一种注射用血栓通质量波动的检测方法

摘要

本发明公开了一种注射用血栓通质量波动的检测方法，其包括如下步骤：(1)制备凝血酶溶液；(2)制备注射用血栓通样品溶液，注射用血栓通样品至少为15批次；(3)将步骤(2)制得的注射用血栓通样品溶液加至96孔板中，后加入0.5％的纤维蛋白原的三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液，混合均匀，再加入步骤(1)制得的凝血酶溶液，振摇均匀后使用酶标仪对体系吸光度进行动态监测；(4)数据处理：反应终点时，采用均值‑极差控制图对注射用血栓通样品质量波动进行判定。本发明方法具有灵敏度高、特异性强、重现性好、简便快速的技术优势，从而为注射用血栓通临床不良反应的早期预警提供技术支持。

权利要求

1.一种注射用血栓通质量波动的检测方法，其特征在于，其包括如下步骤：（1）制备浓度为1-5U/mL的凝血酶溶液；

（2）制备浓度为50-200mg/mL的注射用血栓通样品溶液，注射用血栓通样品为15-17批次；

（3）将步骤（2）制得的注射用血栓通样品溶液加至96孔板中，后加入0.5%的纤维蛋白原的三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液100-200μL，混合均匀，再加入步骤（1）制得的凝血酶溶液，振摇均匀后使用酶标仪对体系吸光度进行动态监测；

（4）数据处理：对原始数据进行处理，反应终点时，采用均值-极差控制图对注射用血栓通样品质量波动进行判定：①若样品溶液的吸光度值在控制限范围内，则所述注射用血栓通样品的质量波动正常；

②若样品溶液的吸光度值不在控制限范围内，则所述注射用血栓通样品的质量波动异常。

2.根据权利要求1所述的注射用血栓通质量波动的检测方法，其特征在于，步骤（1）中凝血酶溶液的具体制备步骤为：将凝血酶溶解于60%甘油中，分装，-20°C保存于EP管中；每次实验前，用生理盐水将其浓度稀释为1-5U/mL。

3.根据权利要求1所述的注射用血栓通质量波动的检测方法，其特征在于，步骤（2）中注射用血栓通样品溶液的具体制备步骤为：将生理盐水加入盛有注射用血栓通样品的西林瓶内，制得浓度50-200mg/mL的样品溶液。

4.根据权利要求1所述的注射用血栓通质量波动的检测方法，其特征在于，步骤（3）中，每个批次的样品溶液平行3-4个复孔，设生理盐水组为阴性对照组，反应体系保持37°C恒温。

5.根据权利要求1所述的注射用血栓通质量波动的检测方法，其特征在于，步骤（3）中，酶标仪设定的波长为600-700nm。

6.根据权利要求1所述的注射用血栓通质量波动的检测方法，其特征在于，步骤（4）中，通过Origin Pro 9.0和IBM SPSS Statistics 20.0统计分析软件对原始数据进行处理。

7.根据权利要求1所述的注射用血栓通质量波动的检测方法，其特征在于，步骤（4）中，所述均值-极差控制图由上控制限、下控制限和中心线组成。

说明书

一种注射用血栓通质量波动的检测方法

技术领域

[0001] 本发明涉及中药质量控制领域，具体涉及一种注射用血栓通质量波动的检测方法。

背景技术

[0002] 中药注射剂是中医药产业现代化发展的重要方向之一，但因产品质量波动问题引发的临床不良反应发生，已严重阻碍中药注射剂产业的健康发展。目前以注射剂制剂通则和化学分析为主的质量控制手段，对于中药注射剂成分复杂的体系来说，很难有效做到全面的质量波动监测。因此，建立中药注射剂质量波动的早期快速预警评价的有效方法，减少中药注射剂不良反应的发生，保证临床用药的安全，已经成为亟待解决的燃眉问题。

[0003] 注射用血栓通(冻干)在活血化瘀、扩张血管、改善血液循环等方面功效明显，广泛用于治疗心脑血管类疾病如脑血栓后遗症、视网膜中央静脉阻塞等。然而在临床取得良好疗效的同时，有关不良反应报道也日渐增多。其中，皮肤及其附件损害最为常见，主要症状为皮疹、瘙痒、皮肤潮红。皮疹包括因血管扩张而发红的红斑(猩红热、麻疹、药疹等)和发生皮下出血的紫斑(淤点、紫癜)，均涉及血液系统。

