一种组蛋白去乙酰化酶荧光探针及其制备方法和应用

摘要

本发明提供了一种组蛋白去乙酰化酶荧光探针及其制备方法和应用，该组蛋白去乙酰化酶荧光探针的结构式为合成路线中选用具有双光子效应的6‑(二甲基氨基)‑2‑萘醛作为染料，为了在脱乙酰化反应之后使氨基进一步发生亲核反应，从而产生荧光信号，我们将醛基碳修饰为氰基醇结构，羟基进一步接入HDACs的响应基团，用于活细胞及组织内对组蛋白去乙酰化酶活性的检测与成像。本发明所述的一种组蛋白去乙酰化酶荧光探针中通过引入具有强吸电子能力的氰基，使得HDACs与探针响应后，能迅速发生分子内成环反应，激活荧光信号，实现了活细胞及组织内对组蛋白去乙酰化酶的检测与成像，具有良好的临床应用价值。

权利要求

1.一种组蛋白去乙酰化酶荧光探针，其特征在于：该组蛋白去乙酰化酶荧光探针的结构式如下：

2.一种制备如权利要求1所述的一种组蛋白去乙酰化酶荧光探针的方法，其特征在于：

所述制备方法包括以下步骤：

(1)量取4～7mL40％二甲胺水溶液于100mL厚壁耐压管中，然后加入2～5g偏重亚硫酸钠和1～4g6-溴-2-萘酚，并加入15～40mL水，充分搅拌，将厚壁耐压管置于120～170℃加热条件下搅拌反应48～96h，反应完毕后冷却至室温，过滤收集滤饼，用去离子水将滤饼洗至中性，粗产物经过柱层析纯化得到化合物1；

(2)氩气保护下，向100mL的两口反应瓶中加入1～1.8g化合物1和10mL无水四氢呋喃，将反应瓶置于-78℃的冷阱中，然后用注射器吸取2～4mL1.6mol/L正丁基锂，缓慢加入反应瓶中反应45min，再用注射器缓慢加入0.5～1.5mL无水DMF，缓慢恢复至室温反应2h，反应完毕后，加入20mL饱和氯化铵溶液和60mL饱和碳酸氢钠溶液，并使用100mL乙酸乙酯进行萃取，萃取后合并有机相并加热，加热后的残留物经过柱层析纯化得到化合物2；

(3)在氮气保护和冰水浴的条件下，将无水碘化锌加入到溶解了0.2～0.6g化合物2的

10mL无水二氯甲烷溶液中，然后加入0.1～0.8mL三甲基氰硅烷，在室温条件下反应4～8h，然后加入40mL二氯甲烷，分别用饱和NaHCO3和NaCl溶液各洗涤1次，用无水MgSO4干燥后减压蒸馏得到油状液体，将该油状液体溶于10mL四氢呋喃中，然后加入3～8mL36.8％的浓盐酸反应3～6h，反应结束后向反应液中加入40.0mL水，用二氯甲烷萃取3次，经饱和NaCl溶液洗涤、无水MgSO4干燥后，减压蒸馏得到化合物3；

(4)在25mL的圆底烧瓶中加入10.0mL二氯甲烷中，然后分别加入0.15～0.3g化合物3、

0.15～0.4g6-乙酰氨基己酸、0.2～0.5g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、

0.01～0.05g4-二甲氨基吡啶，在室温条件下搅拌3～5.5h，再加入30.0mL水，用二氯甲烷萃取，经饱和NaCl水溶液洗涤、无水Na2SO4干燥后，减压蒸馏得到粗产品，将粗产品经柱层析纯化得到产物。

3.根据权利要求2所述的一种组蛋白去乙酰化酶荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中厚壁耐压管的加热条件为150℃，搅拌反应时间为72h。

4.根据权利要求2所述的一种组蛋白去乙酰化酶荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中柱层析纯化所用溶剂为石油醚与二氯甲烷，其中石油醚与二氯甲烷体积比为

