一种刺激诱导单个核细胞扩增为γδT细胞的组合物及其应用

摘要

本发明涉及一种刺激诱导单个核细胞扩增为γδT细胞的组合物，该组合物包括唑唻磷酸、anti‑human CD3Ab、anti‑human CD28Ab、IL‑15、IL‑21和IL‑2，本发明还提供了一种利用该组合物体外大量扩增γδT细胞的方法，具体为一种用外周血单个核细胞(PBMCs)在体外诱导大量扩增为γδT细胞的方法，本发明通过加入唑来膦酸诱导活化，加入anti‑human CD3Ab,anti‑human CD28Ab,IL‑15，IL‑21，和IL‑2进行诱导活化增殖，利用多种扩增因子组合共同刺激诱导扩增γδT细胞，获得的γδT细胞具有数量大、纯度高、细胞毒性强等特点，具有非常好的临床应用价值。

权利要求

1.一种刺激诱导单个核细胞扩增为γδT细胞的组合物，其特征在于，该组合物包括唑唻磷酸、抗人CD3 Ab、抗人CD28 Ab、IL-15、IL-21和IL-2；唑唻磷酸的浓度为1-100μM、抗人CD3 Ab的浓度为10～500ng/mL、抗人CD28 Ab的浓度为10～500ng/mL、IL-15的浓度为10～

200ng/mL、IL-21的浓度为10～200ng/mL、IL-2的浓度为500～3000U/mL。

2.根据权利要求1所述的刺激诱导单个核细胞扩增为γδT细胞的组合物，其特征在于：唑唻磷酸浓度为5μM、抗人CD3 Ab浓度为50ng/mL、抗人CD28Ab浓度为50ng/mL、IL-15浓度为

50ng/mL、IL-21浓度为50ng/mL、IL-2浓度为1000U/mL。

3.根据权利要求1所述的刺激诱导单个核细胞扩增为γδT细胞的组合物，其特征在于：所述单个核细胞来源于外周血、脐带血、骨髓或诱导性多能干细胞。

4.一种使用权利要求1-3任一项所述的组合物刺激诱导单个核细胞体外扩增为γδT细胞的方法，包括以下步骤：

1)单个核细胞的制备：分离单个核细胞，用体积百分比50％-100％的含10vt％FBS或自体血清的RMPI 1640和0％-50％X-vivo15的混合培养基重悬细胞，接种在培养瓶或培养袋中培养；

2)γδT细胞的诱导：加入含浓度为1-100μM的唑唻磷酸和500～3000U/mL IL-2的混合培养基体外刺激4天后加入含有10～500ng/mL抗人CD3 Ab、10～500ng/mL抗人CD28Ab、10～

200ng/mL IL-15、10～200ng/mL IL-21、和500～3000U/mL IL-2的混合培养基进行半量换液，置于37℃、5％CO2培养箱中培养；

3)每2～3天根据计数结果补液，14～21天收获γδT细胞。

5.根据权利要求4所述的组合物刺激诱导单个核细胞体外扩增为γδT细胞的方法，其特征在于：步骤2)中加入的唑唻磷酸终浓度为5μM、抗人CD3 Ab终浓度为50ng/mL、抗人CD28 Ab终浓度为50ng/mL、IL-15终浓度为50ng/mL、IL-21终浓度为50ng/mL和IL-2终浓度为

1000U/mL。

6.根据权利要求4所述的组合物刺激诱导单个核细胞体外扩增为γδT细胞的方法，其特征在于：所述的外周血单个核细胞(PBMCs)的浓度为1×106/mL。

7.根据权利要求4所述的组合物刺激诱导单个核细胞体外扩增为γδT细胞的方法，其特征在于：混合培养基中含10vt％FBS或自体血清的RMPI 1640的比例为50vt％，X-vivo15培养基的比例为50vt％。

说明书

一种刺激诱导单个核细胞扩增为γδT细胞的组合物及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种可刺激单个核细胞使其诱导扩增为γδT细胞的组合物，及使用该组合物对单个核细胞(PBMCs)在体外大量扩增γδT 细胞的方法。