[0004] 由于注射用血栓通(冻干)主要药效成分三七总皂苷具有抑制血小板聚集、抗凝血、抗血栓等作用，不同批次注射用血栓通(冻干)质量波动可能导致其活血活性偏高，从而引起红斑、紫斑等微小血管出血等不良反应发生。目前抗凝血酶活性常被用来反映药物的活血功效，检测方法包括抗凝血酶滴定法、生色底物法、抗凝法等，但存在准确度低、检测时间长、普适性差等诸多弊端，难以做到全面、客观、准确的质量评价与控制，也就难以避免或减少因药物本身质量问题而引发临床不良反应的发生。

发明内容

[0005] 针对现状，本发明的目的在于提供一种能够高效、灵敏、快速地检测注射用血栓通(冻干)质量波动的方法。

[0006] 为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：

[0007] 一种注射用血栓通质量波动的检测方法，其包括如下步骤：

[0008] (1)制备浓度为1-5U/mL的凝血酶溶液；

[0009] (2)制备浓度为50-200mg/mL的注射用血栓通样品溶液，注射用血栓通样品至少为15批次；

[0010] (3)将步骤(2)制得的注射用血栓通样品溶液加至96孔板中，后加入0.5％的纤维蛋白原的三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液100-200μL，混合均匀，再加入步骤(1)制得的凝血酶溶液，振摇均匀后使用酶标仪对体系吸光度进行动态监测；

[0011] (4)数据处理：对原始数据进行处理，反应终点时，采用均值-极差控制图对注射用血栓通样品质量波动进行判定：

[0012] ①若样品溶液的吸光度值在控制限范围内，则所述注射用血栓通样品的质量波动正常；

[0013] ②若样品溶液的吸光度值不在控制限范围内，则所述注射用血栓通样品的质量波动异常。

[0014] 本发明方法是基于在凝血酶的作用下，凝血酶水解纤维蛋白原，裂解出纤维蛋白肽，并生成纤维蛋白单体，纤维蛋白原转变为纤维蛋白的过程(见图1)，伴随着吸光度的改变，当纤维蛋白生成时其光穿透量减少，吸光度增加。在体外实验模拟凝血反应，记录反应体系吸光度的动态变化过程，以终点吸光度值来评价凝血酶的活性。同时，在反应体系中加入注射用血栓通样品，以考察其抗凝血酶活性，从生物活性角度评价注射用血栓通样品的质量波动。

[0015] 本发明凝血酶溶液、注射用血栓通样品溶液的浓度与0.5％的纤维蛋白原的三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液为最优配比，从生物活性角度检测注射用血栓通质量波动性，客观评估注射用血栓通的临床安全性与有效性，突破常规认为生物活性(活血化瘀活性)越强越好的惯性评价方式。

[0016] 进一步的，步骤(1)中凝血酶溶液的具体制备步骤为：将凝血酶溶解于60％甘油中，分装，-20℃保存于EP管中；每次实验前，用生理盐水将其浓度稀释为1-5U/mL。

[0017] 进一步的，步骤(2)中注射用血栓通样品溶液的具体制备步骤为：将生理盐水加入盛有注射用血栓通样品的西林瓶内，制得浓度50-200mg/mL的样品溶液。

[0018] 进一步的，步骤(3)中，每个批次的样品溶液平行3-4个复孔，设生理盐水组为阴性对照组，反应体系保持37℃恒温。

[0019] 进一步的，步骤(3)中，酶标仪设定的波长为600-700nm。

[0020] 进一步的，步骤(4)中，通过Origin Pro 9.0和IBM SPSS Statistics 20.0统计分析软件对原始数据进行处理，所采取的均值-极差控制图(X-R图)适用于控制对象为计量值(如吸光度)、小样本量的判定。质量控制图依据“3σ”原则(σ即为子组标准差)，在正常状态下，所有数据的质量特性呈现正态分布，质量参数落在±3σ以外的概率为0.3％，即为小概率事件，倘若发生则表明状态不稳定。所述均值-极差控制图由上控制限、下控制限和中心线组成。从生物活性角度分析，如吸光度值低于控制下限的样品溶液，则提示其抗凝血酶活性高于正常范围，存在导致微小血管渗血等发生的潜在风险；如吸光度值高于控制上限的样品溶液，则提示其抗凝血酶活性低于正常范围，存在因生物活性过低而影响临床疗效稳定发挥的潜在风险。