3:1。

5.根据权利要求2所述的一种组蛋白去乙酰化酶荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中柱层析纯化所用溶剂为石油醚与乙酸乙酯，其中石油醚与乙酸乙酯的体积比为6:1。

6.根据权利要求2所述的一种组蛋白去乙酰化酶荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中三甲基氰硅烷的加入量为0.3～0.6mL。

7.根据权利要求2所述的一种组蛋白去乙酰化酶荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中柱层析纯化所用溶剂为甲醇与二氯甲烷，其中甲醇与二氯甲烷的体积比为1:

40。

8.如权利要求1所述的一种组蛋白去乙酰化酶荧光探针或如权利要求2-7任一项中所述的制备方法制备的一种组蛋白去乙酰化酶荧光探针在细胞内组蛋白去乙酰化酶活性检测中的应用，其特征在于：所述细胞内组蛋白去乙酰化酶活性检测机理为组蛋白去乙酰化酶荧光探针与组蛋白去乙酰化酶响应后，露出的氨基进一步进攻羟基碳，形成分子内七元环而脱去，变成氰醇基结构，激活荧光信号。

9.如权利要求1所述的一种组蛋白去乙酰化酶荧光探针或如权利要求2-7任一项中所述的制备方法制备的一种组蛋白去乙酰化酶荧光探针在细胞和组织的双光子成像分析中的应用。

说明书

一种组蛋白去乙酰化酶荧光探针及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物化学领域，尤其是涉及一种组蛋白去乙酰化酶荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 转录后修饰的核组蛋白乙酰化、甲基化、磷酸化，对染色质结构和基因表达起着关键的调节作用。组蛋白的乙酰化作用是可逆的，由组蛋白乙酰转移酶(HATs)和组蛋白去乙酰化酶(HDACs)控制。HDACs能将乙酰化赖氨酸上的乙酰基水解，得到带正电荷的赖氨酸，同时，HDACs与基因表达有着密切的关系。研究表明，HDACs的脱乙酰作用改变了组蛋白末端的电性状态，增强了与DNA的相互作用，从而使得染色质结构更加稳定。此外，已发现HDACs与某些疾病如癌症和精神疾病有关，甚至导致某些基因异常表达。因此，HDACs经常作为药物开发的关键目标吸引着诸多的研究者。尽管HDACs在医学和医药领域尤为重要，但到目前为止，通过简单有效的方法来检测HDACs活性的报道较少，其缺点在于难以实现活细胞内原位HDAC活性的成像，一般来说，荧光团的性质是由其电子状态控制。因此，对于任何潜在的HDACs探针而言，荧光团电子状态的改变应当通过酶触发反应实现。然而，这是HDACs探针设计最大的挑战，因为酶响应的主要位点乙酰化赖氨酸结构是一个脂肪酰胺，脂肪酰胺脱乙酰化并不影响荧光团的共轭效应，由于这个原因，脱乙酰反应不能直接影响荧光团的荧光性质。因此，酶触发反应本身并不能直接激活荧光。因此，开发一种简单又有效的荧光探针来实现检测HDACs的活性仍是一个挑战。

发明内容

[0003] 为解决上述技术不足，有鉴于此，本发明旨在提出一种组蛋白去乙酰化酶荧光探针及其制备方法和应用，以解决细胞内HDACs活性的检测难题。

[0004] 为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

[0005] 一种组蛋白去乙酰化酶荧光探针，该组蛋白去乙酰化酶荧光探针的结构式如下：

[0006]

[0007] 一种组蛋白去乙酰化酶荧光探针的制备方法包括以下步骤：

[0008] (1)量取4～7mL 40％二甲胺水溶液于100mL厚壁耐压管中，然后加入2～5g偏重亚硫酸钠和1～4g 6-溴-2-萘酚，并加入15～40mL水，充分搅拌，将厚壁耐压管置于120～170℃加热条件下搅拌反应48～96h，反应完毕后冷却至室温，过滤收集滤饼，用去离子水将滤饼洗至中性，粗产物经过柱层析纯化得到化合物1；

