合纳米多功能材料的制备及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种新型光敏剂复合纳米多功能材料的制备及其应用，具体涉及一种尾孢菌素，并进一步将其包覆进具有肝肿瘤细胞靶向性、示踪性的酸敏感共聚物中制备新型光敏剂复合纳米多功能材料，及其制备方法和用途，属于光动力治疗技术领域及生物医学领域。

背景技术

[0002] 光动力治疗是治疗肿瘤疾病的一种非侵入性新技术，通过孵育光敏剂并配合特定的光照射时，可以产生氧化性很强的单线态氧，从而达到杀伤肿瘤组织和细胞的目的。光动力治疗经过多年的发展，在应用上愈发广泛，其作用机制也日益明了。用于治疗恶性肿瘤的光动力治疗法需要三个要素：光敏剂、特定波长的光照射及氧气。这种治疗策略具体如下：一种低毒性的光敏剂进入人体；之后向肿瘤区域给予光照，进而激发该种光敏剂；光活化后处于激发三重态的光敏剂将激发态能量传递给周围肿瘤组织和细胞中的氧气，产生氧化性很强的单线态氧，从而氧化性损伤脂质体、蛋白质以及其它的亚细胞器，进而肿瘤细胞凋亡、坏死。所以光敏剂产单线态氧的性能，对光动力疗法的效果至关重要。但是，通常所用光敏剂水溶性较差而且不具有肿瘤靶向性，这严重制约了其在临床上的应用。因此，许多科学研究借助化学修饰或纳米输送系统增强各类光敏剂的水溶性和靶向性，以满足光动力治疗技术在生物医学领域的应用。

[0003] 经过几十年的发展，光敏剂的种类和性能都得到充分的开发，光敏剂已经发展到第三代：第一代与第二代光敏剂主要分为卟啉衍生物、中介取代芳基卟吩类、酞菁类、叶绿素a降解产物衍生物以及血卟啉单甲醚等；第三代光敏剂则主要指第二代光敏剂的功能化衍生物，包括氨基酸偶联光敏剂、聚合物偶联光敏剂、蛋白质或糖偶联光敏剂等具有分子识别功能的光敏剂。每一代光敏剂的开发，都伴随着对其光疗性能的改善，特别在亲水性和靶向性方面。目前，在光动力疗法的医疗应用上，比较成熟的光敏剂包括卟啉、卟吩、酞菁等。此外，一种新型光敏材料尾孢菌素(Cercosporin)是从尾孢菌属分离出来的苝醌类光敏化合物，具有高单线态氧量子产率(0.81)。但与其他光敏剂相似，尾孢菌素水溶性较差且缺乏靶向性，其光动力治疗功能尚未被开发，目前没有关于用其作为光敏剂作为光动力治疗的报道。

[0004] 聚合物胶束是一类纳米输送系统，具有良好生物相容性的两亲性大分子能在水中自组装形成胶束。对疏水性的光敏剂以药物包载的形式，或对其进行亲水性修饰，即可构建成负载光敏剂胶束，可以满足光动力治疗的要求。另外，由于肿瘤组织或细胞的特殊生长性质，其会在细胞膜表面过度表达多种靶向受体；而一些功能性靶向分子，例如抗体、多肽、糖类物质等，能够特异性识别这些受体，因而可以用这些靶向分子修饰在聚合物胶束表面，使其能够被肿瘤细胞通过受体介导识别方式大量摄取，从而达到靶向输送光敏剂进行光动力治疗的目的，降低光动力治疗对正常细胞的毒性。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于解决光敏剂在光动力治疗的中存在的低水溶性和缺乏靶向性的缺点，开发尾孢菌素光动力治疗潜力，首次将尾孢菌素应用于复合纳米多功能材料，从而降低其毒副作用，开发其光动力治疗的潜力。

