UBA52蛋白及其应用

摘要

本发明以禽流感H5N1A/Chicken/ShanXi/2/2006毒株cDNA为素材，利用亲和纯化‑质谱技术(AP‑MS)，开展了病毒‑宿主蛋白互作组的研究，发现宿主蛋白UBA52可以和H5N1禽流感病毒蛋白PA、PA‑N155和PA‑N182相互作用，并且可以调节H5N1禽流感病毒的复制，当UBA52蛋白表达量高，则H5N1病毒复制效率高，反之，当UBA52蛋白表达量低，则H5N1病毒复制效率显著下降。在此基础上，本发明提供了UBA52蛋白在调节H5N1禽流感病毒复制中的应用，以及具体的应用手段和应用对象。为H5N1型禽流感病毒的预防、控制、和治疗提供了有力的科学依据和操作方法，具有重大的意义和价值。

权利要求

1.UBA52基因的抑制剂在制备抑制H5N1禽流感病毒复制的制剂中的应用，其特征在于，所述抑制剂为靶向UBA52基因的siRNA。

2.UBA52基因的抑制剂在制备预防和/或治疗H5N1禽流感的制剂中的应用，其特征在于，所述抑制剂为靶向UBA52基因的siRNA。

3.根据权利要求1或2所述应用，其特征在于，所述靶向UBA52基因的siRNA由序列如SEQ ID NO. 9所示的核苷酸和序列如SEQ ID NO. 10所示的核苷酸组成。

4.根据权利要求1或2所述应用，其特征在于，所述制剂的应用对象为家禽。

5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述家禽为鸡。

6.一组寡核苷酸，其特征在于，由序列如SEQ ID NO. 9所示的核苷酸和序列如SEQ ID NO. 10所示的核苷酸组成。

7.一种抑制H5N1禽流感病毒复制或预防和/或治疗H5N1禽流感的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含序列如SEQ ID NO. 9所示的核苷酸和序列如SEQ ID NO. 10所示的核苷酸。

说明书

UBA52蛋白及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于基因工程领域，具体涉及UBA52蛋白在调节H5N1禽流感病毒复制中的应用。

背景技术

[0002] H5N1禽流感病毒(Avian Influenza Virus,AIV)属于高致病性流感病毒，对家禽生产造成巨大的威胁。禽流感病毒属于甲型流感病毒，其遗传物质RNA总长度为13.6KB左右。禽流感病毒的基因组包括血凝素蛋白HA(hemagglutinin)、神经氨酸酶NA(neuraminidase)、聚合酶蛋白PA(polymerase acidic protein)、PB1(polymerase basic protein 1)、PB2(polymerase basic protein 2)、核蛋白NP(nucleoprotein)、基质蛋白M1(matrix protein1)、凋亡前体蛋白NS1(non-structure protein 1)等8个基因片段。上述基因直接编码，或者其编码的蛋白经剪切或修饰后最多可形成17个蛋白。某些毒株的基因可以从不同的位置起始翻译或移码突变，比如PA基因除编码PA蛋白外还编码PA-X、PA-N155和PA-N182三种蛋白。禽流感病毒本身不能自行复制，其复制必须依赖于宿主细胞系统完成。

[0003] 目前，关于禽流感病毒蛋白的结构和功能等研究进展显著，但有关禽流感病毒感染过程中与宿主的互作和关键宿主蛋白的鉴定还有待深入研究，这将为禽流感病毒传播的预防和控制，禽流感疫情的预防和治疗提供依据和参考。

发明内容

[0004] 本发明中，发明人以禽流感H5N1A/Chicken/ShanXi/2/2006毒株cDNA为素材，利用亲和纯化-质谱技术(AP-MS)，开展了病毒-宿主蛋白互作组的研究，发现宿主蛋白UBA52可以和H5N1禽流感病毒蛋白PA、PA-N155和PA-N182相互作用，并且可以促进/辅助H5N1禽流感病毒的复制。UBA52蛋白是N端为泛素、C端为核糖体蛋白L40(RPL40)的融合蛋白，该基因为真核生物核糖体60S亚基的组成部分，参与细胞内部分mRNA的转录起始。

[0005] 本发明目的通过以下技术方案来实现：

[0006] 本发明提供了一种UBA52基因或蛋白在促进H5N1禽流感病毒复制中的应用。在利用TCID50测定法对H5N1子代病毒的复制效率进行评价时，使用靶向UBA52的siRNA进行干扰，非干扰组H5N1子代病毒复制效率高，siRNA干扰UBA52蛋白表达导致H5N1子代病毒的复制效率显著降低，干扰组H5N1禽流感病毒滴度约为对照组滴度的1/100。