[0021] 本发明是依据多批次样品检测结果，建立基于生物活性监测的注射用血栓通(冻干)质量一致性的评判方法及标准，弥补现行的以注射剂制剂通则和化学分析为主的质量评价方法，以期提升注射用血栓通(冻干)质量波动早期预警能力，减少其临床不良反应的发生。

[0022] 本发明的有益效果是：本发明以注射用血栓通为研究对象，采用酶标仪检测其与凝血酶反应后吸光度值的动态变化，通过均值-极差控制图评价其质量波动范围，以体现样品内在抗凝血活性的差异，从而实现对注射用血栓通质量波动的检测，具有灵敏度高、特异性强、重现性好、简便快速的技术优势，从而为注射用血栓通临床不良反应的早期预警提供技术支持。本发明方法无需对待测样品进行处理，避免了样品信息的丢失与偏离、背景干扰，成本低。

附图说明

[0023] 图1是本发明凝血反应中纤维蛋白原转变为纤维蛋白的原理图；

[0024] 图2是本发明实施例1中各批次注射用血栓通样品吸光度值的均值-极差控制图；

[0025] 图3是本发明实施例2中各批次注射用血栓通样品吸光度值的均值-极差控制图；

[0026] 图4是本发明实施例3中各批次注射用血栓通样品吸光度值的均值-极差控制图。

具体实施方式

[0027] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0028] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。酶标仪采用的是瑞士Tecan Spark 10M多功能酶标仪。

[0029] 实施例1

[0030] 一种注射用血栓通质量波动的检测方法，其包括如下步骤：

[0031] (1)将凝血酶溶解于60％甘油中，分装，-20℃保存于EP管中；实验时，用生理盐水将其浓度稀释为1U/mL；

[0032] (2)将生理盐水加入盛有注射用血栓通样品的西林瓶内，制得浓度100mg/mL的样品溶液，检测样品为从临床真实使用环节收集的17批注射用血栓通(冻干)；

[0033] (3)取注射用血栓通(冻干)样品溶液50μL加至96孔板中，后加入0.5％纤维蛋白原的三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液100μL，置于微孔板恒温振荡器中混合均匀，加入1U/mL凝血酶溶液50μL，振摇30s，振幅1mm，频率1440rpm；完毕后，酶标仪在660nm波长下对体系吸光度进行动态监测，直至反应结束，每个样品平行3个复孔(1-17号依次编号)，并设阴性对照组(生理盐水组，18号)；反应体系保持37℃恒温；

[0034] (4)数据处理：将酶标仪得到的各批次样品的原始数据信息，通过Origin Pro 9.0、IBM SPSS Statistics 20.0统计分析软件进行处理，采用均值-极差控制图(X-R图)对样品溶液质量波动进行分析，结果如图2所示；

[0035] 由图2可知，各批次样品吸光度的平均值为0.7710，用中心线(CL)以实线表示；控制上限(UCL)、控制下限(LCL)分别为0.7999、0.7419，用虚线表示。结果表明大部分样品吸光度值均在控制限内，但1、2号样品吸光度值高于控制上限，5、11、17号样品吸光度值低于控制下限，认定为质量异常波动。从生物活性角度分析，5、11、17号样品吸光度值低于控制下限，提示其抗凝血酶活性高于正常范围，存在导致微小血管渗血等发生的潜在风险；1、2号样品吸光度值高于控制上限，提示其抗凝血酶活性低于正常范围，存在因生物活性过低而影响临床疗效稳定发挥的潜在风险。上述检测结果与17批次注射用血栓通临床真实世界不良反应发生情况相符，提示本发明所建立方法可作为注射用血栓通临床不临反应早期预警方法之一。

[0036] 实施例2

[0037] 一种注射用血栓通质量波动的检测方法，其包括如下步骤：

[0038] (1)将凝血酶溶解于60％甘油中，分装，-20℃保存于EP管中，实验时，用生理盐水将其浓度稀释为2U/mL；

[0039] (2)将生理盐水加入盛有注射用血栓通样品的西林瓶内，制得浓度150mg/mL的样品溶液，检测样品为从临床真实使用环节收集的17批注射用血栓通(冻干)；