[0006] 本发明所述的新型光敏剂复合纳米多功能材料是由尾孢菌素和具有肝肿瘤细胞靶向性、示踪性的酸敏感共聚物多功能输送系统自组装制备的，能够形成稳定的纳米结构，在酸性条件下可以触发尾孢菌素的爆发式释放。实现了靶向输送尾孢菌素进行光动力治
疗，提高其对肝癌细胞的毒性，降低其对正常细胞的毒性。该酸敏感共聚物多功能输送系统可以为半乳糖修饰的罗丹明B共价键连的聚甲基丙烯酸N,N-二甲基氨基乙酯与聚3- 叠氮
基-2-羟丙基甲基丙烯酸酯共聚物。

[0007] 本发明的一个方面涉及具有肝肿瘤细胞靶向性、示踪性的酸敏感共聚物多功能输送系统，为下面1式所示的化合物。

[0008]

[0009] 上面的式1中，

[0010] A为选自如下的一个或多个相同或不同的具有荧光示踪功能的荧光分子，例如罗丹明B、异硫氰酸荧光素、氟硼二吡咯等。

[0011] B为选自如下的一个或多个相同或不同的具有半乳糖或半乳糖胺残基的单糖或寡糖类分子，其可以特异性识别肝癌细胞表面过度表达的去唾液酸糖蛋白受体；

[0012] 式1中包含甲基丙烯酸N,N-二甲基氨基乙酯(DMAEMA)的单体结构，m表示其聚合度，m＝42；

[0013] 式1中包含3-叠氮基-2-羟丙基甲基丙烯酸酯(GMA-N3)的单体结构，n表示其聚合度，n＝62；

[0014] 在本发明的一种实施方式中，所述具有肝肿瘤细胞靶向性、示踪性的酸敏感共聚物多功能输送系统，如式1所示，其中荧光分子罗丹明B、DMAEMA与GMA-N3的摩尔比例为1:42:62，所述靶向糖分子与GMA-N3的比例为1:1。

[0015] 一种具有肝肿瘤细胞靶向性、示踪性的酸敏感共聚物多功能输送系统的制备方法，包含以下步骤：将具有荧光成像功能的荧光分子经修饰成大分子引发剂，触发单体3-叠氮基-2-羟丙基甲基丙烯酸酯(GMA-N3)和甲基丙烯酸N,N-二甲基氨基乙酯(DMAEMA) 发生
自由基聚合反应，从而形成与荧光分子的共价相连聚合物，该聚合物中PGMA-N3通过亲疏水相互作用具备装载疏水性药物的功能，PDMAEMA部分因其含有大量的氨基可以包覆核酸类物质，并且在酸性条件下质子化，触发海绵效应引起内含体逃逸；具有肝靶向功能的半乳糖端基位经修饰含有炔基基团可通过与共聚物中PGMA-N3部分的叠氮基进行click反应共价
键连在共聚物上，为载体提供稳定的靶向功能。

[0016] 进一步地，包括以下步骤：

[0017] 溴代罗丹明B引发剂，单体DMAEMA及单体GMA-N3按照摩尔比1:25:50加入到 25mL圆底烧瓶中，用2mL四氢呋喃溶解，通30分钟氩气以除去瓶内氧气。其中单体 DMAEMA需要预先除去其中的稳定剂，即将DMAEMA粗品快速通过碱性氧化铝柱。在氮气保护条件下，先后加入溴化亚铜和五甲基二亚乙基三胺，密封烧瓶，在氮气保护条件下室温反应8小时。反应结束后，向反应液中加入四氢呋喃(10mL)，充分搅拌溶解瓶内反应液，通过中性氧化铝柱以除去混合溶液中的铜配体，收集所得液体旋转蒸发除去溶剂后，将瓶内粘稠液体逐滴缓慢滴加于石油醚(500mL)中，进行沉淀，反复沉淀三次，真空干燥所得沉淀物可得到罗丹明B修饰的共聚物。