背景技术

[0002] 肿瘤是目前对人类健康造成威胁的重大疾病之一，无论死亡率和发病率均居高位。肿瘤免疫疗法是继手术、放疗、化疗之后的第四种肿瘤治疗方法，也是目前最受关注和治疗效果最好的疗法。粘膜(表皮)组织作为物理屏障含有广泛的细胞类型包括非淋巴系和淋巴系免疫细胞，特别是T细胞。

[0003] 研究已经证明T细胞，特别是表达γδ受体的T细胞在维持粘膜组织平衡和阻止病原微生物感染和恶性癌变等表皮组织压力中发挥关键作用。γδT细胞主要在胸腺中发育成熟，通过V(D)J基因重组产生γδT细胞受体(TCR)。通过特异性的基因重排，从一个共同淋巴细胞前体(common lymphoidprecursor,CLP)分化为表达αβ受体和γδ受体的T细胞系。γδT细胞通过关联CD3复合物传导TCR信号，在健康成年人的外周血中，γδT细胞只占循环T细胞的1-10％；αβT 细胞占循环T细胞的90％以上，并且通过关联CD3复合物直接传导胞内信号。与αβTCR不同，γδTCR可以直接结合抗原且不依赖MHC 分子介导的抗原呈递，因此在γδT细胞表面不表达CD4和CD8分子。广泛的研究表明，根据δ链的表达情况，γδT细胞可以分为三大类，表达Vδ1链的γδT细胞主要分布在粘膜表面的内皮层，很少一部分分布在外周血中。Vδ1型γδT细胞在抵抗损伤、感染和恶性转化表皮完整性中发挥重要作用。γδT细胞另一类主要的亚群是表达Vδ2链的γδT细胞，而且Vδ2链几乎只与Vγ9链配对，是健康成年人中主要的循环γδT细胞，可以达到外周血循环γδT细胞的50-90％。有趣的是，一旦被激活，Vδ2T细胞获得专职抗原呈递细胞(APCs)的特性,包括表达共刺激分子、粘附分子、和抗原呈递分子(例如，CD80, CD86,CD11b,CD18,CD54和MHCⅡ)。第三类γδT细胞亚群表达Vδ3 链,约占循环T细胞的0.2％，包括CD4+,CD8+和CD4-CD8-亚群。 Vδ3γδT细胞不稳定表达CD56、CD161、HLA-DR和NKG2D。

[0004] 与αβT细胞不同，γδT细胞不易受抗原加工和呈递缺失的影响，因此γδT细胞具有很高的临床肿瘤免疫治疗潜在应用价值。γδT细胞在肿瘤免疫监视和抗肿瘤免疫反应中发挥重要作用。Girardi等人的研究表明表皮定位的γδT细胞在阻止小鼠表皮形成中发挥重要作用，γδ T细胞缺失的小鼠易得皮肤癌(Science.2001；294(5542):605-609.)。 Liu等人的研究表明，与对照组小鼠相比，通过尾静脉注射同基因型的γδT，可以显著降低前列腺肿瘤荷瘤小鼠肿瘤的发病率并显著延长荷瘤小鼠的生存期(J Immunol.2008；180(9):6044-6053.)。Zhao等人的研究表明，在无性细胞瘤和精原细胞瘤中，肿瘤组织相关的肉芽肿性炎症中积累大量的γδT浸润性T淋巴细胞，这些浸润的γδT细胞具有杀伤自体肿瘤细胞的活性，可以通过识别Vδ的单克隆抗体阻断γδT 细胞的杀伤活性；γδT细胞分泌大量的促炎性因子，例如IFN-γ和 TNF-α(Immunol Invest.1995；24(4):607-618.)。Todaro等人的研究表明，γδT细胞可以杀死结直肠癌肿瘤干细胞，肿瘤干细胞在肿瘤起始、生长、转移、抵抗传统肿瘤治疗手段从而复发中发挥重要作用(J Immunol.2009；182(11):7287-
7296.)。目前已经从多种肿瘤(包括结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌和肾癌等)分离的浸润性T淋巴细胞(TILs)鉴定出γδT细胞(J Immunol.2005；174(3):1338-1347.； J Immunol.2005；175(8):5481-5488.；Mol Immunol.2007； 44(4):302-310.)。

[0005] 由于γδT细胞在外周血中的含量极低，大大限制了γδT细胞作为过继免疫细胞在临床上的应用。目前从外周血单个核细胞扩增γδT细胞，扩增倍数低，细胞纯度不高。因此，发明一种实用高效、成本低、技术简单、可大量扩增高纯度、高细胞毒活性的γδT细胞成为目前迫切需要解决的问题。

