一种基于细胞层面进行全蛋白质组学分析的方法

摘要

本发明属蛋白质分析领域，涉及基于细胞层面的全蛋白质组学分析的方法，本发明中，收集的细胞直接通过吸胀的方式进入真空干燥后的聚丙烯酰胺凝胶粒中，然后直接进行胶内酶解获得质谱分析所需的肽段；本方法中不需要单独的细胞裂解和蛋白提取步骤，使四个基本步骤减少为两步，在不提高酶量的情况下，实验耗时明显缩短；本方法与传统方法比较，在细胞蛋白质组鉴定，尤其是高分子量蛋白的鉴定上存在明显优势；本发明方法步骤简单、操作方便、快速高效，可以实现同时进行细胞裂解和蛋白酶解，为高灵敏质谱分析提供样品保证；由于摆脱了对去垢剂的依赖，适用于后续诸多翻译后修饰的研究。

权利要求

1.一种直接在细胞层面进行蛋白酶解的细胞全蛋白质组学分析方法，其特征在于，当细胞溶液被加入到含真空干燥的凝胶颗粒的离心管中，溶液中的细胞通过吸胀的方式进入凝胶颗粒中，嵌入在凝胶颗粒中的细胞蛋白直接被胰酶酶解成肽段，而后送入质谱进行检测；其包括步骤：（1）制备聚丙烯酰胺凝胶；

（2）收集细胞样品，用PBS缓冲液洗2次；

（3）将细胞溶液与真空干燥的凝胶颗粒混合，冰浴静置；

（4）对样品进行冷热交替处理2次后，用50%乙腈和100%乙腈各洗2次；

（5）对样品进行DTT还原和IAA烷基化处理；

（6）对样品进行胰酶酶解；

（7）提取酶解肽段用于后续LC-MS/MS分析。

2.按权利要求1所述的方法，其特征是，（3）中所述细胞溶液所用的缓冲液为：含蛋白酶抑制剂的25 mM的碳酸氢铵水溶液。

3.按权利要求1所述的方法，其特征是，（1）中的聚丙烯酰胺凝胶体积为50微升，所需的试剂包括：30微升25 mM的碳酸氢铵溶液，16.7微升含30%丙烯酰胺/双丙烯酰胺的水溶液，其中丙烯酰胺与双丙烯酰胺的质量比为29:1，2.5微升浓度为1%的过硫酸铵，0.05微升四甲基乙二胺。

4.按权利要求1所述的方法，其特征是，（1）中所制备凝胶切割至大约1 mm3大小的均匀颗粒，然后进行真空干燥。

5.按权利要求1所述的方法，其特征是，（3）中冰浴静置时间为5 10分钟。

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说明书

一种基于细胞层面进行全蛋白质组学分析的方法

技术领域

[0001] 本发明属蛋白质分析领域，涉及细胞全蛋白质组分析的方法，具体涉及一种基于细胞层面进行全蛋白质组学分析的方法，本方法还涉及直接在细胞层面进行酶解用于后续质谱分析的蛋白质组学样品的制备方法。

背景技术

[0002] 现有技术公开了细胞是生物体结构和功能的基本单元，包括肿瘤在内的若干疾病均与细胞的功能失调相关，因此，永生细胞系被广泛用于人类疾病的生物学研究，包括与疾病有关的蛋白质组学研究。近年来，基于生物质谱的蛋白质组学技术发展迅猛，然而，作为该项技术的关键上游环节，目前的涉及的样品制备技术尚有需要改进的地方，传统的蛋白质组学样品制备流程通常包括以下步骤： 1）细胞的收集与裂解；2）蛋白的提取和纯化；3）蛋白质酶解；4）肽段除盐；实践显示，该经典的样品制备流程过于冗长，极大地制约了质谱技术的推广，为了克服所述缺陷，有研究提出新的同步碎裂-酶解方案，其中，依靠较高的酶-底物比，较成功实现了快速的磷酸化蛋白质样品制备，但该方法只能用于磷酸化蛋白质组学的研究，若是用于细胞全蛋白质组学研究，则需要额外的步骤用于去除去垢剂以及其它的细胞内生物大分子。