[0009] (2)氩气保护下，向100mL的两口反应瓶中加入1～1.8g化合物1和10mL无水四氢呋喃，将反应瓶置于-78℃的冷阱中，然后用注射器吸取2～4mL 1.6mol/L正丁基锂，缓慢加入反应瓶中反应45min，再用注射器缓慢加入0.5～1.5mL无水DMF，缓慢恢复至室温反应2h，反应完毕后，加入20mL饱和氯化铵溶液和60mL饱和碳酸氢钠溶液，并使用100mL乙酸乙酯进行萃取，萃取后合并有机相并加热，加热后的残留物经过柱层析纯化得到化合物2；

[0010] (3)在氮气保护和冰水浴的条件下，将无水碘化锌加入到溶解了0.2～0.6g化合物2的10mL无水二氯甲烷溶液中，然后加入0.1～0.8mL三甲基氰硅烷，在室温条件下反应4～
8h，然后加入40mL二氯甲烷，分别用饱和NaHCO3和NaCl溶液各洗涤1次，用无水MgSO4干燥后减压蒸馏得到油状液体，将该油状液体溶于10mL四氢呋喃中，然后加入3～8mL 36.8％的浓盐酸反应3～6h，反应结束后向反应液中加入40.0mL水，用二氯甲烷萃取3次，经饱和NaCl溶液洗涤、无水MgSO4干燥后，减压蒸馏得到化合物3；

[0011] (4)在25mL的圆底烧瓶中加入10.0mL二氯甲烷中，然后分别加入0.15～0.3g化合物3、0.15～0.4g 6-乙酰氨基己酸、0.2～0.5g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、0.01～0.05g 4-二甲氨基吡啶，在室温条件下搅拌3～5.5h，再加入30.0mL水，用二氯甲烷萃取，经饱和NaCl水溶液洗涤、无水Na2SO4干燥后，减压蒸馏得到粗产品，将粗产品经柱层析纯化得到产物。

[0012] 进一步的，所述步骤(1)中厚壁耐压管的加热条件为150℃，搅拌反应时间为72h，[0013] 进一步的，所述步骤(1)中柱层析纯化所用溶剂为石油醚与二氯甲烷，其中石油醚与二氯甲烷体积比为3:1。

[0014] 进一步的，所述步骤(2)中柱层析纯化所用溶剂为石油醚与乙酸乙酯，其中石油醚与乙酸乙酯的体积比为6:1。

[0015] 进一步的，所述步骤(3)中三甲基氰硅烷的加入量为0.3～0.6mL。

[0016] 进一步的，所述步骤(4)中柱层析纯化所用溶剂为甲醇与二氯甲烷，其中甲醇与二氯甲烷的体积比为1:40。

[0017] 本发明同时提供了如上所述的一种组蛋白去乙酰化酶荧光探针或如上所述的制备方法制备的一种组蛋白去乙酰化酶荧光探针在细胞内HDACs活性检测中的应用。

[0018] 本发明同时提供了如上所述的一种组蛋白去乙酰化酶荧光探针或如上所述的制备方法制备的一种组蛋白去乙酰化酶荧光探针在细胞和组织的双光子成像分析中的应用。

[0019] 相对于现有技术，本发明所述的一种组蛋白去乙酰化酶荧光探针及其制备方法和应用具有以下优势：

[0020] (1)本发明所述的一种组蛋白去乙酰化酶荧光探针，该探针对HDACs有特异性响应，且灵敏度高，响应速率快。该探针选用具有双光子效应的6-(二甲基氨基)-2-萘醛作为染料，设计合成了一个经过分子内反应就可以检测HDACs活性的荧光小分子探针，该探针中通过引入具有强吸电子能力的氰基，使得HDACs与探针响应后，能迅速发生分子内成环反应，脱去己内酰胺，还原成染料，激活荧光信号；

