三联组氨酸核苷结合蛋白的应用

摘要

三联组氨酸核苷结合蛋白的应用，属于心肌肥大症的分子生物学诊断领域，心肌细胞中HINT1蛋白在心肌肥大的进程中发挥了重要的调控作用，能够有效抑制心肌肥大的发生。通过腺病毒转染的方式，有效上调心肌细胞内的HINT1的表达水平后，可以有效的抑制心肌肥大的发生。

权利要求

1.三联组氨酸结合蛋白1在制备治疗心肌肥大药物中的应用。

2.三联组氨酸结合蛋白1在制备诊断心肌肥大试剂盒中的应用。

3.三联组氨酸结合蛋白1在筛选针对心肌肥大药物中的应用。

说明书

三联组氨酸核苷结合蛋白的应用

技术领域

[0001] 本发明属于心肌肥大症的分子生物学诊断领域，具体涉及三联组氨酸核苷结合蛋白(HINT1)的应用。

背景技术

[0002] 随着当今社会的飞速发展，心血管疾病作为人类健康“三大杀手”之首，正在日趋降低人类的生活质量，严重威胁人类的生命与健康。在众多心血管疾病中，心肌肥大的发生与发展受到人们的广泛关注。目前认为，心肌肥大是心力衰竭过程中一个重要的“过渡”过程，是心肌对于机械应激的一项代偿性反应。心肌肥大是心肌对心功能不全的适应性改变，初期代偿具有有益作用，后期进入失代偿产生不利影响，可以引起心律失常、心肌梗死、充血性心力衰竭等疾病的发生。心肌肥大的主要特征表现为：心肌细胞体积的肥大，细胞外基质的沉积，心肌纤维化的发生，以及伴有心肌内冠脉系统的形成异常等特征。众多研究表明：心肌肥大是心力衰竭的的重要前期病变。预防，延缓或逆转心肌肥大的发生与发展，可以有效的预防或遏制心力衰竭的发生，提高病人的生存质量。因此，明确心肌肥大的发生原因和机制，找寻有效的防治心肌肥大的新的思路和干扰靶点，是临床上有效防治心肌肥大的亟待解决的重要问题之一。

[0003] 三联组氨酸结合蛋白1(HINT1)，是一类普遍存在于哺乳动物的组织中，在进化中高度保守的蛋白。HINT1是一种嘌呤核苷酸结合蛋白，以二聚体的形式存在，具有高度保守的HIT序列。X线晶体结构研究发现该蛋白具有三联组氨酸家族结构特征：His-X-His-X-His-X,其中X序列为疏水性的氨基酸残基。HINT1在小鼠多种组织中具有表达，包括肝脏，肾脏，脑，心脏，肺等组织中均有分布。除此之外，HINT1在小鼠的神经系统中广泛表达，主要集中在嗅觉系统，大脑皮质，海马及其部分的丘脑，中脑和延髓。HINT1蛋白在细胞中主要定位于细胞质和细胞核。有文献报道，作为一种重要的抑癌基因，HINT1参与调控细胞的增殖，凋亡，纤维化等重要进程。目前，已经有研究发现HINT1在糖尿病，肝脏纤维化，肝脏缺血/再灌注，神经精神疾病以及多种肿瘤中均发挥了重要的调节作用，但是其在心血管疾病中的作用及其机制目前尚未有任何相关的研究和报道。

发明内容

[0004] 解决的技术问题：本发明提供一种三联组氨酸核苷结合蛋白(HINT1)的应用，通过干预心肌细胞内的HINT1的表达，有效抑制心肌肥大的发生。该方法包含利用腺病毒转染心肌细胞，上调细胞内HINT1蛋白的表达。

[0005] 技术方案：三联组氨酸结合蛋白1在制备治疗心肌肥大药物中的应用。

[0006] 三联组氨酸结合蛋白1在制备诊断心肌肥大试剂盒中的应用。

[0007] 三联组氨酸结合蛋白1在筛选针对心肌肥大药物中的应用。

[0008] 下调三联组氨酸结合蛋白1表达水平的siRNA，序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

