一种富锌菌株及其应用

摘要

本发明涉及一种富锌菌株及应用，本发明采用的逐步提高硫酸锌浓度的方法驯化枯草芽孢杆菌，获得枯草芽孢杆菌株，该菌种能够显著地提高枯草芽孢杆菌的耐受性，不仅增加了菌体的含锌量，而且提高了菌体中粗蛋白、酶、小肽、氨基酸等含量，使微生态与有机锌融为一体，使用方便，应用效果好。制备的枯草芽孢杆菌锌不仅拥有枯草芽孢杆菌的优点，而且将无机锌转化成菌体有机锌，大大提高了动物对微量金属元素的利用率，更好地发挥有机锌的生物学功能，可谓一菌两效；另外，有机锌利用率的提高大大降低了饲料中无机锌的使用量和排放量，减少了生态环境的污染。为此，此发明为开发新型动物微生态制剂以及微量元素“减量化”使用提供了重要技术支撑。

权利要求

1.一种富含锌的枯草芽孢杆菌菌株，其特征在于，所述的菌株的保藏编号为CGMCC No.15330。

2.权利要求1所述的菌株在制备菌粉中的应用。

3.一种提高枯草芽孢杆菌中锌含量的发酵方法，其特征在于，所述的方法，是将权利要求1所述的枯草芽孢杆菌菌株接种到培养基中，接种量1 7%，培养温度24 36℃，培养时间40~ ~

50h，转速150 240r/min；培养基配方如下：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，葡萄糖~ ~

5g/L，pH值7.0，锌浓度33.9mg/L。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的培养方法如下：接种量3%，培养温度30℃，培养时间48h，转速150r/min。

5.一种菌粉，其特征在于，所述的菌粉是使用权利要求1所述的菌株发酵制备的。

6.如权利要求5所述的菌粉，其特征在于，所述的菌粉是使用权利要求3所述的方法发酵制备的。

7.如权利要求6所述的菌粉，其特征在于，所述的菌粉，是使用权利要求3所述的方法进行发酵后，收集发酵菌体，将菌体进行洗涤过滤，然后55℃烘干制备的。

说明书

一种富锌菌株及其应用

技术领域

[0001] 本发明属畜禽微生态制剂生产技术领域，具体涉及一种富锌菌株及其应用。

背景技术

[0002] 枯草芽孢杆菌是一种肠道有益菌，抗逆性强，可分泌多种酶和维生素，能够富集二价金属离子，不易受畜禽体内肠道中各种酶的影响，具有增强畜禽免疫力和抗应激能力，调节肠道内菌群，提高生长性能等多种功能。主要应用于动物饲料领域以及环境保护领域。有研究表明，将枯草芽孢杆菌粉添加到动物饲料中能够显著地提高动物的采食量以及各种生长指标；另一方面利用枯草芽孢杆菌能够吸附二价金属离子的特性，处理重金属环境污染问题，能够起到净化水质，保护环境的作用。然而这种应用菌种单一特性产品，极大地限制了市场的发展空间。因此，开发一种融合枯草芽孢杆菌多种优点的产品，对满足不同消费群体的需要具有重要的社会意义。

[0003] 酵母菌和枯草芽孢杆菌在动物肠道中均属于过路菌，但是后者属于耗氧菌，能够抑制有害菌繁殖，耐胃酸胆盐强，高温制粒效果好，因此，利用枯草芽孢杆菌吸附二价金属离子的作用，开发一种枯草芽孢杆菌锌产品具有重要的研究意义。

发明内容

[0004] 本发明所要解决的技术问题是一种富锌菌株及其应用，该菌株可以作为饲料添加剂，既达到促进动物肠道消化和提高饲料利用率目的，又能够起到补锌的效果。

[0005] 本发明首先提供一种富含锌的枯草芽孢杆菌菌株，为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NZ56株，于2018年1月31日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15330。