发明内容

[0006] 针对上述存在的问题，本发明提出了一种刺激诱导单个核细胞扩增为γδT细胞的组合物及其应用，通过加入唑来膦酸诱导活化，利用多种扩增因子组合共同刺激诱导扩增γδT细胞，获得的γδT细胞具有数量大、纯度高、细胞毒性强等特点，具有非常好的临床应用价值。

[0007] 为了实现上述的目的，本发明采用以下的技术方案：

[0008] 一种刺激诱导单个核细胞扩增为γδT细胞的组合物，该组合物包括唑来膦酸、anti-human CD3Ab、anti-human CD28Ab、IL-15、IL-21 和IL-2。

[0009] 优选的，唑来膦酸的浓度为1-100μM、anti-human CD3Ab的浓度为10～500ng/mL、anti-human CD28Ab的浓度为10～500ng/mL、 IL-15的浓度为10～200ng/mL、IL-21的浓度为10～200ng/mL、IL-2 的浓度为500～3000U/mL。

[0010] 优选的，唑来膦酸浓度为5μM、anti-human CD3Ab浓度为50 ng/mL、anti-human CD28Ab浓度为50ng/mL、IL-15浓度为50ng/mL、 IL-21浓度为50ng/mL、IL-2浓度为1000U/mL。

[0011] 优选的，单个核细胞来源于外周血、脐带血、骨髓或诱导性多能干细胞(iPSC)。

[0012] 优选的，一种使用上述的组合物刺激诱导单个核细胞体外扩增为γδT细胞的方法，包括以下步骤：

[0013] 1)单个核细胞的制备：分离单个核细胞，用含体积百分比 50％-100％的含10vt％FBS或自体血清的RMPI 1640和0％-50％X-vivo15的混合培养基重悬细胞，接种在培养瓶或培养袋中培养；

[0014] 2)γδT细胞的诱导：加入含浓度为1-100μM的唑来膦酸和 500～3000U/mL IL-2的混合培养基体外刺激4天后加入含有10～500 ng/mL anti-human CD3Ab、10～500ng/mL anti-human CD28Ab、 10～200ng/mL IL-15、10～200ng/mL IL-21和500～3000U/mL IL-2的混合培养基进行半量换液，置于37℃、5％CO2培养箱中培养；

[0015] 3)每2～3天根据计数结果补液，14～21天收获γδT细胞。

[0016] 优选的，步骤2)中加入的唑来膦酸终浓度为5μM、anti-human CD3Ab终浓度为50ng/mL、anti-human CD28Ab终浓度为50ng/mL、 IL-15终浓度为50ng/mL、IL-21终浓度为
50ng/mL、和IL-2终浓度为1000U/mL。

[0017] 优选的，在一个实施案例中所述的外周血单个核细胞(PBMCs) 的浓度为1×106/mL。

[0018] 在一个实施方案中也可以使用其他磷酸抗原代替唑来膦酸，包括异戊烯焦磷酸酯(IPP),(E)-4-羟基-3-甲基-丁-2-烯基焦磷酸酯 (HMB-PP),焦磷酸乙酯(EPP)，焦磷酸法呢酯(FPP),二甲基烯丙基磷酸酯(DMAP),二甲基烯丙基焦磷酸酯(DMAPP),乙基 -腺苷三磷酸酯(EPPPA)，牦牛儿焦磷酸酯(GPP),牦牛儿牦牛儿焦磷酸酯(GGPP),异戊烯-腺苷焦磷酸酯(IPPPA),磷酸一乙酯(MEP), 焦磷酸一乙酯(MEPP)等含有氮的双磷酸酯。

[0019] 优选的，在一个实施案例中混合培养基中含10vt％FBS或自体血清的RMPI 1640的比例为50vt％，X-vivo15培养基的比例为50vt％。

[0020] 本发明所用原料和试剂除有特殊说明外，均市售可得。

[0021] 由于采用上述的技术方案，本发明的有益效果是：本发明提供了一种由细胞因子、唑来膦酸和抗体组成的组合物，以及利用该组合物刺激γδT细胞体外大量扩增的方法，该方法可以获得大量的、高增殖能力、高纯度和高细胞毒活性的γδT细胞，可用于肿瘤的细胞免疫治疗。