[0021] (2)本发明所述的一种组蛋白去乙酰化酶荧光探针及其制备方法和应用，该探针实现了活细胞及组织内对组蛋白去乙酰化酶的检测与成像，具有良好的临床应用价值。

附图说明

[0022] 构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

[0023] 图1为本发明实施例所述的探针CDAN与探针CP的合成路线；

[0024] 图2为本发明所述的CDAN与组蛋白去乙酰化酶的响应机理图；

[0025] 图3为本发明实施例所述的探针CDAN对组蛋白去乙酰化酶响应的特征荧光光谱；

[0026] 图4为本发明实施例所述的探针CDAN对加入不同浓度组蛋白去乙酰化酶溶液前后荧光发射光谱；

[0027] 图5本发明实施例所述的探针CDAN在0-9.0μg/mL范围内的组蛋白去乙酰化酶溶液的标准曲线；

[0028] 图6本发明实施例所述的探针CDAN对不同物质响应的荧光光谱；

[0029] 图7本发明实施例所述的探针CDAN和ADAN的双光子吸收活性截面图；

[0030] 图8本发明实施例所述的不同浓度的探针CDAN与HeLa细胞孵育24h后细胞存活率的变化情况；

[0031] 图9本发明实施例所述的探针CDAN对单细胞中组蛋白去乙酰化酶荧光成像图：

[0032] a-d：10μmol/L探针CDAN孵育2h后的单细胞单光子和双光子成像图；

[0033] e-h：1μmol/L抑制剂孵育1h后，再由10μmol/L探针CDAN孵育2h后的单细胞单光子和双光子成像图；

[0034] 图10本发明实施例所述的探针CDAN对多细胞中组蛋白去乙酰化酶荧光成像图：

[0035] a-d：10μmol/L探针CDAN孵育2h后的多细胞单光子和双光子成像图；

[0036] e-h：1μmol/L抑制剂孵育1h后，再由10μmol/L探针CDAN孵育2h后的多细胞单光子和双光子成像图；

[0037] 图11本发明实施例所述的探针CDAN对小鼠宫颈癌组织切片在不同深度的双光子荧光成像图。

具体实施方式

[0038] 下面结合实施例及附图来详细说明本发明。

[0039] 实验中使用的组蛋白去乙酰化酶(HDAC-6)由Cayman公司(USA)提供；宫颈癌细胞株HeLa由中南大学湘雅医学院实验中心细胞库提供；雌性裸鼠BALB/C-NU由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供。

[0040] 实施例1

[0041] (一)一种组蛋白去乙酰化酶荧光探针的制备方法包括以下步骤：

[0042] (1)化合物1的合成

[0043]

[0044] 量取6.4mL 40％二甲胺水溶液于100mL厚壁耐压管中，然后加入3.5g偏重亚硫酸钠和1.93g 6-溴-2-萘酚，并加入30mL水，充分搅拌，将厚壁耐压管置于150℃加热条件下搅拌反应72h，反应完毕后冷却至室温，过滤收集滤饼，用去离子水将滤饼洗至中性，粗产物经过柱层析纯化[V(石油醚)：V(二氯甲烷)＝3:1]得到化合物1(2.18g,产率87.3％).1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):7.81(1H,s,Ar-H),7.59(1H,d,J＝8.8Hz,Ar-H),7.52(1H,d,J＝8.0Hz,Ar-H),7.41(1H,d,J＝8.0Hz,Ar-H),7.15(1H,dd,J 1＝2.0Hz,J 2＝8.8Hz,Ar-H),
6.85(1H,d,J＝8.8Hz,Ar-H),3.03(6H,s,2×CH3).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ(ppm):147.78,
132.42,128.34,126.80,116.04,114.00,105.08,39.71。

[0045] (2)化合物2的合成

[0046]