[0003] 基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供一种步骤简单、操作方便、快速高效、不依赖去垢剂的细胞全蛋白质组学分析新方法。具体涉及一种直接在细胞层面进行蛋白酶解的细胞全蛋白质组学分析方法。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，提供一种步骤简单、操作方便、快速高效、不依赖去垢剂的细胞全蛋白质组学分析新方法。具体涉及一种基于细胞层面进行全蛋白质组学分析的方法，本方法中尤其涉及直接在细胞层面进行酶解用于后续质谱分析的蛋白质组学样品的制备方法。

[0005] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

[0006] 1.制备聚丙烯酰胺凝胶；

[0007] 2.收集与清洗细胞样品；

[0008] 3.细胞蛋白的酶解处理；

[0009] 4.酶解后的肽段洗脱后送入质谱分析。

[0010] 本发明中将收集的细胞直接通过吸胀的方式进入真空干燥后的聚丙烯酰胺凝胶粒中，然后直接进行胶内酶解获得质谱分析所需的肽段，因此，不需要单独的细胞裂解和蛋白提取步骤，使四个基本步骤减少为两步，在不提高酶量的情况下，实验耗时明显缩短。

[0011] 具体的，本发明借助聚丙烯酰胺凝胶实现了直接在细胞层面进行细胞全蛋白质组的酶解和后续质谱分析；当细胞溶液被加入到含真空干燥的凝胶颗粒的离心管中，溶液中的细胞通过吸胀的方式进入凝胶颗粒中，嵌入在凝胶颗粒中的细胞蛋白直接被胰酶酶解成肽段，而后送入质谱进行检测；由于所有细胞蛋白均随着吸胀过程中进入凝胶颗粒中，一些较难溶的蛋白在胰酶的作用下，部分裂解后变成易溶的肽段，因此通过本方法进行酶解，无须额外加入助溶剂。

[0012] 更具体的，本发明的基于细胞层面进行全蛋白质组学分析的方法，其特征在于，其包括步骤：

[0013] （1）制备聚丙烯酰胺凝胶；

[0014] （2）收集细胞样品，用PBS缓冲液洗2次；

[0015] （3）将细胞溶液与真空干燥的凝胶颗粒混合，冰浴静置；

[0016] （4）对样品进行冷热交替处理2次后，用50%乙腈和100%乙腈各洗2次；

[0017] （5）对样品进行DTT还原和IAA烷基化处理；

[0018] （6）对样品进行胰酶酶解；

[0019] （7）提取酶解肽段用于后续LC-MS/MS分析。

[0020] 本发明中，当细胞溶液被加入到含真空干燥的凝胶颗粒的离心管中，溶液中的细胞通过吸胀的方式进入凝胶颗粒中。

[0021] 本发明中，嵌入在凝胶颗粒中的细胞蛋白直接被胰酶酶解成肽段，而后送入质谱进行检测

[0022] 本发明中，细胞样品后续处理所用的缓冲液为：含蛋白酶抑制剂的25 mM的碳酸氢铵水溶液。

[0023] 本发明步骤（1）中，聚丙烯酰胺凝胶体积为50微升，所需的试剂包括：30微升25 mM的碳酸氢铵溶液，16.7微升丙烯酰胺/双丙烯酰胺（30%，29：1，w/v），2.5微升过硫酸铵（1%），0.05微升四甲基乙二胺。

[0024] 本发明步骤（1）中，所制备凝胶切割至大约1 mm3大小的均匀颗粒，然后进行真空干燥。

[0025] 本发明步骤（3）中，冰浴静置时间为5 10分钟。~

[0026] 本发明方法应用于MCF-7细胞样本的全蛋白质组学分析，在105细胞样本中，本方法（Cell-absorb）共鉴定到3022个蛋白；而作为对照的两种传统方法分别只鉴定到2642（Pro-absorb）和2420（SDS-PAGE based method）个蛋白；进一步分析发现，本方法鉴定到的蛋白中有530个蛋白分子量高于100 kDa，鉴定数目是SDS-PAGE based method的2.8倍，是Pro-absorb方法的1.9倍，显示了本方法在细胞蛋白质组鉴定，尤其是高分子量蛋白的鉴定上存在明显优势；另外，由于样品处理操作步骤减少，从蛋白鉴定数目看，三次重复实验的CV值只有3.0%。本发明方法步骤简单、操作方便、快速高效，可以实现同时进行细胞裂解和蛋白酶解，为高灵敏质谱分析提供样品保证。