[0007] 在此基础上，本发明提供了一种UBA52基因或蛋白作为药物作用靶点在抑制H5N1禽流感病毒复制中的应用。

[0008] 进一步的，本发明提供了一种UBA52基因或蛋白抑制剂在制备抑制H5N1禽流感病毒复制的药物中的应用；以及UBA52基因或蛋白抑制剂在制备预防和/或治疗H5N1禽流感的药物中的应用。

[0009] 本发明所述“应用”，即可表示治疗目的的应用，也可表示非治疗目的的应用，例如，科学研究等。

[0010] 本发明所述“药物”或“抑制剂”可选自小分子抑制剂、寡核苷酸、抗体、多肽或融合蛋白。所述寡核苷酸优选为miRNA、siRNA或shRNA。所述siRNA优选为靶向UBA52基因的siRNA。

[0011] 本发明提供一组寡核苷酸，所述寡核苷酸的序列如SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10所示。上述寡核苷酸可用于抑制H5N1禽流感病毒的复制和传播。

[0012] 在此基础上，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包含如SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10所示的寡核苷酸序列。

[0013] 本发明的有益效果是：

[0014] 1、本发明提供一种UBA52基因或蛋白在调节H5N1禽流感病毒复制中的应用，从这一角度阐明了H5N1禽流感病毒复制、传播的机理，为H5N1禽流感病毒的预防、控制、和治疗提供了有力的科学依据和操作方法。

[0015] 2、本发明提供的靶向UBA52基因的寡核苷酸，其能够显著抑制H5N1病毒的复制效率，为H5N1禽流感病毒防控相关的科学研究和产业化应用提供科学手段。

附图说明

[0016] 图1.免疫共沉淀结合Western blot试验鉴定H5N1禽流感病毒PA、PA-N155、PA-N182蛋白与宿主UBA52蛋白的互作关系。

[0017] 图2.荧光定量PCR检测siUBA52干扰效率，siUBA52可以有效降低UBA52基因的表达。

[0018] 图3.siUBA52干扰UBA52表达后对H5N1病毒复制的影响。siUBA52为实验组，siNC为对照组。

具体实施方式

[0019] 通过以下实施例对本发明作进一步的详细描述，但应理解本发明并不受以下内容所限制。

[0020] 实施例1：宿主蛋白UBA52与H5N1禽流感病毒蛋白PA、PA-N155和PA-N182的相互作用关系验证

[0021] 1、PA、PA-N155、PA-N182以及UBA52基因表达载体构建

[0022] 根据pcDNA3.1-3×Flag C载体信息和Influenza research database公布的A/Chicken/ShanXi/2/2006(H5N1)的PA、PA-N155和PA-N182基因序列，利用Oligo6软件设计引物，基因的上下游引物均分别包含限制性酶切位点NheI和BamhI序列。

[0023] 根据pcDNA3.1-Myc载体信息和NCBI上公布的鸡UBA52基因(GenBank登录号：NM_205075.1)序列，利用Oligo6软件设计引物，上下游引物也均分别包含NheI和BamhI酶切位点。上述引物序列如下表所示，下划线部分表示酶切位点。

[0024]

[0025] 使用上述引物扩增目的片段，将目的基因片段连接入载体pcDNA3.1-3×Flag C或pcDNA3.1-Myc，构建获得PA、PA-N155、PA-N182以及UBA52基因表达载体pPA-pcDNA3.1-3×Flag C、pPA-N155-pcDNA3.1-3×Flag C、pPA-N182-pcDNA3.1-3×Flag C以及pUBA52-pcDNA3.1-Myc。

[0026] 2、DF1、MDCK细胞培养

[0027] (1)细胞复苏：从液氮中取出冻存细胞，立即置于37℃水浴中并快速摇晃，待细胞溶液完全溶解之后，将细胞溶液加入到9mL完全培养基中混匀，3000rpm离心5分钟，去上清，用新的完全培养基充分混匀细胞沉淀，加入到细胞培养皿中，混匀，放入37℃、5％CO2培养箱中培养。