[0018] 将炔丙基修饰的脱乙酰半乳糖与罗丹明B修饰的共聚物溶于5mL DMF中，然后再将硫酸铜与抗坏血酸钠溶于5mL水中，再滴加入上面的反应液中，反应液在室温下搅拌 48小时。将反应液过滤，水溶液中透析(透析袋截留分子量：8-10kDa)，即可得到目标共聚物Gal-polymer。

[0019] 一种制备包覆尾孢菌素复合纳米多功能材料的方法，包括以下步骤：

[0020] 1)将目标共聚物Gal-polymer和尾孢菌素分别用DMSO溶解，将两种溶液混合搅拌 6小时；

[0021] 2)混合溶液在双蒸水中透析48小时，每隔12小时换水一次，制得光敏剂复合纳米多功能材料溶液；

[0022] 3)将光敏剂复合纳米多功能材料溶液经过0.45μm的微膜过滤除去未负载的尾孢菌素，经冷冻干燥机冻干，制得光敏剂复合纳米多功能材料Cer@Gal-polymer。

[0023] 本发明涉及的具有肝肿瘤细胞靶向性、示踪性的酸敏感纳米聚合物多功能输送系统中GMA单体是为了提供疏水部分，一方面与疏水性的尾孢菌素相互所用将其包裹在其输水内核，另一方面其-N3基团可以与含有炔丙基的半乳糖进行化学反应，将具有靶向性的半乳糖分子共价键连引入到聚合物上；DMAEMA单体一方面是为了提供亲水部分，另一方面由于其含有大量氨基，可以在酸性条件质子化引起胶束解离释放包覆的光敏剂，并且其可以触发海绵效应使其可以从细胞内质网逃逸，从而将包覆的光敏剂释放到细胞质中甚至是细胞核内。

[0024] 本发明涉及的新型光敏剂复合纳米多功能材料具有以下有益效果：

[0025] (1)本发明的光敏剂复合纳米多功能材料Cer@Gal-polymer在输送过程中(pH 7.4) 可稳定存在，能够有效降低光敏剂泄露，并且在光照条件下产生单线态氧的效率明显降低；而在酸性pH环境下，可加速光敏剂释放、提高光敏剂释放量，并且产生大量单线态氧从而产生细胞毒性。

[0026] (2)本发明的光敏剂复合纳米多功能材料Cer@Gal-polymer因其含有共价键连的罗丹明B分子，从而可以促进体内体外的实时成像。

[0027] (3)本发明的光敏剂复合纳米多功能材料Cer@Gal-polymer因其含有共价键连的半乳糖分子，从而可以靶向肝癌细胞表面过度表达的去唾液酸糖蛋白受体，实现靶向输送的目的。

[0028] (4)本发明的光敏剂复合纳米多功能材料Cer@Gal-polymer经半乳糖-去唾液酸糖蛋白受体特异性识别吞噬进细胞后，可以成功从酸性细胞器内逃逸到细胞质中甚至是细胞核中，发挥光敏剂功能。

附图说明

[0029] 图1：光敏剂复合纳米多功能材料Cer@Gal-polymer的动态光散射粒径分布图。

[0030] 图2：光敏剂复合纳米多功能材料Cer@Gal-polymer的透射电镜图。

[0031] 图3：光敏剂复合纳米多功能材料Cer@Gal-polymer在含有10％胎牛血清的高糖培养基中孵育5天的粒径变化图。

[0032] 图4：光敏剂复合纳米多功能材料Cer@Gal-polymer在pH 7.4和5.0的PBS中尾孢菌素释放率。

[0033] 图5：不同处理下1,3-二苯基异苯并呋喃(DPBF)的吸收光光谱图(350-550nm)。 a)尾孢菌素溶于DMSO中；b)锌酞菁溶于DMSO中；c)光敏剂复合纳米多功能材料 Cer@Gal-polymer溶于DMSO中；d)上述三种溶液在418nm处的吸收光强度变化。