[0009] 上调三联组氨酸结合蛋白1表达水平的腺病毒，所含rHINT1基因序列如SEQ ID NO.3所示。

[0010] 含有如SEQ ID NO.3所示rHINT1基因序列的腺病毒在上调三联组氨酸结合蛋白1表达水平中的应用。

[0011] 有益效果：利用向心肌细胞内转染腺病毒，上调细胞内的HINT1的表达水平，可有效抑制心肌肥大的发生。

附图说明

[0012] 图1：RT-PCR检测WKY大鼠和SHR大鼠心肌组织中HINT1的mRNA表达水平。

[0013] 图2：利用WT小鼠行假手术和TAC(主动脉缩窄)手术，构建小鼠的心肌肥大模型。术后2周，收取两组小鼠的心肌组织，利用RT-PCR检测两组小鼠心肌组织中HINT1的mRNA表达水平图。

[0014] 图3：利用WT小鼠行假手术和TAC(主动脉缩窄)手术，构建小鼠的心肌肥大模型。术后2周，收取两组小鼠的心肌组织，利用Western blot检测两组小鼠心肌组织中HINT1的蛋白表达水平图。

[0015] 图4：利用Western blot检测WKY大鼠和SHR大鼠心肌组织中HINT1的蛋白表达水平图。

[0016] 图5：收集临床上正常人和心肌肥大病人的心肌组织，利用Western blot检测两组心肌组织中HINT1的蛋白表达水平图。

[0017] 图6：利用siRNA干扰的方法，下调乳大鼠原代心肌细胞中HINT1的蛋白表达水平。通过Western blot检测干扰效率图。

[0018] 图7：利用siRNA干扰的方法，下调乳大鼠原代心肌细胞中HINT1的蛋白表达水平后，给以PE(苯肾上腺素)刺激24小时后，通过RT-PCR检测细胞内肥大基因ANP，BNP，β-MHC的表达情况图。

[0019] 图8：利用siRNA干扰的方法，下调乳大鼠原代心肌细胞中HINT1的蛋白表达水平后，给以PE刺激24小时后，通过α-actinin的免疫荧光染色检测细胞的面积大小图。

[0020] 图9：通过转染腺病毒的方式上调乳大鼠原代心肌细胞内的HINT1的蛋白表达水平，通过Western blot检测上调情况图。

[0021] 图10：通过转染腺病毒的方式，上调乳大鼠原代心肌细胞中HINT1的蛋白表达水平后，给以PE刺激24小时后，通过RT-PCR检测细胞内肥大基因ANP，BNP，β-MHC的表达情况图。

[0022] 图11：通过转染腺病毒的方式，上调乳大鼠原代心肌细胞中HINT1的蛋白表达水平后，给以PE刺激24小时后，通过α-actinin的免疫荧光染色检测细胞的面积大小图。

具体实施方式

[0023] 下面的实施例可使本专业技术人员可全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

[0024] 实施例1

[0025] 1.SiRNA转染

[0026] (1)提取乳大鼠原代心肌细胞，细胞种板培养于含10％胎牛血清的DMEM培养液中。

[0027] (2)细胞培养过夜后，采用脂质体法(LipofectAMINETM3000)进行转染。

[0028] (3)转染前PBS液洗涤细胞2次以去除培养基中剩余的血清。

[0029] (4)将1.5μL(40nM)siRNA序列与1.5μL脂质体LipofectAMINETM 3000分别溶于25μL无血清的DMEM培养基中，并在5min内将以上两种液体轻轻混匀，室温下静置20min。在24孔板每孔中加入无血清的DMEM培养液200μL，再将以上SiRNA和脂质体混合物50μL滴加至每孔中，轻轻摇匀。将细胞置于标准培养条件下，过夜后更换新鲜正常培养基继续培养。