[0006] 本发明再一个提供一种提供提高枯草芽孢杆菌中锌含量的发酵方法，其中培养条件如下：接种量1～7％，培养温度24～36℃，培养时间40～50h，转速150～240r/min。

[0007] 其中一种具体的培养条件如下：培养条件如下：接种量3％，培养温度30℃，培养时间48h，转速150r/min；

[0008] 所使用的培养基配方如下：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，葡萄糖0～25g/L，pH值6.0～8.0，锌浓度0～67.8mg/L。

[0009] 所使用的培养基，其一种具体配方如下：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl10g/L，葡萄糖5g/L，pH值7.0；

[0010] 本发明所筛选的菌株用于制备菌粉，是使用上述的方法对枯草芽孢杆菌进行发酵后，收集发酵菌体，将菌体进行洗涤过滤，然后55℃烘干制备，其菌活数达到3×109cfu/g。

[0011] 所制备的菌粉可用作饲料添加剂来使用。

[0012] 与现有技术相比，本发明方法具有如下优点：

[0013] 1、筛选获得了特殊驯化后的菌种，筛选的枯草芽孢杆菌能够耐受高浓度的硫酸锌，并且能够稳定的生长，产生大量的活性物质，如酶、蛋白、小肽、氨基酸等，进而促进枯草芽孢杆菌锌的制备。

[0014] 2、采用两个平衡点进行选择。由于在制备枯草芽孢杆菌锌的过程中，不仅仅要保证高浓度的菌体，而且需要控制菌体有机锌量，经研究发现当菌体含量高时，菌体有机锌量低；菌体含量低，菌体有机锌量反而增加。因此，根据这个特性，应考虑同时兼顾菌体含量和菌体有机锌量。

[0015] 3、具有能补锌和促进生长发育双重功效。本发明弥补了无机锌和单一菌种的缺陷。能够将无机锌大部分转化成有机锌，并且结合了枯草芽孢杆菌和锌的特性，有利于促进肠道消化、抑制有害菌种、对缺锌的动物更是能够达到补锌的功效。

[0016] 4、工艺简单安全，可操作性强，成本低。本发明采用的菌种为我国农业部公布的12种可直接饲喂动物的饲料级微生物添加剂之一，具有能在肠道内生长、分泌酶和维生素、促进肠道各种消化酶活性、抑制有害菌等作用。另外，本发明在进行发酵时操作工艺简便，成本较低。

附图说明

[0017] 图1驯化对枯草芽孢杆菌脂肪酶活力的影响图；

[0018] 图2驯化对枯草芽孢杆菌红外光谱图的影响图；

[0019] 图3菌体含量响应面中温度与pH值交互对枯草芽孢杆菌锌的影响图；

[0020] 图4菌体含量响应面中温度与葡萄糖浓度交互对枯草芽孢杆菌锌的影响图；

[0021] 图5菌体含量响应面中葡萄糖浓度与pH交互对枯草芽孢杆菌锌的影响图；

[0022] 图6菌体有机锌量响应面中温度与pH值交互对枯草芽孢杆菌锌的影响图；

[0023] 图7菌体有机锌量响应面中温度与葡萄糖浓度交互对枯草芽孢杆菌锌的影响图；

[0024] 图8菌体有机锌量响应面中葡萄糖浓度与pH交互对枯草芽孢杆菌影响图。

具体实施方式

[0025] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面通过实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本发明的实施例是用于解释本发明而不是对本发明的限制。

[0026] 本发明通过驯化枯草芽孢杆菌，优化培养基以及发酵条件，获得了枯草芽孢杆菌菌株，不仅提高了菌体发酵过程中产生的酶、氨基酸以及小肽等活性物质，而且通过平衡菌体含量和枯草芽孢杆菌的富锌量，将其应用于动物生长，可以起到促进肠道消化、提高免疫力、提高饲料利用率，增长体重等作用，而且针对缺锌动物可以起到补锌的功效。因此，本发明创新的富锌枯草芽孢杆菌与发酵方法，对开发新型动物补锌产品提供新途径。