[0034] 图6：不同处理下9,10-蒽基-双(亚甲基)二丙二酸(ABDA)的荧光光谱图(400-550 nm)。a)光敏剂复合纳米多功能材料Cer@Gal-polymer溶于PBS pH 5.0；b)光敏剂复合纳米多功能材料Cer@Gal-polymer溶于PBS pH 7.4。

[0035] 图7：人肝癌细胞HepG2和正常HEK293细胞的流式结果。a)HepG2细胞与光敏剂复合纳米多功能材料Cer@Gal-polymer孵育8小时；b)HEK293细胞与光敏剂复合纳米多功能材料Cer@Gal-polymer孵育8小时；c)在含有半乳糖竞争条件下HepG2细胞与光敏剂复合纳米多功能材料Cer@Gal-polymer孵育8小时的实验结果。

[0036] 图8：人肝癌细胞HepG2和正常HEK293细胞的激光共聚焦实验结果。a)HepG2 细胞与光敏剂复合纳米多功能材料Cer@Gal-polymer孵育8小时；b)HEK293细胞与光敏剂复合纳米多功能材料Cer@Gal-polymer孵育8小时；c)在含有半乳糖竞争条件下 HepG2细胞与光敏剂复合纳米多功能材料Cer@Gal-polymer孵育8小时的实验结果。

[0037] 图9：a)人肝癌细胞HepG2和b)正常HEK293细胞分别与光敏剂复合纳米多功能材料Cer@Gal-polymer共培养3，6，12和24小时后463nm灯光照射15min后的细胞存活率。

具体实施方式

[0038] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

[0039] 实施例1：溴代罗丹明B引发剂的制备

[0040] 称取15.52g(25.00mmol)乙二醇和1.01g(10.00mmol)三乙胺盛于100mL锥形瓶中搅拌，冰水浴至0℃，氮气氛围下逐滴加入溶有1.20mL(10.00mmol)2-溴异丁酰溴，然后缓慢升温至室温，磁力搅拌3小时。反应后的溶液加入100mL去离子水淬灭，再用二氯甲烷(100mL×3)萃取。收集的有机相用去离子水(100mL×3)萃取。在萃取所得的有机相中加入适量无
水硫酸镁，干燥12小时。过滤后旋蒸得到油状粗产物，减压蒸馏(85℃，30mTorr)得到无色粘稠产物异溴丁酸羟乙酯。

[0041] 取4.81g(10.00mmol)罗丹明B，2.90g(15.00mmol)1-乙基-(3-二甲基氨基丙基) 碳酰二亚胺盐酸盐及3.22g(15.00mmol)化合物异溴丁酸羟乙酯溶于40mL无水二氯甲烷中
搅拌，冰水浴至0℃后加入1.82g 4-二甲氨基吡啶(15μmol)，然后缓慢升温至室温反应12小时。用0.1M HCl(50mL×3)萃取反应液，再分别用饱和碳酸氢钠溶液和饱和食盐水洗涤三
次，有机相用无水硫酸镁干燥过滤，旋蒸除去溶剂，经硅胶柱(二氯甲烷/甲醇＝10:1)分离得到溴代罗丹明B引发剂。具体方法可参考文献 (Marcromolecules，2011,44,2050-2057)。

[0042] 实施例2：3-叠氮-2-羟基甲基丙烯酸丙酯GMA-N3的制备

[0043] 将3.71g(57.00mmol)叠氮化钠，3.81g(45.20mmol)碳酸氢钠溶于60mL四氢呋喃/水(5:1v v-1)中搅拌，缓慢加入5.42g(37.80mmol)甲基丙烯酸缩水甘油酯，常温反应48小时。过滤除去不溶盐物质后旋蒸除去溶剂，将得到的浓缩物用二氯甲烷萃取两次，再将得到的有机相用无水硫酸镁干燥过滤，旋蒸除去溶剂，经硅胶柱(正己烷/乙酸乙酯＝9:1)分离得到3-叠氮-2-羟基甲基丙烯酸丙酯。具体方法可参考文献(Polymer Chemistry，2015,6,
3875-3884；Soft Matter,2009,5,4788-4796)。