[0030] (5)转染序列：

[0031] HINT1SiRNA序列:

[0032] SEQ ID NO.1：5-CAAGAAAUGUGCUGCGGAUTT-3

[0033] SEQ ID NO.2：5-AUCCGCAGCACAUUUCUUGTT-3

[0034] 2.细胞免疫荧光

[0035] (1)去除细胞培养基，用PBS洗涤细胞3次，5min/次。

[0036] (2)4％多聚甲醛室温固定细胞20min。

[0037] (3)弃去多聚甲醛，用PBS洗涤细胞3次，10min/次。

[0038] (4)加入0.1％TritonX-10处理,在室温下，摇床上通透处理25min。

[0039] (5)弃去液体，PBS洗3遍，10min/次，加入3％BSA室温封闭45min。

[0040] (6)弃去液体，加入α-actinin的抗体，4度孵育过夜。

[0041] (7)弃去一抗，PBS洗涤细胞3次，每次15min。

[0042] (8)加入荧光标记二抗，37度避光孵育1h后，PBS洗涤3次,每次15min，加入DAPI染液，染细胞核，室温避光处理5min。

[0043] (9)置于显微镜下，观察拍照。

[0044] 3.腺病毒转染原代心肌细胞

[0045] (1)提取乳大鼠原代心肌细胞，细胞种板培养于含10％胎牛血清的DMEM培养液中。

[0046] (2)细胞培养过夜后，采用腺病毒法进行转染。

[0047] (3)转染前PBS液洗涤细胞2次以去除培养基中剩余的血清，给以HINT1过表达的腺病毒(MOI＝50)处理8h。

[0048] (4)将细胞置于标准培养条件下，8小时后更换新鲜正常培养基继续培养。

[0049] (5)HINT1过表达腺病毒购于深圳百恩维生物有限公司。

[0050] rHINT1基因序列如下：SEQ ID NO.3：381bp

[0051] http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_001109607.1

[0052] ATGGCTGACGAGATTGCCAAGGCTCAAGTGGCCCAGCCCGGTGGCGACACGATCTTCGGCAAGATCATCC

[0053] GCAAAGAAATCCCGGCCAAGATCATTTTCGAGGACGATCGGTGTCTTGCTTTTCATGACATTTCCCCTCA

[0054] AGCACCAACACACTTTCTGGTGATACCCAAGAAGCACATATCCCAGATTTCTGTGGCAGATGATGATGAT

[0055] GAAAGTCTTCTAGGACATTTAATGATTGTTGGCAAGAAATGTGCTGCGGATCTGGGCCTGAAGCGCGGGT

[0056] ATCGGATGGTGGTGAATGAAGGTGCAGACGGGGGGCAGTCTGTCTATCATATTCACCTCCACGTCCTTGG

[0057] AGGTCGGCAGATGAACTGGCCTCCTGGTTAA

[0058] 4.Western-Blot

[0059] (1)SDS-PAGE(聚丙烯酰氨凝胶)电泳：配制12％的分离胶和3％的浓缩胶。取15μL样品液和3μL 6×加样缓冲液，混匀。煮沸5min使蛋白变性后上样，每孔上样量约为30μg。110V恒压电泳约90min，至溴酚蓝完全消失。

[0060] SDS-PAGE的配制：

[0061]

[0062] (2)转膜：电泳完毕后，切去浓缩胶，将胶浸于蛋白转移缓冲液(3.6g/L Tris，300mL/L甲醇，17.3g/L甘氨酸)中平衡10～20min。用湿转的方法将蛋白条带转移至PVDF膜上(SDS-凝胶位于负极，PVDF膜位于正极)，0.3A恒流电泳80min。