[0027] 由于枯草芽孢杆菌对二价金属离子的吸附能力比酵母菌的弱，因此，在制备过程中提取率低，并且舍弃的原料较多，成本较高。然而，采用本发明所驯化筛选的枯草芽孢杆菌及优化的培养方法，不仅能够保持高浓度的枯草芽孢杆菌，而且还可以提高枯草芽孢杆菌的有机锌量；其中，当锌添加量为33.9mg/L时，菌体干重为1.44193g/L，菌体有机锌量2511.55mg/kg；然而，采用酵母锌的制备方法来获得枯草芽孢杆菌锌无法得到上述高菌量、高有机锌量的理想效果。

[0028] 本发明的枯草芽孢杆菌锌的筛选方法包括如下步骤：

[0029] 1)菌种的驯化：将普通用于饲料添加使用的枯草芽孢杆菌粉末，经过活化、分离纯化等步骤，获得枯草芽孢杆菌菌种；然后利用微生物能逐渐适应不利生长环境因素的特性，采用逐步提高培养基中硫酸锌浓度的方式进行驯化；最终获得能够耐受高浓度硫酸锌的菌种，即为驯化后的菌种，并将该菌种进行斜面保藏，4℃储藏备用。

[0030] 2)菌种的鉴定及理化性质：将驯化后的枯草芽孢杆菌进行菌种鉴定，并通过与驯化前的菌种进行菌形态、酶活、小肽、氨基酸等比较，进一步确定驯化后的枯草芽孢杆菌即为目标菌种。

[0031] 本发明所建立的发酵方法的过程如下：

[0032] 3)平衡点的确定：根据该菌种的生长特性以及对金属锌离子的耐受能力，确定衡量该菌种发酵终点的指标为菌体含量以及菌体有机锌量。

[0033] 4)培养基及培养条件的优化：通过单因素试验优化葡萄糖、pH、培养温度、转速、接种量等含量，初步获得该菌种的培养基配方及培养条件。

[0034] 5)响应面分析：根据单因素结果及回归方程分析，最终通过响应面分析进一步确定该菌种培养基配方及培养条件。

[0035] 6)枯草芽孢杆菌锌的制备：在最终优化的培养基及培养条件下培养驯化后的枯草芽孢杆菌，经过培养一定时间，离心、清洗获得沉淀，55℃烘干后即为枯草芽孢杆菌锌。

[0036] 枯草芽孢杆菌锌的制备参数为：①培养基配方：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，葡萄糖4.50g/L，锌浓度33.9mg/L，pH值6.57；②培养条件：接种量3％，培养温度
29.50℃，培养时间48h，转速180r/min。

[0037] 当锌的添加量为33.9mg/kg时，最终获得的枯草芽孢杆菌锌的菌体干重为1.44193g/L，菌体有机锌量2511.55mg/kg。

[0038] 下面结合具体实施案例对本发明方法进行详细描述。

[0039] 实施例1：枯草芽孢杆菌锌的制备

[0040] 1)菌种的驯化：将普通用于饲料添加的枯草芽孢杆菌粉末，经过活化、分离纯化等步骤，获得枯草芽孢杆菌菌种；然后利用微生物能逐渐适应不利生长环境因素的特性，采用逐步提高培养基中硫酸锌浓度的方式进行驯化；

[0041] 2)菌种的鉴定及理化性质：将初步驯化后的枯草芽孢杆菌进行菌种鉴定，并通过与驯化前的菌种进行形态、酶活、小肽、氨基酸等比较，进一步确定驯化后的枯草芽孢杆菌即为目标菌种。

[0042] 最终筛选获得了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NZ56株，于2018年1月31日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15330；

[0043] 所使用的培养基配方如下：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，葡萄糖5g/L，pH值7.0；培养条件如下：接种量3％，培养温度30℃，培养时间48h，转速150r/min.[0044] 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NZ56株(驯化后)与原始出发菌株(驯化前)的发酵活性物质见表1，表2；