[0044] 实施例3：罗丹明B共价键连的聚甲基丙烯酸N,N-二甲基氨基乙酯与聚3-叠氮基-2-羟丙基甲基丙烯酸酯共聚物(RhB-PDMAEMA42-c-PGMA62-N3)的制备

[0045] 准确称取70.0mg(0.10mmol)溴代罗丹明B引发剂，484.0mg(2.75mmol)单体 DMAEMA及1.01g(5.50mmol)化合物3-叠氮-2-羟基甲基丙烯酸丙酯加入到25mL圆底烧瓶中，用2mL四氢呋喃溶解，通30分钟氩气以除去瓶内氧气。其中单体DMAEMA 需要预先除去其中的稳定剂，即将DMAEMA粗品快速通过碱性氧化铝柱。在氮气保护条件下，先后加入18.9mg(0.10mmol)CuBr和PMDETA(28μL，0.10mmol)，密封烧瓶，在氮气保护条件下室温反应8小时。
反应结束后，向反应液中加入四氢呋喃(10 mL)，充分搅拌溶解瓶内反应液，通过中性氧化铝柱以除去混合溶液中的铜配体，收集所得液体旋转蒸发除去溶剂后，将瓶内粘稠液体逐滴缓慢滴加于石油醚(500mL)中，进行沉淀，反复沉淀三次，真空干燥所得沉淀物可得到罗丹明B修饰的共聚物 RhB-PDMAEMA42-c-PGMA62-N3。

[0046] 实施例4：炔丙基修饰的脱乙酰半乳糖的制备

[0047] 将6.21g(15.90mmol)全乙酰半乳糖溶解于75mL无水二氯甲烷中，加入1.0mL (18.00mmol)炔丙醇，冷却到0℃搅拌5分钟，在15分钟内逐滴加入3.0mL(24.30mmol) 三氟化硼乙醚。继续在0℃搅拌10分钟后，室温反应10小时。用饱和碳酸钾溶液终止反应，用二氯甲烷萃取有机相，用饱和食盐水洗涤三次，有机相用无水硫酸镁干燥过滤，旋蒸除去溶剂，炔丙基修饰的全乙酰半乳糖。

[0048] 取2.01g(5.20mmol)炔丙基修饰的全乙酰半乳糖溶解于50mL 0.30mol L-1的甲醇+
钠甲醇溶液中，常温反应。点板检测直至原料消失，加入H交换树脂将反应液调至中性，过滤，旋蒸除去溶剂，经硅胶柱(二氯甲烷/甲醇＝10:1)分离得到炔丙基修饰的脱乙酰半乳糖。具体方法可参考文献(Bioconjugate Chemistry,2012,23,1166-1173)。

[0049] 实施例5：半乳糖修饰的罗丹明B共价键连的聚甲基丙烯酸N,N-二甲基氨基乙酯与聚3- 叠氮基-2-羟丙基甲基丙烯酸酯共聚物(Gal-polymer)的制备

[0050] 将350.0mg实施例4中的炔丙基修饰的脱乙酰半乳糖与200.1mg实施例3中的罗丹明B修饰的共聚物RhB-PDMAEMA25-c-PGMA50-N3溶于5mL DMF中，然后再将98.0 mg
(0.61mmol)硫酸铜与242.0mg(1.2mmol)抗坏血酸钠溶于5mL水中，再滴加入上面的反应液中，反应液在室温下搅拌48小时。将反应液过滤，水溶液中透析(透析袋截留分子量：8-
10kDa)，即可得到目标共聚物Gal-polymer。

