Mundoserone抑制斑马鱼胚胎血管生成

摘要

本发明涉及Mundoserone抑制斑马鱼胚胎血管生成。本发明首先将斑马鱼放入不同浓度的Mundoserone药浴中，以具有明确抗血管生成作用的药物为阳性对照，以溶剂为阴性对照，发现Mundoserone具有抑制斑马鱼胚胎血管生成的作用，且抑制率与药物浓度相关，在此基础上，通过Real‑time PCR研究了Mundoserone对斑马鱼胚胎血管生成过程中相关信号通路的影响，明确了其抑制血管生成的机制。由此可知，Mundoserone可用于制备相关药物，用于治疗以血管生成为病理特征的疾病，如肿瘤、糖尿病视网膜病、血管瘤、牛皮癣、类风湿性关节炎、月经失调等。

权利要求

1.Mundoserone在制备抑制斑马鱼胚胎血管生成的试剂中的应用。

2.Mundoserone在制备试剂中的应用，其特征在于，所述的试剂用于：a)斑马鱼胚胎ISV或DLAV的生成；

b)抑制slit3、robo1、robo2、fgfr2或fgfr3的表达；或c)增加notch1a的表达。

说明书

Mundoserone抑制斑马鱼胚胎血管生成

技术领域

[0001] 本发明涉及生物医药技术领域，具体地说，涉及Mundoserone在抑制斑马鱼胚胎血管生成中的作用，及其在制备治疗以血管生成为病理特征的疾病药中的应用。

背景技术

[0002] 血管生成在恶性肿瘤进展过程中起着重要作用。新生血管为肿瘤细胞提供养分，使之能不断增殖；反之，如果抑制了新生血管的生成，肿瘤细胞得不到足够的养分，则可能停止增殖，甚至出现坏死。因此抑制新生血管生成是治疗恶性肿瘤的一种方法，抑制血管生成的药物，或可成为潜在的抗肿瘤药物。

[0003] 中国专利文献CN100577180C公开了一种藤黄酸在制备抑制血管生成药物中的应用，该发明提供了藤黄酸在制备抑制血管生成药物中的应用，特别是在制备抑制肿瘤、关节炎、视网膜病、血管瘤、银屑病等疾病的病变组织血管生成的药物中的应用；中国专利文献CN102048727A公开了一种芒柄花黄素在制备抑制血管生成药物中的应用，该发明首次发现芒柄花黄素具有抗血管生成作用，能够作为血管生成抑制剂应用于血管生成药物的制备以治疗肿瘤、关节炎、银屑病、眼科疾病、动脉粥样硬化等新生血管依赖性和新生血管相关性疾病。

[0004] 斑马鱼体外受精，胚胎体外发育，且胚胎透明，易于观察其体内的各种变化，通过转基因的方法使其血管内皮细胞表达绿色荧光蛋白(fli1a-EGFP品系)，就可以在荧光显微镜下清晰地观察到斑马鱼胚胎血管生成的情况。受精后24-48小时是斑马鱼胚胎血管生成的主要时期，在这一时间段将胚胎用药物处理，可以直观地观察到该药物是否能抑制斑马鱼胚胎血管生成，是否具有抗血管生成的作用。

[0005] Mundoserone分子量342.352，分子结构式如图1所示。目前还未见基于模式动物斑马鱼以证实Mundoserone与血管生成之间关系的相关报道。

发明内容

[0006] 本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供Mundoserone的新用途。

[0007] 第一方面，本发明提供了Mundoserone在制备治疗以血管生成为病理特征的疾病药中的应用。

[0008] 所述的以血管生成为病理特征的疾病可以是肿瘤、糖尿病视网膜病、血管瘤、牛皮癣、类风湿性关节炎或月经失调等。

[0009] 第二方面，本发明提供了Mundoserone在制备研究血管生成分子机制的试剂中的应用。

[0010] 第三方面，本发明提供了Mundoserone在制备抑制斑马鱼胚胎血管生成的试剂中的应用。

[0011] 第四方面，本发明提供了Mundoserone在制备试剂中的应用，所述的试剂用于：

[0012] a)斑马鱼胚胎ISV或DLAV的生成；

[0013] b)抑制slit3、robo1、robo2、fgfr2或fgfr3的表达；或

[0014] c)增加notch1a的表达。

[0015] 本发明优点在于：

[0016] 本发明首先将斑马鱼放入不同浓度的Mundoserone药浴中，以具有明确抗血管生成作用的PTK787为阳性对照，以溶剂DMSO为阴性对照，发现Mundoserone具有抑制斑马鱼胚胎血管生成的作用，且抑制率与药物浓度相关，低浓度的Mundoserone即表现出显著的抑制作用。在此基础上，通过Real-time PCR研究Mundoserone对斑马鱼胚胎血管生成过程中相关信号通路的影响，明确其抑制血管生成的机制。

[0017] 基于本发明的研究结果可知，Mundoserone可用于制备相关药物，用于治疗以血管生成为病理特征的疾病。其中，以血管生成为病理特征是指在该疾病的发生发展过程中存在血管新生过度，或虽然不存在血管新生过度，但是在其发生发展过程中必然经历血管新生的生物过程。以上疾病可以是肿瘤、糖尿病视网膜病、血管瘤、牛皮癣、类风湿性关节炎、月经失调等。