附图说明

[0022] 图1是细胞因子和唑来膦酸联合诱导的常规培养方法及细胞因子、唑来膦酸和抗体联合改进型培养方法扩增培养的γδT细胞的流式分析图；

[0023] 图2是改进型培养方法扩增培养细胞生长曲线；

[0024] 图3是改进型培养方法扩增培养第7、14和21天细胞的扩增倍数；

[0025] 图4是改进型培养方法扩增培养第0天和第21天γδT细胞的流式分析图；

[0026] 图5是实时无标记细胞功能分析仪检测曲线；

[0027] 图6是改进型培养方法扩增培养的γδT细胞与乳腺癌细胞系 SKBR-3细胞共孵育4小时的细胞指数和不同效靶比γδT细胞对 SKBR-3的杀伤百分比。

具体实施方式

[0028] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0029] 本发明实施例中所述的“混合培养基”均指根据现有方法配制的 50vt％含10vt％自体血清的RMPI1640+50vt％X-vivo15的混合培养基。

[0030] 实施例1：γδT细胞的诱导

[0031] 从外周血中分离单个核细胞(PBMCs)并扩增γδT细胞：

[0032] ①使用前30分钟开启生物安全柜；

[0033] ②使用前从冰箱中取出D-PBS，室温放置30分钟；

[0034] ③将30ml外周血液样品(肝素抗凝)转移到两个无菌50ml 离心管，每管15ml，然后向每管加入22.5ml无菌D-PBS，反复颠倒离心管，充分混匀；

[0035] ④另取两个50ml无菌离心管，分别加入15ml Ficoll-Paque Plus 溶液，然后分别缓慢的加入24ml步骤3中稀释后的血液(由步骤3 中两个无菌管中吸取)，形成分层，20℃，400×g,离心30分钟；

[0036] ⑤将步骤4中的两个50ml离心管放入生物安全柜，然后使用 10ml吸管吸掉15ml血清层，装入一个新的无菌50ml离心管中， 56℃灭活30分钟待用(用于配制混合培养基)；

[0037] ⑥吸取每一个50ml离心管中的白细胞层(PBMCs)，转入一个新的50ml无菌离心管；

[0038] ⑦向步骤6装有PBMCs细胞悬液的离心管中加入其3倍体积的无菌PBS，并用无菌移液管混匀，20℃，400×g，离心10分钟；

[0039] ⑧弃上清，加入50ml无菌PBS，缓慢重悬PBMC；

[0040] ⑨20℃，400×g，离心10分钟；

[0041] ⑩加入5ml 50vt％含步骤5自体血清的RMPI1640+50vt％ X-vivo15的混合培养基，混匀，取10μl用于计数；

[0042] 由步骤10中取一半量的外周血单个核细胞(PBMCs),加入一定体积含有唑来膦酸的混合培养基调整细胞浓度至1×106cells/ml；另一半量的PBMCs加入含有唑来膦酸的RPMI 1640培养基，调整细胞浓度至1×106cells/ml；

[0043] 使用T-175培养瓶培养细胞；

[0044] 将细胞培养瓶放置于5％CO2、37℃细胞培养箱中进行细胞培养。

[0045] 实施例2：培养基换液

[0046] ①将混合培养基放入37℃水浴锅中温浴，或放在室温平衡1小时至室温；

[0047] ②将细胞培养瓶拿入生物安全柜中，重悬细胞，然后用25ml 移液器吹匀，取10μl细胞悬液进行计数；

[0048] ③在第4天时，将所有细胞转入50ml无菌离心管中，并更换扩增培养基，具体更换操作如下：

[0049] ④根据细胞总量,调整最终细胞浓度为1×106cells/ml。其中，改进方法为：取一半量新的含有改进方法扩增所需扩增因子 (anti-human CD3Ab,anti-human CD28Ab,IL-15，IL-21，和IL-2) 组合物的混合培养基加入空的细胞培养瓶中；常规培养方法为：取一半量新的含有常规培养方法所需扩增因子(IL-15，IL-21，和IL-2) 组合物的RPMI 1640培养基加入空的细胞培养瓶中；