[0045] 从表1可以看出，驯化后的枯草芽孢杆菌能够增加菌体中的小肽含量和粗蛋白含量，但培养时间不同时也存在差异。其中驯化的枯草芽孢杆菌在对数期小肽和粗蛋白的含量有所增加，但差异不显著。另外在稳定期，驯化后与驯化前的菌体中小肽含量差异显著(P<0.05)，粗蛋白含量差异极显著(P<0.01)。说明驯化枯草芽孢杆菌能够影响菌体中的小肽含量和粗蛋白含量。

[0046] 从表2可以看出，驯化前后的枯草芽孢杆菌至少含有17种氨基酸，其中含有人体必需氨基酸7种(儿童必需氨基酸8种)、9种药效氨基酸、3种支链氨基酸、2种芳香氨基酸。另外，驯化后的枯草芽孢杆菌中氨基酸总量提高了3.68％，其中人体必需氨基酸总量提高5.41％(儿童必需氨基酸总量提高4.27％)，药效氨基酸总量降低0.38％，支链氨基酸总量提高14.83％，芳香族氨基酸总量提高14.72％。说明驯化后的枯草芽孢杆菌氨基酸产生了显著变化，更适合用于机体需求。

[0047] 表1：驯化对枯草芽孢杆菌中小肽及粗蛋白的影响表

[0048]

[0049] 注：表中a、b为显著性标注符号，同种字母表示差异不显著，不同字母表示差异显著。

[0050] 表2：驯化对枯草芽孢杆菌中氨基酸的影响表

[0051]

[0052]

[0053] 注：a人体必需氨基酸；b儿童必需氨基酸；c药效氨基酸；d支链氨基酸；e芳香族氨基酸；∑表示总量。

[0054] 实施例2发酵方法的建立

[0055] 1、本发明步骤如下：

[0056] 1)平衡点(衡量指标)的确定：根据该菌种的生长特性以及对金属锌离子的耐受能力，确定菌体含量和菌体有机锌量为最终衡量指标。

[0057] 2)培养基及培养条件的优化：通过单因素试验优化葡萄糖、pH、培养温度、转速、接种量等含量，初步获得该菌种的培养基配方及培养条件。

[0058] 3)响应面分析：根据单因素结果，进一步通过响应面分析确定该菌种培养基配方及培养条件。

[0059] 4)枯草芽孢杆菌锌的制备：在最终优化的培养基及培养条件下培养驯化后的枯草芽孢杆菌，经过培养一定时间，离心收集菌体，用去离子水洗涤3～4次，除去培养基中无机锌及其他成分后即得枯草芽孢杆菌锌湿样，经55℃烘干后，检测含量，得到枯草芽孢杆菌锌粉末。

[0060] 2、单因素结果分析

[0061] 通过单因素初步筛选得到，所述的培养基参数为：①培养基配方：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，葡萄糖5g/L，pH值6.5；②培养条件：接种量3％，培养温度30℃，培养时间48h，转速180r/min。

[0062] 通过SPSS 17.0统计软件包，对可能影响枯草芽孢杆菌锌的菌体含量和菌体有机锌量的因素进行单因素线性回归分析，筛选出统计学上具有显著意义性的影响因素(P＜0.05)：培养温度、葡萄糖浓度、培养PH(见表3)。

[0063] 表3：单因素线性回归分析表

[0064]

[0065] 3、响应面试验因素和方案结果

[0066] 响应面试验因素编码及水平、设计及其结果分别见表4、表5。

[0067] 表4：响应面试验因素编码及水平表

[0068]

[0069]

[0070] 表5：响应面试验设计及其结果

[0071]

[0072] 4、响应面试验回归模型的建立与分析

[0073] 通过响应面软件Design-Expert 8.0.6Trial对试验结果进行分析后得出其线性回归方程如下：

[0074] 菌体含量

[0075] ＝1.40-0.28A+0.030B-0.015C-0.034AB+0.16AC-0.096BC-0.50A2-0.17B2-0.072C2菌体有机锌量＝2606.76+563.89A-50.08B+1091.35A2+625.24B2

