一种生物炭基菌群复合土壤调理剂及其制备与应用

摘要

本发明公开了一种生物炭基菌群复合土壤调理剂及其制备和应用。包括以下步骤：(1)菌种驯化：将蜡状芽孢杆菌、苍白杆菌、节杆菌分别依次接种到梯度浓度的含Cd的无机盐培养液中驯化培养；驯化培养之后的各种菌液混合，制备成菌悬液，备用；(2)制备生物炭基菌群复合土壤调理剂：取生物炭与菌悬液混合，加入土壤中重金属的拮抗元素，然后振荡培养，过滤，清洗。该制剂制备方法简单、成本低廉、该制剂中微生物对重金属Cd具有高耐受性，对土壤中的重金属修复效果好，稳定，长效，受环境影响小。本发明是一种有效的应用于农田重金属污染土壤的原位化学联合微生物钝化修复技术。

权利要求

1.一种生物炭基菌群复合土壤调理剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)菌种驯化：将蜡状芽孢杆菌、苍白杆菌、节杆菌分别依次接种到梯度浓度的含Cd的无机盐培养液中驯化培养；驯化培养之后的各种菌液混合，制备成菌悬液，备用；

(2)制备生物炭基菌群复合土壤调理剂：取生物炭与菌悬液混合，加入土壤中重金属的拮抗元素，然后振荡培养，过滤，清洗。

2.根据权利要求1所述的生物炭基菌群复合土壤调理剂的制备方法，其特征在于，所述的生物炭基菌群复合土壤调理剂各组分按照以下质量份数计：8～9份生物炭，0.8～1.2份菌悬液，0.5～1.0份拮抗元素。

3.根据权利要求1所述的生物炭基菌群复合土壤调理剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)在含有Cd的无机盐培养液中驯化培养的过程如下：将蜡状芽孢杆菌、苍白杆菌、节杆菌分别在Cd浓度为1、5、10、20mg L-1的无机盐培养液中驯化培养；驯化培养之后的各种菌液以1:1:1体积比例混合，制备成OD600＝1.0的菌悬液，备用。

4.根据权利要求3所述的生物炭基菌群复合土壤调理剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)将蜡状芽孢杆菌、苍白杆菌、节杆菌分别接种到含Cd 1mg L-1的无机盐培养液中，转速150rpm，28℃恒温振荡培养72h；然后分别以10％的接种量依次转入Cd浓度为1、5、

10、20mg L-1的无机盐培养液中28℃恒温振荡驯化培养72h；驯化培养之后的各种菌液以1:

1:1的体积比例混合，制备成OD600＝1.0的菌悬液，备用；所述的无机盐培养液为牛肉膏蛋白胨液体培养基：牛肉膏2.5g/L、蛋白胨5.0g/L、NaCl 2.5g/L、pH 7.0-7.2。

5.根据权利要求1所述的生物炭基菌群复合土壤调理剂的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述的生物炭是将玉米秸秆、稻壳2种粉碎过80目筛，按玉米秸秆：稻壳＝3：7～6：4质量比混合后烧制得到的复合生物炭。

6.根据权利要求1所述的生物炭基菌群复合土壤调理剂的制备方法，其特征在于，所述的拮抗元素来源于硝酸钙、碳酸锌混合物，Ca：Zn质量比例＝4：1～6:1。

7.根据权利要求1所述的生物炭基菌群复合土壤调理剂的制备方法，其特征在于，步骤(2)100rpm～150rpm振荡培养20h～24h，过滤并用无菌水清洗至中性，得到生物炭基菌群复合土壤调理剂。