[0050] ⑤取步骤3的细胞，20℃，400×g,离心5分钟；

[0051] ⑥将步骤5离心后的细胞培养基上清转移到50ml无菌离心管中，取一半量细胞培养基上清重悬细胞，分别将重悬后的细胞放入步骤4的细胞培养瓶中继续培养；

[0052] ⑦将细胞培养瓶放入细胞培养箱，5％CO2、37℃继续培养；

[0053] ⑧在第6、8、10、12、14、16、18和20天更换扩增培养基，具体操作如下：

[0054] ⑨将混合培养基或RPMI 1640培养基放入37℃水浴锅中温浴，或放在室温平衡1小时至室温；

[0055] ⑩将细胞培养瓶拿入生物安全柜中，重悬细胞，然后利用25ml 移液器吹匀，取10μl细胞悬液进行计数；

[0056] 根据细胞总量,取适量含有改进方法或常规方法扩增培养所需扩增因子的混合培养基或RMPI1640加入细胞培养瓶中，调整最终细胞浓度为1×106cells/ml；

[0057] 将细胞放入细胞培养箱，5％CO2、37℃继续培养。

[0058] 通过流式细胞仪检测常规扩增方法和改进型扩增方法培养出的γδT细胞的表型，CD3阳性γδTCR阳性的细胞群为γδT细胞，如图1 中Q2区域所示。图1A是采用常规方法培养14天的细胞表型检测结果，如图所示γδT细胞纯度为35.5％，图1B是采用改进型方法培养
14天的细胞表型检测结果，如图所示，γδT细胞纯度为95.5％，说明改进型培养方法可以扩增培养出更高纯度的γδT细胞。

[0059] 在培养第0、4、6、7、8、10、12、14、16、18、20和21天统计接种细胞数和扩增培养的细胞数，制作细胞生长曲线，如图2所示，接种三千两百万细胞，扩增21天，细胞总数可达约500亿，完全满足临床应用需要。统计第0天、第7天、第14天和第21天，计算γδT 细胞扩增倍数，可见采用改进型扩增方法可以获得大量的γδT细胞，结果参见图3。

[0060] 实施例3：改进型培养方法扩增培养的γδT细胞表型检测

[0061] ①取培养第21天的细胞，放入2个1.5mL的EP管中，每管1 ×106个细胞，400×g离心5分钟，去上清；

[0062] ②分别加入1mLPBS洗一遍，400×g离心5分钟，去上清；

[0063] ③加入100μL的PBS，然后分别加入对照抗体Mouse IgG1-PerCP,Mouse IgG1-FITC(图4中Ctrl)和检测抗体mouse anti-human CD3-PerCP,anti-humanγδTCR-FITC荧光抗体(图4 中CD3/γδ-TCR)，4℃放置30分钟；

[0064] ④PBS洗两遍，弃上清，最终使用200μLPBS重悬细胞。

[0065] 使用AECANovocyte流式细胞仪对培养得到的γδT细胞进行检测，如图4所示，培养21天的细胞，γδT细胞的纯度可达97.8％。

[0066] 实施例4：改进型培养方法扩增得到的γδT细胞杀伤活性检测

[0067] 使用艾森生物的实时无标记细胞功能分析仪检测不同效靶比γδ T细胞对乳腺癌细胞系SKBR-3细胞杀伤活性。

[0068] ①消化SKBR-3细胞，配制细胞悬液浓度至2.6667×105/mL；

[0069] ②铺细胞于实时无标记细胞功能分析仪E-Plate 8板上，每孔加入300μL，37℃培养18-24小时；

[0070] ③将100μL的γδT细胞悬液或等体积的培养基(空白对照)以不同的效靶比5:1；10:1；20:1加入培养板内；

[0071] ④将E-Plate 8检测板置于实时无标记细胞功能分析仪检测台上实时监测，观察γδT细胞对SKBR-3细胞的影响(图5)。

[0072] 分析实验结果，在加入γδT细胞的时间点，均一化细胞指数值，获得均一化细胞指数(NCI),统计加入γδT细胞4小时后的NCI值，计算不同比例(20:1,10:1,5:1和0:1)γδT细胞对乳腺癌细胞系 SKBR-3的杀伤活性，如图6所示，γδT细胞的杀伤活性随γδT细胞比例增加而增加。

[0073] 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。