[0051] 实施例6：新型光敏剂复合纳米多功能材料(Cer@Gal-polymer)的制备

[0052] 将实施例5中的共聚物Gal-polymer和尾孢菌素分别用DMSO溶解，将两种溶液混合搅拌6小时。混合溶液在双蒸水中透析48小时，每隔12小时换水一次，制得负载尾孢菌素的光敏剂复合纳米多功能材料溶液。之后将光敏剂复合纳米多功能材料溶液经过 0.45μm的微膜过滤除去未负载的尾孢菌素，经冷冻干燥机冻干，制得包覆尾孢菌素的光敏剂复合纳米多功能材料Cer@Gal-polymer。

[0053] 将制得的光敏剂复合纳米多功能材料充分溶解在DMSO里，用酶标仪测定463nm 下溶液的吸光度，根据尾孢菌素DMSO溶液制得的标曲即可得到相应的复合纳米材料中尾孢菌素的浓度。得到的光敏剂复合纳米多功能材料中尾孢菌素的负载量＝复合材料中尾孢菌素的质量/共聚物的质量，为9.0％；包封率＝复合材料中尾孢菌素的质量/起始尾孢菌素质量，为35.6％。

[0054] 实施例7：新型光敏剂复合纳米多功能材料(Cer@Gal-polymer)的表征

[0055] 将实施例6中制得的Cer@Gal-polymer通过动态光散射技术测得其粒径分布，经过透射电镜观察其形貌特征。如图1所示，通过动态光散射粒径检测，Cer@Gal-polymer 能形成粒径约为103±9.9nm的胶束。如图2所示，经过透射电镜观察其呈现圆形结构，并且粒径分布均匀。

[0056] 稳定性是光敏剂复合纳米多功能材料最重要的性质之一，应用于生物医药领域的纳米粒子必须能够稳定分散在培养基中。将本实验中制备的光敏剂复合纳米多功能材料 Cer@Gal-polymer分散在含有10％胎牛血清的培养基中测定其粒径变化，如图3所示，5 天之内没有明显粒径变化，表明该光敏剂复合纳米多功能材料具有很好的稳定性。

[0057] 实施例8：新型光敏剂复合纳米多功能材料(Cer@Gal-polymer)的酸敏感释放特性[0058] 分别取12mg实施例6中制得的Cer@Gal-polymer溶于1mL PBS pH 5.0或pH 7.4 中，装于透析袋(MWCO 2000 Da)中，将密闭好的透析袋分别置于含有35mL的PBS pH 5.0或pH 7.4中缓冲液(各含有1％吐温20)烧杯中。将烧杯置于恒温(37℃)磁力搅拌器上，设定取样时间，用移液器从烧杯中取出200μL的释放液，并补加200μL相应 pH值的新鲜缓冲液。用酶标仪检测所取出的释放液中尾孢菌素的吸收强度，计算累积释放量。

[0059] 结果如图4所示，可以发现在中性介质中，尾孢菌素释放缓慢，在48小时后释放率只有15％；而在酸性介质中，尾孢菌素呈现出“暴释”现象，在24小时内的累积释放量达到78％，48小时后累积释放量达到93％。这样的释放结果可以说明新型光敏剂复合纳米多功能材料(Cer@Gal-polymer)在中性生理条件下能稳定存在，降低对正常组织的毒副作用；在肿瘤细胞组织偏酸性的环境下，则能快速释放出尾孢菌素进行后续光动力治疗。

[0060] 实施例9：光敏剂尾孢菌素产单线态氧性能力的测定

[0061] 光敏剂产单线态氧的能力是衡量其应用于光动力治疗的重要指标，为了评价光敏剂尾孢菌素的产单线态氧能力，应用单线态氧捕获剂1,3-二苯基异苯并呋喃(DPBF)特征吸收峰的强度变化表征单线态氧的产生。