8.根据权利要求1所述的生物炭基菌群复合土壤调理剂的制备方法，其特征在于，所述的土壤为Pb、Cd单一污染或者复合污染农田土壤。

9.一种生物炭基菌群复合土壤调理剂，其特征在于，是由权利要求1-8任一项所述的方法制备得到。

10.权利要求9所述的生物炭基菌群复合土壤调理剂添加到土壤中，用于降低重金属的生物有效性。

说明书

一种生物炭基菌群复合土壤调理剂及其制备与应用

技术领域

[0001] 本发明属于农田重金属污染土壤修复领域，特别涉及一种生物炭基菌群复合土壤调理剂 及其制备与应用。

背景技术

[0002] 随着工农业的发展，多种有害重金属会通过工业“三废”排放、农用化学品的滥用等途 径进入土壤，严重影响土壤环境质量。污染土壤修复的目的在于降低土壤中污染物的含量、 生物有效性，将污染物转化成毒性较低或无毒的物质，或阻断污染物在生态系统中的转移途 径，从而减小土壤污染物对环境、人体或其他生物体的危害。农田重金属污染土壤修复技术 依据其操作原理分为生物修复技术、化学修复技术、物理修复技术、农艺改良措施以及联合 修复技术等。多数研究表明单一修复技术难以达到耕地修复要求，联合修复技术能取得更好 的修复效果。

[0003] 原位化学钝化修复技术是通过改变重金属在土壤中的形态，降低其在土壤中的迁移性和 生物有效性，但总量并没有发生改变，且其形态在某些情况下容易发生转化，固定的重金属 被重新释放，因此钝化剂的长期稳定性是该方法的关键因素。微生物修复，在成本投入及生 态环境影响等方面较其他方法相比有较大的优势，但单一的微生物修复，存在修复周期长， 容易受地理、气候、水分等因素的制约等缺点，原位化学微生物联合钝化修复方法，能够取 长补短。如果选择合适的碳源、氮源、无机盐、生长素等外来营养源对微生物的生长繁殖进 行辅助，将大大提高微生物的修复效率。生物炭可以改变重金属污染物的形态，降低其生物 有效性，在减轻有毒物质对植物的毒害作用的同时，改善土壤肥力，为微生物的生长提供碳 源、氮源、无机盐、生长素等外来营养源，可有效解决微生物修复周期长，容易受地理、气 候、水分等因素的制约等问题。由于微生物的活性在土壤中可长期有效的作用于重金属，弥 补了单一生物炭修复的长期稳定性缺陷。具有广阔的发展前景。

[0004] 然而生物强化修复中常常遇到的一个难题，就是重金属对外加微生物活性的毒害作用。 因此，首先必须挑选对重金属具有高耐受性的活性微生物，才能保证修复过程的正常运行。 如果能将适合于重金属土壤修复的菌株进行驯化，使其能进一步提高对重金属的耐受性，然 后将它们混合制成复合菌剂，发挥它们的协同作用，再与原位化学钝化技术结合，开发出一 种能有效降低农田土壤重金属有效态的原位化学微生物联合钝化修复方法。

发明内容

[0005] 本发明的目的之一是提供一种生物炭基菌群复合土壤调理剂及其制备方法。该制剂制 备方法简单、成本低廉、该制剂中微生物对重金属具有高耐受性，对土壤中的重金属修复效 果好，稳定，长效，受环境影响小。

[0006] 本发明通过以下技术方案实现：

[0007] 一种生物炭基菌群复合土壤调理剂的制备方法，

[0008] 包括以下步骤：

[0009] (1)菌种驯化：将蜡状芽孢杆菌、苍白杆菌、节杆菌分别依次接种到梯度浓度的含Cd 的无机盐培养液中驯化培养；驯化培养之后的各种菌液混合，制备成菌悬液，备用；

[0010] (2)制备生物炭基菌群复合土壤调理剂：取生物炭与菌悬液混合，加入土壤中重金属 的拮抗元素，然后振荡培养，过滤，清洗；

[0011] 所述的生物炭基菌群复合土壤调理剂各组分按照以下质量份数计：8～9份复合生物炭， 0.8～1.2份菌悬液，0.5～1.0份拮抗元素。

[0012] 所述的生物炭基菌群复合土壤调理剂的制备方法，步骤(1)在含有Cd的无机盐培养 液中驯化培养的过程如下：将蜡状芽孢杆菌、苍白杆菌、节杆菌分别在Cd浓度为1、5、 10、20mg L-1的无机盐培养液中驯化培养；驯化培养之后的各种菌液以1:1：1体积比例混 合，制备成OD600＝1.0的菌悬液，备用。