附图说明

[0018] 图1.Mundoserone的分子结构式。

[0019] 图2.Mundoserone抑制斑马鱼胚胎血管生成。

[0020] 图3-图5.Real time PCR结果。

[0021] 图6.Mundoserone抑制血管生成的机制。

具体实施方式

[0022] 下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

[0023] 实施例1

[0024] 一、材料和方法

[0025] 1.斑马鱼的饲养和繁殖

[0026] 使用血管内皮细胞表达绿色荧光蛋白的fli1a-EGFP转基因斑马鱼，斑马鱼成鱼、幼鱼及胚胎均饲养在28℃、pH7.0的养殖水中，饲养室常规设定14小时光照和10小时黑暗以模拟日夜循环。进行繁殖时每次取5-6对斑马鱼进行交配，一般每对斑马鱼一次可产200-300枚卵。斑马鱼养殖设备和饲养繁殖方法均符合国际实验动物评估和认可委员会(AAALAC)规定。

[0027] 2.药物配置与使用

[0028] Mundoserone购自Microsource，阳性对照药物PTK787购自Selleckchem，溶剂二甲基亚砜(DMSO)购自Sigma。配置时将Mundoserone和PTK787先溶解于DMSO中，再将溶解有药物的DMSO加入养殖水中，保证各不同药物及不同浓度组的养殖水中最终的DMSO浓度均为0.1％。Mundoserone的工作浓度设定为2.5μM,5μM,10μM三个浓度，以5μM PTK787为阳性对照，以0.1％DMSO为阴性对照，将配置好的药物分别放入12孔板(BD Falcon)中以备研究用。

[0029] 3.Mundoserone对斑马鱼胚胎血管生成的影响

[0030] 取受精后24小时(24hpf)的斑马鱼胚胎放入12孔板中，每孔30条，在上述不同的药物中药浴24小时后，每孔中随机取出10条胚胎，用0.016％MS-222麻醉并在荧光显微镜下观察结果，以体节间血管(ISV)为观察指标，计数每条斑马鱼完整的ISV数。完整的ISV定义为：连接背部纵向血管(DLAV)和背主动脉(DA)的ISV。药物对斑马鱼胚胎血管生成的抑制率按下述公式计算：抑制率(％)＝(1–药物组完整的ISV数/阴性对照组完整的ISV数)*100％。

[0031] 4.显微镜照像

[0032] 使用SMZ1500荧光显微镜(Nikon)对斑马鱼进行照像。将斑马鱼麻醉后侧卧于甲基纤维素(Sigma)中，并摆放成相同的体位，即头部在照片的左侧，腹部向下。对整条鱼进行照像时显微镜放大40倍，对其躯干部血管进行照像时显微镜放大112.5倍。

[0033] 5.Real-time PCR

[0034] 将24hpf斑马鱼胚胎分三组，每组90条，并分别药浴于10μM Mundoserone、5μM PTK787、0.1％DMSO中，24小时后，每组中随机取出30条用于Real-time PCR。使用Trizol(Roche)从胚胎中提取总RNA。使用PrimeScript RT试剂盒(Takara)进行RNA逆转录。使用Bio-rad iQ SYBR Green Supermix(Bio-rad)及Realplex系统(Eppendorf)对基因表达进行定量。基因表达相对定量分析是基于比较Ct法(2-ΔΔCt)并使用β肌动蛋白作为内参。引物序列见表1。整个实验重复三次。

[0035] 表1引物序列

[0036]

[0037]

[0038] 6.统计分析

[0039] 计量资料以均数±标准差表示，两组计量资料间比较采用t检验，三组及三组以上比较采用方差分析。使用GraphPad Prism 5.0(GraphPad)进行统计分析。以P<0.05为差异有统计学意义。结果中*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。

[0040] 二、结果

[0041] 1.Mundoserone抑制斑马鱼胚胎血管生成

[0042] 阴性对照组斑马鱼血管分布见图2A、F、K，有完整的DA、ISV和DLAV。阳性对照组(PTK787)斑马鱼血管分布见图2E、J、O，其ISV、DLAV的生成被完全抑制。Mundoserone抑制斑马鱼胚胎血管生成，且与浓度相关：经2.5μM Mundoserone药浴的斑马鱼ISV基本保持完整，但较之阴性对照组，其ISV明显变细(图2B、G、L)；经5μM Mundoserone药浴的斑马鱼ISV除明显变细外，有部分ISV不完整(图2C、H、M)；经10μM Mundoserone药浴的斑马鱼ISV变细，且大部分ISV不完整，同时DLAV生成也被抑制(图2D、I、N)。各处理组斑马鱼完整ISV数的比较见图2P，各组对ISV的抑制率见图2Q。

[0043] 2.Mundoserone抑制斑马鱼胚胎血管生成的机制

[0044] Real time PCR结果显示Mundoserone可增加notch1a的表达(图3)，抑制slit3、robo1、robo2的表达(图4)，并抑制fgfr2、fgfr3的表达(图5)，通过改变血管生成信号通路中上述关键基因的表达，抑制血管生成。

[0045] 三、结论

[0046] 1.Mundoserone抑制斑马鱼胚胎血管生成，且与浓度相关，10μM Mundoserone可显著抑制斑马鱼胚胎ISV、DLAV的生成。

[0047] 2.Mundoserone抑制血管生成的机制在于其改变了血管生成信号通路中关键基因的表达：增加notch1a的表达，抑制slit3、robo1、robo2、fgfr2、fgfr3的表达(图6)。

[0048] 综上所述，Mundoserone对于血管生成信号通路中关键基因的表达具有显著的调控作用，可显著抑制血管生成，因此可用于制备相关药物，用于治疗以血管生成为病理特征的疾病。其中，以血管生成为病理特征是指在该疾病的发生发展过程中存在血管新生过度，或虽然不存在血管新生过度，但是在其发生发展过程中必然经历血管新生的生物过程。以上疾病可以是肿瘤、糖尿病视网膜病、血管瘤、牛皮癣、类风湿性关节炎、月经失调等。

[0049] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。