[0027] 本发明提供了一种步骤简单、操作方便、快速高效、不依赖去垢剂基于细胞层面进行全蛋白质组学分析的方法，其优点是，细胞样品被吸胀进入凝胶颗粒后直接进行胶内胰酶酶解，彻底省却了传统方法中用于细胞裂解、蛋白提取和蛋白沉淀等的额外步骤，明显降低了样品制备的复杂度和时间成本；由于所有的细胞蛋白均在细胞被吸胀的过程中渗入凝胶颗粒中，因此，本方法对蛋白的理化性质没有偏好性，保证了后续蛋白组鉴定的完整性。

[0028] 本发明的基于细胞层面进行全蛋白质组学分析的方法，由于摆脱了对去垢剂的依赖，适用于后续诸多翻译后修饰的研究。

附图说明

[0029] 图1为三种不同的样品制备方法的流程示意图，其中，

[0030] (A)传统的基于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的胶内酶解方法；

[0031] （B）已报道的pro-absorb方法；

[0032] （C）本发明中涉及的样品制备方法（cell-absorb）。

[0033] 图2为本方法（cell-absorb）的效率评价，其中，

[0034] （A）三种不同的样品制备方法鉴定的蛋白/肽段/谱图数目比较；

[0035] （B）三种方法所鉴定蛋白的细胞区室分布分析，“Human”代表人源蛋白质组中所有的蛋白。

[0036] 图3为三种不同方法鉴定到的蛋白/肽段的理化性质分析，其中，

[0037] （A）蛋白分子质量分布；（B）蛋白等电点分布；（C）蛋白GRAVY分布；（D）蛋白跨膜结构域数目分布；（E）不同漏切数肽段的数目分布；（F）肽段长度分布；“Human”代表人源蛋白质组中所有的蛋白。

[0038] 图4为本方法特异性鉴定到的蛋白性质分析，其中，

[0039] （A）三种不同样品制备方法所鉴定蛋白的重叠性分析；

[0040] （B）新方法特异性鉴定到的蛋白的分子质量分布分析；

[0041] “Human”代表人源蛋白质组中所有的蛋白。

具体实施方式

[0042] 下面的实例是对本发明提出的一种在细胞层面上直接进行酶解的样品制备方法用于细胞全蛋白质组学分析的进一步说明。

[0043] 实施例1 人乳腺癌细胞系MCF7的全蛋白质组学分析

[0044] 制备50ul体系的聚丙烯酰胺凝胶，将凝胶切割成均匀大小的颗粒后置于1.5 mL离心管中，真空干燥；收集MCF7细胞，向每管中加入含105个细胞的溶液，细胞通过吸胀方式进入凝胶颗粒后，进行胶内酶解，酶解过夜后提取肽段，取1/12用于质谱分析；对三种方法所耗时长进行分析（如图1所示），从实验耗时看，采用本方法（cell-absorb）所需时间缩短将近1小时；将三次重复实验所得蛋白合并后进行比较发现，用本方法可鉴定到3022个蛋白，而另外两种方法仅鉴定到2642（pro-absorb）和2420（SDS-PAGE based method）个蛋白（如图2所示），并且从蛋白和肽段的理化性质看，本发明的方法对蛋白或肽段的理化性质不存在偏好性（如图3所示），更重要的是，从大蛋白（>100 kDa）的鉴定数目看，本方法鉴定到530个蛋白，其规模是pro-absorb方法鉴定规模的1.9倍，是基于SDS-PAGE的制备方法的鉴定规模的2.8倍（如图4所示）。