[0076] 5、响应面试验方差分析

[0077] 对上述响应面试验回归方程进行方差分析，结果见表6、表7。

[0078] 表6：菌体含量响应面方差分析

[0079]

[0080] 表7：菌体有机锌量响应面方差分析

[0081]

[0082]

[0083] 由表6和表7可知，两个响应面的回归模型整体呈极显著，菌体含量响应面的失拟项为0.2254，菌体有机锌量响应面的失拟项为0.8375，两个失拟项均大于0.05，无显著性差异，说明残差由随机误差造成，且回归方程可以代替真实点进行真实结果的分析。两个模型的p分别为0.0428、0.0313，均小于0.05说明总回归方程显著，方程能很好的拟合实验结果。

[0084] 在菌体含量响应面方差分析表中，A项显著，A2为极显著。一次项对试验影响大小排序为A＞B＞C。在菌体有机锌量响应面方差分析表中A项显著，A2表现为极显著。对试验影响大小排序为A＞B＞C。说明温度对试验影响较为显著。

[0085] 经design expert 7.0软件分析后，得出试验的最优条件为：

[0086] 枯草芽孢杆菌锌的制备参数为：葡萄糖4.50g/L，pH值6.57；培养温度29.50℃。当锌的添加量为33.9mg/kg时，最终获得的枯草芽孢杆菌锌的菌体干重为1.44193g/L，菌体有机锌量2511.55mg/kg。

[0087] 6、响应面试验的响应曲面和等高线图

[0088] 根据二次方程模型分别做出试验因素间交互作用的三维立体响应曲面和等高线图，考察在某个因素固定在中心值不变的情况下，其他两个因素的交互作用对菌体含量和菌体有机锌量的影响，见图1～图6(等高线图呈椭圆说明两因素的交互作用显著，圆形则表示交互作用不显著)。

[0089] 从图1的等高线图可以直观地看出，在葡萄糖浓度不变的条件下，培养温度与培养PH交互作用显著。从三维立体图中可看出，菌体含量在合适的离心转速和离心时间下，具有最大值，该最大值出现在较高的培养温度(28.26℃～30.01℃)范围内，较高的培养PH(6.31～6.81)范围内。

[0090] 从图2的等高线图可以看出，在培养PH不变条件下，培养温度与葡萄糖浓度交互作用显著，从三维立体图中可看出，当培养温度(27.82℃～29.91℃)范围内，葡萄糖浓度(0g/L～7.45g/L)范围内时，菌体含量会出现最大值。

[0091] 从图3的等高线图可以看出，培养温度不变的情况下，葡萄糖浓度与培养PH两者交互作用显著。由三维立体图可见，菌体含量存在最大值点，当葡萄糖浓度在2.24g/L至5.64g/L范围内、培养PH从6.46提高至6.64时，菌体含量增加。

[0092] 从图4的等高线图可以直观地看出，在葡萄糖浓度不变的条件下，培养温度与培养PH交互作用显著。从三维立体图中可看出，菌体有机锌量在合适的离心转速和离心时间下，具有最大值，该最大值出现在较高的培养温度(27.28℃～31.06℃)范围内，较高的培养PH(6.08～6.92)范围内。

[0093] 从图5的等高线图可以看出，在培养PH不变条件下，培养温度与葡萄糖浓度交互作用显著，从三维立体图中可看出，当培养温度(27.95℃～30.05℃)范围内，葡萄糖浓度(0g/L～5.01g/L)范围内时，菌体有机锌量会出现最大值。

[0094] 从图6的等高线图可以看出，培养温度不变的情况下，葡萄糖浓度与培养PH两者交互作用显著。由三维立体图可见，菌体含量存在最大值点，当葡萄糖浓度在0g/L至5.12g/L范围内、培养PH从6.20提高至6.78时，菌体含量增加。