[0040] (3)取注射用血栓通(冻干)样品溶液60μL加至96孔板中，后加入0.5％纤维蛋白原的三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液150μL，置于微孔板恒温振荡器中混合均匀，加入1U/mL凝血酶溶液60μL，振摇30s，振幅1mm，频率1440rpm；完毕后，酶标仪在600nm波长下对体系吸光度进行动态监测，直至反应结束，每个样品平行3个复孔(1-17号依次编号)，并设阴性对照组(生理盐水组，18号)，反应体系保持37℃恒温；

[0041] (4)数据处理：将酶标仪得到的各批次样品的原始数据信息，通过Origin Pro 9.0、IBM SPSS Statistics 20.0统计分析软件进行处理，采用均值-极差控制图(X-R图)对样品溶液质量波动进行分析，结果如图3所示。

[0042] 由图3可知，各批次样品吸光度的平均值为0.7678，用中心线(CL)以实线表示；控制上限(UCL)、控制下限(LCL)分别为0.7945、0.7448，用虚线表示。结果表明大部分样品吸光度值均在控制限内，但1、2号样品吸光度值高于控制上限，5、11、17号样品吸光度值低于控制下限，可认为质量异常波动。从生物活性角度分析，5、11、17号样品吸光度值低于控制下限，提示其抗凝血酶活性高于正常范围，存在导致微小血管渗血等发生的潜在风险；1、2号样品吸光度值高于控制上限，提示其抗凝血酶活性低于正常范围，存在因生物活性过低而影响临床疗效稳定发挥的潜在风险。上述检测结果与17批次注射用血栓通临床真实世界不良反应发生情况相符，提示本发明所建立方法可作为注射用血栓通临床不临反应早期预警方法之一。

[0043] 实施例3

[0044] 一种注射用血栓通质量波动的检测方法，其包括如下步骤：

[0045] (1)将凝血酶溶解于60％甘油中，分装，-20℃保存于EP管中，实验时，用生理盐水将其浓度稀释为5U/mL；

[0046] (2)将生理盐水加入盛有注射用血栓通样品的西林瓶内，制得浓度200mg/mL的样品溶液，检测样品为从临床真实使用环节收集的17批注射用血栓通(冻干)；

[0047] (3)取注射用血栓通(冻干)样品溶液80μL加至96孔板中，后加入0.5％纤维蛋白原的三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液200μL，置于微孔板恒温振荡器中混合均匀，加入1U/mL凝血酶溶液80μL，振摇30s，振幅1mm，频率1440rpm，完毕后，酶标仪在700nm波长下对体系吸光度进行动态监测，直至反应结束，每个样品平行4个复孔(1-17号依次编号)，并设阴性对照组(生理盐水组，18号)，反应体系保持37℃恒温；

[0048] (4)数据处理：将酶标仪得到的各批次样品的原始数据信息，通过Origin Pro 9.0、IBM SPSS Statistics 20.0统计分析软件进行处理，采用均值-极差控制图(X-R图)对样品溶液质量波动进行分析，结果如图4所示。

[0049] 由图4可知，各批次样品吸光度的平均值为0.7702，用中心线(CL)以实线表示；控制上限(UCL)、控制下限(LCL)分别为0.8001、0.7428，用虚线表示。结果表明大部分样品吸光度值均在控制限内，但1、2号样品吸光度值高于控制上限，5、11、17号样品吸光度值低于控制下限，可认为质量异常波动。从生物活性角度分析，5、11、17号样品吸光度值低于控制下限，提示其抗凝血酶活性高于正常范围，存在导致微小血管渗血等发生的潜在风险；1、2号样品吸光度值高于控制上限，提示其抗凝血酶活性低于正常范围，存在因生物活性过低而影响临床疗效稳定发挥的潜在风险。上述检测结果与17批次注射用血栓通临床真实世界不良反应发生情况相符，提示本发明所建立方法可作为注射用血栓通临床不临反应早期预警方法之一。

[0050] 上述技术方案仅体现了本发明技术方案的优选技术方案，本技术领域的技术人员对其中某些部分所可能做出的一些变动均体现了本发明的原理，属于本发明的保护范围之内。