[0047] 氩气保护下，向100mL的两口反应瓶中加入1.05g化合物1和10mL无水四氢呋喃，将反应瓶置于-78℃的冷阱中，然后用注射器吸取3.5mL1.6mol/L正丁基锂，缓慢加入反应瓶中反应45min，再用注射器缓慢加入0.7mL无水DMF，缓慢恢复至室温反应2h，反应完毕后，加入20mL饱和氯化铵溶液和60mL饱和碳酸氢钠溶液，并使用100mL乙酸乙酯进行萃取，萃取后合并有机相并加热，加热后的残留物经过柱层析纯化[V(石油醚)：V(乙酸乙酯)＝6:1]得到化合物2即ADAN(0.811g,产率81.5％).1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):10.01(1H,s,CHO),8.15(1H,s,Ar-H),7.82(2H,d,J＝8.8Hz,Ar-H),7.66(1H,d,J＝8.0Hz,Ar-H),7.18(dd,J 1＝2.4Hz,J 2＝8.8Hz,Ar-H),6.87(1H,d,J＝8.8Hz,Ar-H),3.13(6H,s,2×CH3).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ(ppm):190.81,149.62,137.63,133.79,129.72,125.78,122.48,115.19,
104.41,39.34.HR-ESI-MS m/z:calcd 200.1075,found 200.1084[M+H]+。

[0048] (3)化合物3的合成

[0049]

[0050] 在氮气保护和冰水浴的条件下，将无水碘化锌加入到溶解了0.2～0.6g化合物2的10mL无水二氯甲烷溶液中，然后加入0.1～0.8mL三甲基氰硅烷，在室温条件下反应4～8h，然后加入40mL二氯甲烷，分别用饱和NaHCO3和NaCl溶液各洗涤1次，用无水MgSO4干燥后减压蒸馏得到油状液体，将该油状液体溶于10mL四氢呋喃中，然后加入3～8mL 36.8％的浓盐酸反应3～6h，反应结束后向反应液中加入40.0mL水，用二氯甲烷萃取3次，经饱和NaCl溶液洗涤、无水MgSO4干燥后，减压蒸馏得到化合物3；

[0051] (4)产物的合成

[0052]

[0053] 在25mL的圆底烧瓶中加入10.0mL二氯甲烷中，然后分别加入0.15～0.3g化合物3、0.15～0.4g 6-乙酰氨基己酸、0.2～0.5g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、
0.01～0.05g 4-二甲氨基吡啶，在室温条件下搅拌3～5.5h，再加入30.0mL水，用二氯甲烷萃取，经饱和NaCl水溶液洗涤、无水Na2SO4干燥后，减压蒸馏得到粗产品，将粗产品经柱层析纯化[V(甲醇)：V(二氯甲烷)＝1:40]得到产物CDAN 0.26g，产率：67.2％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):7.76(1H,s,Ar-H),7.61-7.67(2H,m,Ar-H),7.33(1H,d,J＝8.8Hz,Ar-H),
7.12(1H,d,J＝8.0Hz,Ar-H),6.81(1H,s,Ar-H),6.44(1H,s,CH),5.47(1H,s,NH),3.08-
3.15(2H,m,CH2),3.01(6H,s,2×CH3),2.32(2H,t,J＝6.8Hz,CH2),1.86(3H,s,CH3),1.56-
13
1.64(2H,m,CH2),1.37-1.43(2H,m,CH2),1.22-1.30(2H,m,CH2). C NMR(100MHz,CDCl3)δ(ppm):171.81,170.10,149.60,135.74,129.23,127.93,127.41,125.67,124.83,124.45,
116.91,116.58,105.57,63.29,40.57,39.27,33.63,29.14,26.15,24.26,23.31.HR-ESI-MS m/z:calcd 382.2131,found 382.2133[M+H]+。

[0054] (5)探针CP的合成

[0055] 为了进一步证明探针CDAN的光谱性质、低毒性和对组蛋白去乙酰化酶的选择性，特设计探针CP，具体合成方法如下：

[0056] (a)化合物4的合成

[0057]