[0062] 如图5所示，酞菁锌ZnPc在DMSO中的单线态氧产率为0.67，用其作为对照。将尾孢菌素，Cer@Gal-polymer或者ZnPc的DMSO溶液(1.5μL,0.1mM)加入到3mL DPBF 溶液中，测量在463nm光照0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，及3.0分钟后的吸收光光谱(350-550 nm)。根据公式ΦΔ(cercosporin)＝ΦΔ(ZnPc)×[S(cercosporin)/S(ZnPc)]×[1-10-OD(ZnPc)]/[1-10-OD(cercosporin)] 计算尾孢菌素的单线态氧量子产率为0.83。其中ΦΔ代表单线态氧量子产率，S(cercosporin)代表尾孢菌素的DPBF的消耗速率，S(ZnPc)代表参比溶液中DPBF的消耗速率，OD(ZnPc)代表ZnPc在463nm处吸光度，OD(cercosporin)代表尾孢菌素在463nm处吸光度。测得的 Cer@Gal-polymer中尾孢菌素的单线态氧量子产率为0.87，比单独的尾孢菌素稍高，原因是聚合物材料中的罗丹明B同样吸收了光强度后又将发射波长的能量转移到尾孢菌素上再次激发了单线态氧的产生。

[0063] 实施例10：新型光敏剂复合纳米多功能材料(Cer@Gal-polymer)在不同pH条件下产单线态氧性能力的测定

[0064] 9,10-蒽基-双(亚甲基)二丙二酸(ABDA)可作为水溶液中衡量单线态氧产生的试剂，新型光敏剂复合纳米多功能材料(Cer@Gal-polymer)在特定波长光的照射下，ABDA 能够被生成的单线态氧氧化，从而使其荧光强度降低，进一步间接表征Cer@Gal-polymer 单线态氧的生成。将150μL Cer@Gal-polymer(1mg mL-1在PBS pH 5.0中)和150μL Cer@Gal--1
polymer(1mg mL 在PBS pH 7.4中)分别加入到2mL ABDA(13mM在 PBS pH 5.0或PBS pH 
7.4中)，测量其在463nm光照10，20，30，40以及50秒后的荧光光谱(400-550nm)。

[0065] 结果如图6所示，体系pH为7.4时，ABDA的荧光光强度变化不大，即基本检测不到单线态氧产生；而当体系pH为5.0时，ABDA的荧光强度明显随着光照时间增加而减弱，表明有大量单线态氧产生。这一结果表明在酸性条件下，尾孢菌素可从纳米复合物中释放出来发挥光动力治疗效率，而在正常体液环境下，被包覆在纳米复合物中不表现其光动力性能。

[0066] 实施例11：流式细胞仪检测证明光敏剂复合纳米多功能材料Cer@Gal-polymer能够特异性靶向识别肝癌细胞HepG2细胞表面的去唾液酸糖蛋白受体

[0067] 在流式细胞仪的检测实验中，将HepG2和HEK293细胞培养在含10％新生牛血清的 DMEM培养基(含100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)中，并放置37℃，5％CO2的培养箱中生长。取对数生长期的细胞，用含0.02％EDTA和0.25％胰蛋白酶消化液消化以后以每孔5×104个细胞接种于6孔板，每孔加2mL完全培养液，将培养板置于培养箱，培养24小时。其中一组HepG2细胞添加终浓度为10mmol L-1的半乳糖，继续培养 24小时后，当各组细胞密度达到
70％时，加入Cer@Gal-polymer继续培养8小时。用胰酶将细胞消化下来，以1000rpm的转速离心3分钟，倒掉上清液，将聚集的细胞用PBS 重悬，吹散。这一离心过程重复三遍，以除去残留的培养基和胶束溶液，减少对荧光检测的干扰。最后，将细胞用PBS分散，置于流式管中，用流式细胞仪检测各组细胞的荧光强度。

[0068] 实验中，我们用了两种方式培养HepG2细胞，分别是含有半乳糖的培养基培养(表面受体提前被半乳糖饱和)和用不含半乳糖的培养基培养(表面去唾液酸糖蛋白受体不受影响)。