[0063] (3)封闭：转膜结束后，取下PVDF膜，PBS浸泡5min后将膜浸于含5％脱脂奶粉的PBS(MPBS)中1h。

[0064] (4)一抗孵育：封闭结束后将膜置于杂交袋内，加入抗体，4℃摇动下过夜。

[0065] (5)二抗结合：PBS-T(PBS中加入Tween-20，浓度为0.05％)快速洗膜一遍后，PBS-T洗膜10min×3遍。加入辣根过氧化物酶标记的兔抗羊第二抗体(1％MPBS 1:2000稀释)，室温下孵育1h。PBS-T快速洗膜一遍，再洗膜10min×3遍。

[0066] (6)ECL显色：临用前将ECL显色液A与B混和，均匀滴加至膜表面，避光曝片，观察结果。

[0067] 实验结果：

[0068] 1.为了探索HINT1蛋白在心肌肥大中的作用，我们利用WT小鼠行假手术以及TAC手术，分别提取了两组小鼠术后2周的心肌组织的总蛋白和总RNA。通过RT-PCR以及westernblot检测了两组小鼠心肌组织中的HINT1的蛋白表达情况。发现与对照组相比，TAC手术组小鼠心肌组织中的HINT1的mRNA水平和蛋白表达水平都明显降低(图1，2)。接着，我们提取了WKY大鼠和SHR大鼠的心肌组织的总蛋白和总RNA.通过RT-PCR以及western blot检测了两组大鼠心肌组织中的HINT1的蛋白表达情况。发现与WKY对照组相比，SHR大鼠心肌组织中的HINT1的mRNA水平和蛋白表达水平都明显降低(图3，4)。除此之外，我们还在临床上收集了正常人以及心肌肥大病人的心肌组织，通过western blot检测了两组心肌组织中HINT1的蛋白表达情况。研究结果发现，与正常人相比，心肌肥大的病人的心肌组织中HINT1的表达水平明显降低(图5)。以上实验结果提示：HINT1在心肌肥大中可能起到一定的保护作用。

[0069] 2.为了进一步确认HINT1蛋白在心肌肥大中的保护作用，我们利用siRNA干扰的方式下调了乳大鼠原代心肌细胞中的HINT1表达水平以后(图6)，通过RT-PCR检测了细胞内肥大相关基因ANP，BNP，β-MHC的表达水平。结果显示：与对照组相比，在下调了HINT1的表达水平以后，细胞内ANP，BNP，β-MHC的表达水平明显升高(图7)。同时，我们还利用α-actinin的免疫荧光染色检测了两组细胞的细胞面积大小情况。通过实验结果可以发现，与对照组相比，在下调了HINT1的表达水平以后，乳大鼠心肌细胞的细胞面积明显增大(图8)。以上实验结果可以有力证明：HINT1蛋白可以有效抑制心肌肥大的发生。

[0070] 3.为了进一步验证HINT1蛋白在心肌肥大中的保护作用，我们利用转染腺病毒的方式过表达乳大鼠原代心肌细胞中的HINT1表达水平以后(图9)，通过RT-PCR检测了细胞内肥大相关基因ANP，BNP，β-MHC的表达水平。结果显示：与对照组相比，在上调了HINT1的表达水平以后，细胞内ANP，BNP，β-MHC的表达水平明显降低(图10)。同时，我们还利用α-actinin的免疫荧光染色检测了两组细胞的细胞面积大小情况(图11)。通过实验结果可以发现，与对照组相比，在上调了HINT1的表达水平以后，可以有减少乳大鼠心肌细胞的细胞面积。以上实验结果可以进一步证明：HINT1蛋白在心肌肥大中起到了有效的保护作用。

[0071] 以上的实验结果充分证明，心肌细胞中HINT1蛋白在心肌肥大的进程中发挥了重要的调控作用，能够有效抑制心肌肥大的发生。通过腺病毒转染的方式，有效上调心肌细胞内的HINT1的表达水平后，可以有效的抑制心肌肥大的发生。因此，我们认为HINT1可以作为临床上治疗心肌肥大的一个新的重要靶标，在心肌肥大的防治中具有潜在的临床应用价值。

[0072] 上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。