[0013] 所述的生物炭基菌群复合土壤调理剂的制备方法，步骤(1)将蜡状芽孢杆菌、苍白-1杆 菌、节杆菌分别接种到含Cd 1mg L 的无机盐培养液中，转速150rpm，28℃恒温振荡培养 
72h；然后分别以10％的接种量依次转入Cd浓度为1、5、10、20mg L-1的无机盐培养液 中28℃恒温振荡驯化培养72h；驯化培养之后的各种菌液以1:1:1的体积比例混合，制备成 OD600＝1.0的菌悬液，备用；所述的无机盐培养液为牛肉膏蛋白胨液体培养基：牛肉膏 2.5g/L、蛋白胨5.0g/L、NaCl 2.5g/L、pH 7.0-7.2。

[0014] 所述的生物炭基菌群复合土壤调理剂的制备方法，步骤(2)所述的生物炭是将玉米秸 秆、稻壳2种分别粉碎过80目筛，按一定质量比混合后(玉米秸秆：稻壳＝3：7～6：4)烧 制得到的复合生物炭。

[0015] 所述的生物炭基菌群复合土壤调理剂的制备方法，所述的土壤中重金属的拮抗元素为硝 酸钙、碳酸锌混合物，Ca：Zn质量比例＝4：1～6:1。

[0016] 所述的生物炭基菌群复合土壤调理剂的制备方法，步骤(2)100rpm～150rpm振荡培养 20h～24h，过滤并用无菌水清洗至中性，得到生物炭基菌群复合土壤调理剂。

[0017] 本发明所述的土壤为Cd污染农田土壤。

[0018] 一种生物炭基菌群复合土壤调理剂，是由上述的方法制备得到。

[0019] 本发明的目的之二是提供一种生物炭基菌群复合土壤调理剂的应用。具体是将所述的生 物炭基菌群复合土壤调理剂添加到土壤中，用于降低重金属的生物有效性。本发明是一种有 效的应用于农田重金属污染土壤的原位化学联合微生物钝化修复技术。

[0020] 本发明通过一系列的对比试验，筛选出高效、经济的组合方式；通过添加相关拮抗元素， 以提高该复合生物炭微生物菌群的稳定化效果；通过长期稳定性试验，研究了该调理剂的动 态变化情况；最后将该调理剂用于盆栽试验，以验证其对水稻中重金属的降低效果。

[0021] 1本发明菌群是模拟某Cd污染农田土壤中筛选出的优势耐Cd菌群，包括：蜡状芽孢 杆菌、苍白杆菌、节杆菌。

[0022] 本发明调理剂优选制备方法如下：

[0023] (1)驯化菌种：将蜡状芽孢杆菌、苍白杆菌、节杆菌分别加入到含Cd 1mg L-1的无机 盐培养液(50m L)中，28℃恒温振荡培养72h(转速150rpm)后，以10％的接种量依次 转入Cd浓度为1、5、10、20mg L-1的无机盐培养液中驯化培养，条件为28℃恒温振荡培 养72h，转速150rpm；驯化结束后，按1:1:1的体积比例混合，制备成OD600＝1.0的菌悬 液，作为后续生物炭固定的供试菌株。

[0024] (2)制备复合生物炭：将玉米秸秆、稻壳2种粉碎过80目筛，混合放入瓷坩埚中压实 加盖，用锡纸包裹严实后放入马弗炉内，450～600℃下烧制2～3h，即制得复合生物炭；

[0025] (3)制备复合生物炭基菌群土壤调理剂：取复合生物炭8g至三角瓶内，与1m L菌悬 液混合，加入复合拮抗元素1g(Ca：Zn质量比例＝5:1)，100rpm～150rpm振荡培养20h～24h， 过滤并用无菌水清洗至中性。

[0026] 3对比试验

[0027] 通过对比试验筛选出有效主要稳定化成分、拮抗元素，用以制备调理剂；通过调理剂与 其他单一组分的对比试验，以探明该调理剂的优势。详细试验步骤如下：

[0028] 分别称取土样50.0g于125ml塑料杯中，加入调理剂(1％)，充分混合均匀，保持干 土质量40％～80％含水量，以不施入调理剂CK为对照，各处理重复3次。敞开环境下于室 温培养7～30d，土样分析测定土壤Cd的有效态。