[0095] 综上所述，当菌体含量增加时，菌体有机锌量会有所降低；反之，当菌体含量降低时，菌体有机锌量升高。最终确定的平衡点发酵条件为：温度为29.50℃、pH值6.57、葡萄糖浓度4.50g/L、无机锌添加量为33.9mg/kg；最终确定的平衡点产品含量指标为：菌体含量为1.44193mg/L，菌体有机锌量为2511.55mg/kg。

[0096] 实施例3：普通枯草芽孢杆菌在高锌环境下培养试验

[0097] 将普通枯草芽孢杆菌粉末，在普通培养基发酵到对数期，即为母液。将枯草芽芽孢杆菌母液以3％的比例添加到含有33.9mg/kg锌离子的培养基中，在30℃，150r/min的恒温震荡培养箱中培养48h后，结束发酵。将发酵液在6000r/min，4℃下离心获得湿菌体，并用去离子水冲洗2～3次，将湿菌体55℃烘干，获得枯草芽孢杆菌粉末。称取一定量的枯草芽孢杆菌粉末，测定菌体有机锌量。

[0098] 在此条件下菌体含量为1.2875mg/L，菌体有机锌量为1396.26mg/kg。比采用NZ56株的含量低10.71％，菌体有机锌量降低了44.41％。

[0099] 实施例4：枯草芽孢杆菌锌对先天性缺锌大鼠的干预试验

[0100] 试验分为两个阶段进行：

[0101] 第一阶段：怀孕大鼠缺锌模型建立。分为模型组和对照组，每组6个重复，每个重复6只，共72只大鼠；从怀孕10d开始试验，模型组大鼠孕期喂缺锌饲料(锌含量；13mg/kg)，对照组饲喂正常饲料(锌含量38mg/kg)，试验持续到哺乳期结束。

[0102] 造模结束后，模型组和对照组各抽取12只幼鼠，禁食12h，取血清及各器官，并检测生长指标和血液生化指标，即验证模型建立是否成功。

[0103] 第二阶段：枯草芽孢杆菌锌对缺锌幼龄大鼠后天干预试验

[0104] 选择第一阶段建模成功的24日断奶后的缺锌幼龄大鼠90只，随机分成5个试验组，分别为缺锌组、ZnSO4组、低剂量组、中剂量组、高剂量组。另选取18只正常幼龄大鼠作对照组。每组3个重复，每个重复6只，饲喂情况如表1所示。

[0105] 表8枯草芽孢杆菌锌对先天性缺锌大鼠的干预试验设计

[0106]

[0107] 注：4、5、6组灌胃所用的枯草芽孢杆菌锌(Zn含量为2511.55mg/kg)需要用去离子水稀释，灌胃量均为0.2mL/10g·d。

[0108] 试验结果发现，饲喂中剂量枯草芽孢杆菌锌的缺锌幼龄大鼠能够显著的达到补锌的功效，能够修复先天性缺锌大鼠造成的生理生化缺陷，并且能够促进肠道营养消化吸收，并提高成活率；表明，枯草芽孢杆菌锌具有一菌两效的功能。

[0109] 本发明将驯化的枯草芽孢杆菌在含有一定浓度硫酸锌的培养基中进行发酵后，获得枯草芽孢杆菌锌，所采用的驯化方法和发酵工艺，操作简单，安全性高，产品使用效果好。本发明采用的逐步提高硫酸锌浓度的方法驯化枯草芽孢杆菌，能够显著地提高枯草芽孢杆菌的耐受性，增加了菌体的含锌量。制备的枯草芽孢杆菌锌不仅拥有枯草芽孢杆菌的优点，而且将无机锌转化成菌体有机锌，大大提高了动物对微量金属元素的利用率，更好地发挥有机锌的生物学功能，可谓一菌两效；另外，有机锌利用率的提高大大降低了饲料中无机锌的使用量和排放量，减少了生态环境的污染。为此，此发明对开发新型动物微生态制剂以及微量元素“减量化”使用提供了重要技术支撑。