[0058] 在50mL的圆底烧瓶中加入ADAN(0.40g，2.0mmol)、硼氢化钠(0.12g，3.0mmol)和20mL甲醇，室温反应1h。待反应结束后，减压蒸馏除去溶剂，得到的粗产品经柱层析法纯化
1
可得到白色固体0.36g，产率：89.3％。H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):7.56-7.62(3H,m,Ar-H),7.29-7.31(1H,d,J＝8.4Hz,Ar-H),7.08-7.11(1H,d,J＝9.2Hz,Ar-H),6.85(1H,s,Ar-H),4.69(2H,s,CH2),2.97(6H,s,2×CH3).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ(ppm):147.70,133.51,
133.40,127.66,125.66,125.57,124.81,124.55,115.65,105.43,64.75,39.86.MS m/z+
(ESI):202.0[M+H]。

[0059] (b)探针CP的合成

[0060]

[0061] 在25mL的圆底烧瓶中分别将6-乙酰氨基己酸(0.26g，1.5mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI，0.35g，1.8mmol)、4-二甲氨基吡啶(DMAP，0.02g)、化合物4(0.20g，1.0mmol)溶于10.0mL二氯甲烷中，在室温条件下，搅拌约3h。待反应结束后，用40.0mL水稀释反应液，用二氯甲烷萃取3次后，经饱和NaCl水溶液洗涤3次，无水Na2SO4干燥后，减压蒸馏除去溶剂后得到粗产品，将粗产品经柱层析法纯化[V(甲醇)：V(二氯甲烷)＝
1:50]可得到白色固体0.29g，产率：81.7％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):7.56-7.63(3H,m,Ar-H),7.26-7.28(1H,d,J＝8.8Hz,Ar-H),7.09-7.12(1H,d,J＝9.2Hz,Ar-H),6.84(1H,s,Ar-H),5.42(1H,s,NH),5.14(1H,s,CH2),3.11-3.15(2H,m,CH2),2.98(6H,s,2×CH3),
2.29(2H,t,J＝7.2Hz,CH2),1.86(3H,s,CH3),1.56-1.62(2H,m,CH2),1.39-1.45(2H,m,CH2),1.24-1.30(2H,m,CH2).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ(ppm):172.57,169.04,147.92,
133.74,128.32,127.76,126.51,125.57,124.59,115.63,105.14,65.72,39.77,38.32,
33.14,30.41,28.68,28.13,25.27,23.44,22.28.MS m/z(ESI):379.0[M+Na]+。

[0062] (二)探针CDAN的光谱性质测试

[0063] 1、工作母液的配制

[0064] 1mmol/L探针CDAN：称取3.81mg探针CDAN样品加入10mL离心管中，用二甲基亚砜(DMSO)溶解配制成10mL溶液，并用微型旋涡混匀仪振荡混匀，置于冰箱中(4℃)保存备用。

[0065] 1mmol/LADAN：称取2.00mgADAN样品加入10mL离心管中，用二甲基亚砜(DMSO)溶解配制成10mL溶液，并用微型旋涡混匀仪振荡混匀，置于冰箱中(4℃)保存备用。

[0066] 1mmol/L CP：称取3.56mg探针CP样品加入10mL离心管中，用二甲基亚砜(DMSO)溶解配制成10mL溶液，并用微型旋涡混匀仪振荡混匀，置于冰箱中(4℃)保存备用。

[0067] 2、探针的荧光光谱测试方法

[0068] 本发明的荧光测试体系选用10mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.4)。在探针溶液中(终浓度为5μmol/L)加入不同溶度的组蛋白去乙酰化酶(由0μg/mL至9.0μg/mL)，测试样在37℃条件下孵育2h后，进行荧光发射光谱扫描。激发波长为380nm，激发狭缝宽度为5.0nm，发射狭缝宽度为5.0nm，具体结果见图3。如图3所示，探针CDAN在加入组蛋白去乙酰化酶溶液前，用380nm波长的光激发，并没有产生很强的荧光发射峰，当加入组蛋白去乙酰化酶溶液之后，探针CDAN和组蛋白去乙酰化酶的反应液在525nm处出现了一个荧光信号较强的特征发射峰。同时，我们用380nm波长的光直接激发ADAN，在525nm处产生了一个和前面所述的反应液几乎相同强度的荧光发射峰。这说明探针CDAN能够与组蛋白去乙酰化酶反应，且生成的具有荧光性质的物质与ADAN的发射峰相同，进一步验证了探针CDAN与组蛋白去乙酰化酶响应原理如上图2所示，同时说明该探针能够成功检测组蛋白去乙酰化酶的活性。