[0069] 如图7所示，结果显示HEK293细胞中，Cer@Gal-polymer进入细胞的量明显低于 HepG2细胞。这是由于HEK293细胞表面只有低表达的去唾液酸蛋白受体，因此 Cer@Gal-
polymer无法通过表面半乳糖-去唾液酸糖蛋白受体靶向介导的内吞作用快速进入细胞内。
对于表面去唾液酸糖蛋白受体被提前饱和的情况下，Cer@Gal-polymer无法通过表面键连的半乳糖识别HepG2细胞，只能通过非靶向的内吞作用进入到肿瘤细胞中，因此罗丹明B和尾孢菌素的荧光强度与HEK293细胞中相当。而对于表面受体过度表达的HepG2细胞，Cer@Gal-polymer能够通过表面键连的半乳糖快速的与肿瘤细胞表面去唾液酸糖蛋白受体结
合，然后通过受体介导的内吞作用进入到肿瘤细胞中，因此HepG 细胞中罗丹明B和尾孢菌素的荧光强度均为最强。

[0070] 该实验证明了Cer@Gal-polymer能够特异性靶向识别HepG2细胞表面的受体，并成功被内吞进入细胞。

[0071] 实施例12：激光共聚焦实验证明光敏剂复合纳米多功能材料Cer@Gal-polymer能够特异性靶向识别肝癌细胞HepG2表面的去唾液酸糖蛋白受体

[0072] 将实施例6中所得的光敏剂复合纳米多功能材料Cer@Gal-polymer加入到培养液中与HepG2和HEK293细胞进行细胞培养实验，然后用4',6-二脒基-2-苯基吲哚染细胞核。激光共聚焦显微镜实验结果如图8所示，在HepG2细胞中可以看到明显的来自复合材料中的罗丹明B的荧光以及来自尾孢菌素的荧光，而HEK293细胞中几乎观察不到该荧光；并且当在有半乳糖竞争的环境下，HepG2细胞内也观测不到罗丹明B和尾孢菌素的荧光。该实验证明光敏剂复合纳米多功能材料Cer@Gal-polymer能够通过半乳糖-去唾液酸糖蛋白受体识别并
进入HepG2细胞中，并且尾孢菌素释放并进入细胞核内。

[0073] 实施例13：新型光敏剂复合纳米多功能材料(Cer@Gal-polymer)在细胞层面光动力治疗效率

[0074] 将人肝癌细胞HepG2细胞和正常细胞HEK293细胞接种于96孔板内，置于37℃， 5％CO2的孵育箱中培养24小时。待细胞贴壁生长后，加入含有不同浓度Cer@Gal-polymer 的新鲜培养液继续培养3，6，12或24小时。弃去培养液，用pH 7.4的PBS清洗3次，加入新鲜培养基。并对培养皿进行光照(463nm，20mW/cm2)光照15min后继续培养 12小时。再移除培养液，用PBS缓冲溶液清洗2次，并于每孔中加入100μL CCK-8试剂并于孵育箱中继续培养2小时。用多功能酶标仪测量450nm处各孔的吸光值(OD)，计算细胞存活率。结果如图9所示，随着孵育时间增加，Cer@Gal-polymer对细胞的毒性呈增长趋势，并且Cer@Gal-polymer对HepG2的毒性远远高于对HEK293细胞的毒性。通过Cer@Gal-polymer对人肝癌细胞HepG2细胞和正常细胞HEK293细胞的光动力治疗毒性实验，证明Cer@Gal-polymer能通过半乳糖-去唾液酸糖蛋白受体介导的内吞作用将光敏剂尾孢菌素靶向输送进入HepG2癌细胞内，在特定波长
463nm光照下，对癌细胞具有强烈的光疗作用，Cer@Gal-polymer表现出优良的光动力治疗性能。