[0028] (2)细胞换液：显微镜下观察细胞密度及形态，一般24h换液，提前15min37℃温浴细胞培养基，倒掉旧培养基，加入新培养基即可。

[0029] (3)细胞传代：显微镜下观察，细胞汇合度达到70％-80％时要进行传代，倒掉旧的培养基，用PBS轻柔清洗细胞，加入1.5mL0.25％的胰酶，消化至细胞开始有悬浮时立即加入4.5mL完全培养基终止消化，制备单细胞悬液。将细胞悬液加入到15mL离心管中，3000rpm离心5min，去上清，用6mL完全培养基充分悬浮细胞沉淀，加入到细胞培养皿中，混匀，放入37℃、5％CO2培养箱中培养。

[0030] 3、细胞转染

[0031] 待细胞培养至80％汇合度时，将基因表达载体pPA-pcDNA3.1-3×Flag C、pPA-N155-pcDNA3.1-3×Flag C、pPA-N182-pcDNA3.1-3×Flag C以及pUBA52-pcDNA3.1-Myc采用脂质体转染法分别转入到DF1细胞中。

[0032] 细胞转染按 3000试剂(Life Technologies)说明书进行：

[0033] (1)用 培养基稀释 3000试剂并充分混匀，用培养基稀释基因表达载体制成DNA预混液；

[0034] (2)在DNA预混液中添加P3000TM试剂，在每管已稀释的 3000试剂中加入稀释的DNA(1:1比例)，室温孵育5min，加入DNA-脂质体复合物至细胞中，转染48h；

[0035] (3)倒掉旧培养基，PBS冲洗后加0.25％的胰蛋白酶(Hyclone)于37℃培养箱消化5min，轻晃培养皿，显微镜下见细胞游离时立即加入2倍体积完全培养基终止消化；

[0036] (4)将细胞悬浮液加入到15mL离心管中，1000rpm离心5min，去上清，用PBS重悬细胞并转入1.5mL离心管中，1000rpm离心5min，去上清，细胞沉淀用于下游实验。

[0037] 4、蛋白质免疫共沉淀

[0038] (1)预处理beads：RIPA Buffer洗Protein A/G beads和anti-FLAG M2beads四次，每次5min。洗剂过程于4℃摇床进行，过程需要缓慢震荡。

[0039] (2)细胞收集及裂解：收集步骤3培养的细胞后加5倍细胞量的RIPA Buffer裂解细胞，12000rpm、4℃离心30min。取上清于冰上备用。

[0040] (3)Preclear：裂解液中加入预处理过的Protein A/G beads 20μL，于4℃摇床缓慢震荡2h，以去除非特异性杂蛋白，降低背景，离心后收集上清于新离心管中。取1/50裂解液(全蛋白)保存至-80℃冰箱用作阳性对照(Input)，剩余裂解液用作免疫沉淀(IP)即实验组。

[0041] (4)IP：向用作IP的裂解液中加入anti-FLAG M2beads，于4℃摇床缓慢震荡过夜。

[0042] (5)Wash：离心收集琼脂糖珠，弃上清，用RIPA buffer于4℃摇床清洗四次，前两次每次5min，后两次每次30min。54K buffer清洗两次，第一次5min，第二次30min。

[0043] (6)Elution：加入60uL TBS和5uL Flag peptide，4℃摇床1h，离心抽取上清。

[0044] (7)加入上样缓冲液，96℃煮沸10min，立即置于冰上，简短离心后吸取上清进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。用鼠IgG作为阴性对照。

[0045] 5、Western Blot

[0046] (1)蛋白经聚丙烯酰胺凝胶电泳后转至PVDF膜(Millipore)上，转膜条件为350mA恒流。

[0047] (2)PVDF膜封闭30min后，一抗孵育1h，TBST洗膜三次，每次5min，然后进行二抗孵育，TBST洗膜三次，每次5min。

[0048] (3)ImageQuant LAS 4000mini仪器自动曝光，采集Western杂交图像。

[0049] 本实验所用Flag标签的一抗为Anti-DDDDK tag antibody-(Equivalent to FLAG antibodies from Sigma)，Myc标签的一抗为Anti-Myc tag antibody(Equivalent to FLAG antibodies from Sigma)，二抗为Anti-mouse for WB secondary antibody。

[0050] 6、结果

[0051] 通过免疫共沉淀结合Western blot试验鉴定H5N1禽流感病毒PA、PA-N155、PA-N182蛋白与宿主UBA52蛋白的互作关系。禽流感病毒基因片段PA、PA-N155、PA-N182连接在pcDNA3.1-3×FLAG载体上，宿主基因UBA52连在pcDNA3.1-Myc载体上。上述基因与UBA52基因的互作验证实验共分3组(见图1)，前2泳道为PA与UBA52单质粒转染、PA-N155与UBA52单质粒转染、PA-N182与UBA52单质粒转染对照组，第3泳道为PA和UBA52、PA-N155和UBA52、PA-N182和UBA52表达载体共转染。24h后收集细胞，免疫共沉淀纯化FLAG标签融合蛋白，分别做抗Myc和抗FLAG的Western blot。