[0069] (三)探针CDAN对不同浓度组蛋白去乙酰化酶响应的荧光光谱

[0070] 我们研究了探针CDAN对不同浓度组蛋白去乙酰化酶溶液的响应情况。在PBS(10mmol/L，pH＝7.4)中加入浓度为5μmol/L探针CDAN和不同浓度的组蛋白去乙酰化酶(由0至70nM)，混合均匀后，所配制的溶液均在37℃下反应2h，再扫描其荧光发射光谱，如图4。

[0071] 由图4中可知：在未加入组蛋白去乙酰化酶之前，在525nm处，探针CDAN的荧光强度很弱，随着组蛋白去乙酰化酶溶液浓度的增加(0-70nM)，探针CDAN与组蛋白去乙酰化酶响应，生成ADAN，在525nm处的荧光强度逐渐增强，当加入的组蛋白去乙酰化酶浓度为60nM时荧光强度达到最大。说明此时该探针与组蛋白去乙酰化酶响应完全。根据图4所示，我们绘制出探针CDAN与组蛋白去乙酰化酶响应的线性关系图，如图5。从图5中可知：探针CDAN在525nm处的荧光强度与组蛋白去乙酰化酶浓度的线性响应范围为0-60nM，且线性关系较好(R＝0.988)。通过3倍信噪比(3σ/k)的方法，我们计算得出该探针对HDACs的检测下限为
0.9nM，根据以上数据可知，探针CDAN对HDACs的响应具有较高的灵敏度。

[0072] (四)探针CDAN对组蛋白去乙酰化酶的响应选择性

[0073] 为了进一步证明探针CDAN对组蛋白去乙酰化酶的特异性响应。我们探究了在PBS(10mmol/L，pH＝7.4)的缓冲液中，不同干扰物质对探针CDAN的响应性质。将浓度为5μmol/L的探针CDAN分别与KCl(50mmol/L)、NaCl(50mmol/L)、CaCl2(2.5mmol/L)、MgCl2(2.5mmol/L)、Na2S(2.5mmol/L)、FeCl3(2.5mmol/L)、色氨酸(Tryptophan)(1mmol/L)、维生素C(Vitamin C)(1mmol/L)、半胱氨酸(Cysteine)(1mmol/L)、高半胱氨酸(Homocysteine)(1mmol/L)、谷胱甘肽(Glutathione)(1mmol/L)、H2O2(1mmol/L)、二硫代苏糖醇(0.5mmol/L)、醌氧化还原酶(hNQO1)(0.2ug/mL)、硝基还原酶(NTR)(0.5ug/mL)、γ-谷氨酰转肽酶(GGT)(1.0ug/mL)、单胺氧化酶A(MAO-A)(1.0ug/mL)、HDAC-6(60nM)于37℃下进行反应，反应2h后再对反应液进行荧光光谱扫描，并记录525nm处的荧光强度，如图6。由图6可知，在380nm的光激发下，60nM的组蛋白去乙酰化酶引起的探针CDAN溶液在525nm处的荧光增强倍数，远远大于在相同条件下其他潜在干扰物质所引起的探针CDAN溶液的荧光增强倍数。由此说明，探针CDAN对组蛋白去乙酰化酶具有特异性响应，对组蛋白去乙酰化酶具有很高的选择性，能够满足其细胞成像的要求。