[0029] 4小试试验

[0030] 制备出复合生物炭基菌群土壤调理剂后，为验证其有效性，选取了多个矿区污染农田进 行小试试验。详细试验步骤如下：

[0031] 分别称取土样50.0g于125ml塑料杯中，加入调理剂(0.5％～2％)，充分混合均匀，保 持干土质量40％～80％含水量，以不施入调理剂CK为对照，各处理重复3次。敞开环境下 于室温培养7～30d，土样分析测定土壤Cd的有效态。

[0032] 5长期稳定性试验

[0033] 为探明该土壤调理剂对农田中重金属修复治理的长期稳定性，做了一个为期180天的动 态试验。详细试验步骤如下：

[0034] 分别称取土样50.0g于125ml塑料杯中，加入调理剂(0.5％～2％)，充分混合均匀，保 持干土质量40％～80％含水量，各处理重复3次。敞开环境下于室温培养，按0d、3d、5d、 7d、15d、30d、60d、120d、180d进行动态取样分析，土样分析测定土壤Cd的有效态。

[0035] 6盆栽试验

[0036] 针对该土壤调理剂对农田作物重金属吸收影响，做了水稻盆栽试验，研究其对水稻生长 性状、稻米重金属的吸收，并对土壤中重金属有效态进行检测分析。具体试验步骤如下：

[0037] 每桶装土5kg，尿素、过磷酸钙和氯化钾作为水稻生育期肥料，其中，磷钾肥做基肥一 次性施入，尿素分基肥、追肥施入。调理剂占土壤的质量百分比0.1％～1％。水稻每盆2穴， 每穴2株，用去离子水补充水分，收获后，分析测定水稻糙米Cd的含量和土壤有效态Cd 含量。

[0038] 该方法部分试验结果如下：

[0039] 1对比试验

[0040] (1)调理剂主选材料对比试验

[0041] 所选样品采自矿区附近被污染农田土壤。按本发明所述的步骤进行对比试验，以不加土 壤调理剂为对照实验CK，设置单施生物炭C、复合生物炭DC、单一菌种M、复合菌群处 理DM以及复合生物炭+复合菌群土壤调理剂处理MC，各处理重复3次，添加比例均占土 壤质量的1％，室温条件下养护7～30d，检测其有效态重金属含量。

[0042] 表1对比试验各处理土壤Cd有效态含量及pH值

[0043]

[0044] 注:表中a，b，c表示P<0.05下的显著性水平。

[0045] 生物炭A：玉米秸秆炭。生物炭B：稻壳炭。

[0046] 菌种A：蜡状芽孢杆菌。菌种B：苍白杆菌。菌种C：节杆菌。

[0047] 复合生物炭：指玉米秸秆炭A与稻壳炭B以质量比1：1混合。

[0048] 复合生物炭基菌群：指复合生物炭(A+B)与菌群(A+B+C)菌悬液以质量比8：1混合，其中菌群(A+B+C)表 示各菌悬液以体积比1:1：1混合。

[0049] 结果表明，较对照CK处理相比，MC处理，即本发明复合生物炭基菌群土壤调理剂不 仅能提高土壤pH值，还显著降低了土壤有效态Cd，并且符合国家土壤环境质量 (GB15618-1995)二级标准(pH值小于7.5：Cd含量≤0.30mg/kg)。单一处理C、DC、 M、DM虽然对土壤有效态Cd有一定的降低效果，但未达到国家标准。

[0050] (2)调理剂拮抗元素对比试验

[0051] 所选样品采自矿区附近被污染农田土壤(同上述试验)。按本发明所述的步骤进行对比 试验，以不加土壤调理剂为对照实验CK，设置单一拮抗元素J，复合拮抗元素DJ，单施复 合生物炭基菌群+拮抗元素处理MJ、复合生物炭+复合菌群土壤调理剂处理MC以及本发明 的复合生物炭基菌群土壤调理剂MCJ各处理重复3次，添加比例均占土壤质量的1％，室温 条件下养护7～30d，检测其有效态重金属含量。