[0052] 免疫共沉淀纯化FLAG标签融合蛋白，进行抗FLAG的Western blot，结果显示含有FLAG标签的PA、PA-N155、PA-N182蛋白被成功富集，说明PA、PA-N155、PA-N182在DF1细胞中成功表达。用抗Myc进行Western blot检测，结果显示含有Myc标签的UBA52蛋白存在于PA、PA-N155、PA-N182互作蛋白复合物中，说明PA、PA-N155、PA-N182与UBA52之间存在互作关系(图1)。

[0053] 实施例2：siRNA干扰宿主蛋白UBA52表达

[0054] 1、siRNA设计和实验分组

[0055] 针对UBA52基因设计了两条siRNA，序列siUBA52-1、siUBA52-2、siNC由广州瑞博生物公司合成，siRNA序列如下表所示。

[0056]

[0057] 实验共分三组，实验组(siUBA52)、对照组(siNC)、无处理组(MOCK)。siUBA52的转染量为100nM，即两条siUBA52各50nM。siRNA采用脂质体转染法转入到DF1细胞中,细胞培养至80％汇合度时转染。细胞转染按 3000试剂(Life Technologies)说明书进行。用 培养基稀释 3000试剂并充分混匀，用 培
养基稀释siRNA并混匀，将每管已稀释的 3000试剂与siRNA预混液混合，室温孵育10min，加入细胞中，反应24h进行后续荧光定量PCR实验。

[0058] 2、荧光定量PCR实验

[0059] RNA提取按照总RNA提取试剂盒(天根，DP419)说明书进行，反转录按照FastQuantcDNA第一链合成试剂盒(天根，KR106)，siUBA52的干扰效率通过荧光定量PCR检测。PCR反应液使用One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit II(Takara,Kyoto,Japan)配置，通过ABI Prism 7500system(Applied Biosystems,USA)分析UBA52的表达量。GAPDH-ΔΔct为内参对照基因，使用2 方法计算。

[0060] 3、结果

[0061] 参见图2，展示了荧光定量PCR检测siUBA52干扰效率。siUBA52为实验组，siNC为对照组，MOCK为无处理组。GAPDH为内参对照基因，使用2-ΔΔct方法计算UBA52与GAPDH的相对表达量。由图可见，siUBA52可以有效降低UBA52的表达水平。

[0062] 实施例3：UBA52调节H5N1禽流感病毒复制

[0063] 1、病毒滴度检测(TCID50assay)

[0064] 采用TCID50测定法对H5N1禽流感病毒子代病毒的复制效率进行评价，实验设三个重复。

[0065] (1)siUBA52转染DF1细胞24h后，用无血清培养基洗细胞2遍；

[0066] (2)病毒用含1％胎牛血清的维持培养基稀释，0.01MOI接毒量侵染细胞；

[0067] (3)病毒吸附1小时后，用无血清培养基洗2遍，加入2毫升维持培养基，在12小时和24小时时收取上清液；

[0068] (4)在1.5mL EP管中用无血清培养基将步骤(3)获得的病毒上清液做连续9倍稀释，即10-1～10-9；同时弃去96孔板内的细胞培养液，1x PBS洗2遍后，加入各个稀释度的病毒悬液(100ul/孔)，每个稀释度做4个重复；把培养板置于37℃、5％CO2温箱中继续培养，72h后观察细胞病变，并记录结果，按Reed.Muench法计算TCID50。

[0069] 2、siUBA52干扰后对病毒复制的影响

[0070] 参见图3，siUBA52为实验组，siNC为对照组。由图可见，在病毒感染12h和24h后，UBA52干扰组病毒复制效率显著降低，并在12h时达到极显著水平。数据显示为平均值+标准差(SD)。TCID50数据通过独立样本T检验进行显著性分析。p≤0.05代表差异显著，p≤0.01代表差异极显著。由此可知，宿主蛋白UBA52能够促进或辅助H5N1禽流感病毒在宿主体内进行复制，而宿主蛋白UBA52的抑制剂则能够有效的抑制H5N1禽流感病毒在宿主体内进行复制，这为禽流感病毒的预防、控制、治疗提供了有力的科学依据和手段。

[0071] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。