[0074] (五)探针CDAN的双光子吸收截面

[0075] 我们进一步探究了探针CDAN的双光子成像能力。在PBS(10mmol/L，pH＝7.4)的测试体系中，将探针CDAN和ADAN配制成5μmol/L的溶液，将罗丹明B溶于甲醇配制成5μmol/L的溶液作为参照物。然后分别在700-800nm的激发波长下测试探针CDAN、ADAN和罗丹明B的双光子发射光谱。

[0076] 如图7所示，我们测定了探针CDAN和ADAN的双光子吸收活性截面值，ADAN在760nm处有最大的双光子吸收，它的双光子吸收活性截面值为56GM，暗示了该探针的双光子激发波长为760nm。

[0077] (六)探针CDAN对活细胞及组织中组蛋白去乙酰化酶的生物成像

[0078] 为了探究探针CDAN在活细胞中的潜在应用价值，我们首先通过MTT比色法实验来考查该探针对细胞的毒性。分别取不同浓度(0、1、5、10、20μmol/L)的探针CDAN与HeLa细胞孵育24h。

[0079] 如图8所示，我们可知在浓度为10μmol/L时，HeLa细胞的存活率达90％，这一结果充分证明，探针CDAN具有较低的细胞毒性，对细胞的正常生理活动不会产生影响，适合将该探针应用于活细胞荧光成像分析。

[0080] 最后，我们考查了探针CDAN在HeLa细胞中对组蛋白去乙酰化酶活性的响应情况。将细胞随机分成两组，每组细胞有四皿细胞。首先，我们选用了第一组细胞中的两皿细胞用于该探针单光子成像分析实验，选用第一组细胞中的另外两皿细胞用于该探针双光子成像实验。其次，为了进一步证明该探针对生物体内的组蛋白去乙酰化酶活性的成像能力，我们选用第二组细胞用于组蛋白去乙酰化酶的抑制剂荧光成像实验。在第一组细胞中均加入终浓度为10μmol/L的探针CDAN，在培养箱中孵育2h；在第二组细胞中先与抑制剂1μmol/L伏立诺他(Vorinostat)共孵育1h后，再加入终浓度为10μmol/L的探针，再孵育2h。使用Olympus FV1000共聚焦显微镜进行成像分析实验，荧光成像实验中，单光子选用405nm为激发波长，双光子激发波长为760nm并收集500-550nm通道内的荧光信号。

[0081] 从图9(a-d)和10(a-d)我们可以观察到，在探针和细胞共孵育2h后，HeLa细胞中有很明显的绿色荧光信号产生，说明该探针有很好的生物相容性，并能成功应用于细胞内组蛋白去乙酰化酶活性的检测。比较图10b和d，不难发现，双光子成像采用波长较长的(近红外区)、在生物组织中的穿透能力比较强的红外激光作为激发光源，因此成像效果有着比单光子成像无法比拟的优势。从图9(e-h)可知，先加入1μmol/L抑制剂孵育1h后，再加入10μmol/L探针CDAN孵育2h后，HeLa细胞中只能观察到很微弱的荧光信号，从图10(e-h)中，我们几乎看不到绿色荧光信号。这是因为伏立诺他抑制了细胞内组蛋白去乙酰化酶的活性，使得探针CDAN与酶结合后不发生反应，因而观察不到绿色荧光信号。该抑制性实验说明，该探针具有特异性检测细胞中组蛋白去乙酰化酶的能力。

[0082] 我们选用了小鼠结肠癌组织切片来研究探针CDAN在生物组织中成像的应用。将该探针(10μmol/L)与组织共同孵育2h后收集500-550nm通道内的荧光信号，双光子激发波长为760nm，如图11。

[0083] 由图11可知，该探针在组织深度为40-110μm之间有明显的绿色荧光信号，甚至在120-130μm的组织深度下，依旧能观察到部分绿色荧光信号。此外，组织成像实验，能够揭示在不同组织深度的组蛋白去乙酰化酶的分布情况。以上实验说明，探针CDAN能够对生物体中的组蛋白去乙酰化酶进行双光子成像检测。

[0084] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。