[0052] 表2对比试验各处理土壤Cd有效态含量及pH值

[0053]

[0054] 注:表中a，b，c表示P<0.05下的显著性水平。

[0055] 拮抗元素A：Ca。

[0056] 拮抗元素B：Zn。

[0057] 复合生物炭基菌群：同表1。

[0058] 复合生物炭基菌群土壤调理剂：指复合生物炭基菌群与拮抗元素以质量比9：1混合，其中拮抗元素(A+B) 表示Ca、Zn以质量比5:1混合。

[0059] 结果表明，较对照CK处理相比，各处理均能一定程度降低有效态Cd含量，相比于拮 抗元素各处理，MCJ处理，即本发明复合生物炭基菌群土壤调理剂不仅能提高土壤pH值， 对有效态Cd的降低效果优于拮抗元素各处理。

[0060] 2小试试验

[0061] 所选样品采自不同矿区附近被污染农田土壤。按本发明所述的步骤进行小试试验，以复 合生物炭基菌群土壤调理剂(MCJ)为供试调理剂，以不加土壤调理剂为对照实验CK，各 处理重复3次，添加比例均占土壤质量的1％，室温条件下养护7～30d，检测其有效态重金 属含量。

[0062] 表3小试试验各供试土壤Cd有效态含量及pH值

[0063]

[0064] 结果表明(图1)，较各对照CK处理相比，MCJ处理，即复合生物炭基菌群土壤调理 剂对有效态Cd有显著降低效果。

[0065] 3长期稳定性试验

[0066] 长期稳定性试验所选土样与小试试验中供试土壤1相同，以复合生物炭基菌群土壤调理 剂(MCJ)为供试调理剂，添加比例均占土壤质量的1％，按本发明所述的步骤进行试验。 结果表明(图2)在添加土壤调理剂后的7天内，有效态Cd含量急速下降，在第5天的时 候已经低于土壤环境质量(GB15618-1995)二级标准，之后基本趋于平稳状态。

[0067] 本发明的优势总结：

[0068] (1)土壤调理剂原料来源广泛、环境友好，不会对环境产生二次污染。本发明中的生 物炭施入土壤可提高土壤碳库碳的储存量、提高土壤肥力、改善土壤结构；本发明中的微生 物可增加土壤中的生物多样性、改善土壤结构等。

[0069] (2)生物炭巨大的比表面积以及丰富的碱性官能团对重金属有强烈的吸附作用，而且 生物炭均可作为活性菌株的良好载体，活性菌株的加入更加增强了生物炭对重金属的亲和 力，二者起到了协同作用。

[0070] (3)本发明可降低重金属有效态含量，且稳定性好，可有效抑制作物对重金属的吸收 利用，同时能稳定作物产量。

附图说明

[0071] 图1为小试试验各供试土壤Cd有效态含量处理前后结果；

[0072] 图2为长期稳定性试验各供试土壤Cd有效态含量变化。

具体实施方式

[0073] 以下实施例旨在进一步说明本发明内容，而不是限制本发明权利要求的保护范围。

[0074] 盆栽试验实施案例：盆栽试验所选土样与小试试验中供试土壤1相同，水稻品种选取耐 Cd品种C两优7号。按本发明所述的步骤进行盆栽试验，以不加土壤调理剂为对照实验CK， 以本发明复合生物炭基菌群土壤调理剂MCJ为添加物，在0.1％～1％(调理剂占土壤的质量 百分比)之间设置三个添加物梯度，各处理重复3次，水稻收获后测定土壤重金属有效态含 量、pH值及水稻相关性状。

[0075] 盆栽试验结果表明，较对照CK相比，本发明复合生物炭基菌群调理剂能显著降低土壤 Cd有效态含量和糙米Cd含量，并且产量与CK相比基本持平。在处理1、2、3中，处理2 在降低土壤中有效态Cd含量和糙米Cd含量的同时还可以稳定作物产量，以处理2的调理 剂添加量最为适宜。

[0076] 表4盆栽试验各处理土壤及水稻相关性状

[0077]

[0078] 注:表中a，b，c表示P<0.05下的显著性水平。