本发明涉及昆虫遗传育种技术领域，具体涉及一种提高家蚕人工诱导孤雌生殖早期世代孵化率的方法。一种提高家蚕孤雌生殖早期世代孵化率的方法，该方法采用老熟雌蛹在羽化前1～2天，注射浓度为0.5～2μmoL/的蛋白酶体抑制剂MG132；羽化后摘取处女蛾的腹部，获得未受精蚕卵；未受精蚕卵浸入46℃水浴中，热激诱导15～18分钟；诱导后未受精卵16℃保护3天后，二化品种即时浸酸后催青，多化品种直接催青至孵化。本发明通过改进家蚕孤雌生殖诱导方法，在保持诱导未受精卵解除分裂阻滞，恢复有丝分裂的同时，减轻蚕卵孵化率下降的副作用，从而提高孤雌生殖早期世代孵化率。缩短孤雌生殖品种育种周期的方法。
1.一种提高家蚕孤雌生殖早期世代孵化率的方法，其特征在于，该方法采用老熟雌蛹在羽化前1～2天注射浓度为0.5～2μmoL/L的蛋白酶体抑制剂MG132；羽化后摘取处女蛾的腹部，获得未受精蚕卵；未受精蚕卵浸入46℃水浴中，热激诱导15～18分钟；诱导后未受精卵进行保护，然后催青至孵化。
2.根据权利要求1所述的一种提高家蚕孤雌生殖早期世代孵化率的方法，其特征在于，老熟雌蛹的处理方法为：上蔟结茧后，常规保护10天后，削茧取蛹并鉴别雌雄；健康雌蛹倒入新鲜配制的0.25％漂白粉溶液中，浸洗2分钟，捞出室温晾干后，常规保护至羽化前1～2天。
3.根据权利要求1所述的一种提高家蚕孤雌生殖早期世代孵化率的方法，其特征在于，注射蛋白酶体抑制剂MG132的方法为：蛋白酶体抑制剂MG132粉剂用DMSO溶解后，配制成抑制剂储存液，使用前用1×PBS稀释到合适的浓度；按每蛹20微升量，注射雌蛹腹部,使抑制剂终浓度为0.5～2μmoL/L，常规保护至羽化。
4.根据权利要求1所述的一种提高家蚕孤雌生殖早期世代孵化率的方法，其特征在于，未受精蚕卵获取方法为：摘取羽化后在室温下保持8小时处女蛾的腹部，经室温自来水冲洗后，在14目塑料网纱上搓揉，剥离出未受精蚕卵并去除组织杂质，再用室温自来水冲洗干净、室温晾干后，备用。
5.根据权利要求1所述的一种提高家蚕孤雌生殖早期世代孵化率的方法，其特征在于，热激诱导为方法为：将晾干后未受精卵装入40目尼龙网纱小袋中封口后，浸入46℃水浴中，热激诱导15～18分钟后，转入室温自来水中漂洗3分钟，室温晾干。
6.根据权利要求1所述的一种提高家蚕孤雌生殖早期世代孵化率的方法，其特征在于，诱导后未受精卵的保护方法为：将晾干后的未受精卵放置在16℃、湿度85％的培养箱中96小时，取出后在室温下放置30分钟，二化性品种以46℃、比重1.075的盐酸水溶液浸没5分钟，室温自来水冲洗2分钟，晾干后，在25℃、80％湿度条件下催青至孵化；多化性品种直接催青至孵化。
7.根据权利要求1所述的一种提高家蚕孤雌生殖早期世代孵化率的方法，其特征在于，该方法包括以下的步骤：
1)老熟雌蛹的处理：上蔟结茧后，常规保护10天后，削茧取蛹并鉴别雌雄；健康雌蛹倒入新鲜配制的0.25％漂白粉溶液中，浸洗2分钟，捞出室温晾干后，常规保护至羽化前1～2天；
2)抑制剂配制及蛹注射：用DMSO溶解蛋白酶体抑制剂MG132粉剂，配制成抑制剂储存液，使用前用1×PBS稀释到合适的浓度；按每蛹20微升量，注射雌蛹腹部,使抑制剂终浓度为0.5～2μmoL/L，常规保护至羽化；
3)未受精卵的收集和清洗：摘取羽化后在室温下保持8小时处女蛾的腹部，经室温自来水冲洗后，在14目塑料网纱上搓揉，剥离出未受精蚕卵并去除组织杂质，再用室温自来水冲洗干净、室温晾干后，备用；
4)温汤诱导处理：将晾干后未受精卵装入40目尼龙网纱小袋中封口后，浸入46℃水浴中，热激诱导15～18分钟后，转入室温自来水中漂洗3分钟，室温晾干；
5)诱导后未受精卵的保护：将晾干后的未受精卵放置在16℃、湿度85％的培养箱中96小时，取出后在室温下放置30分钟，二化性品种以46℃、比重1.075的盐酸水溶液浸没5分钟，室温自来水冲洗2分钟，晾干后，再在25℃、80％湿度条件下催青至孵化；多化性品种直接催青至孵化。
一种提高家蚕孤雌生殖早期世代孵化率的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及昆虫遗传育种技术领域，具体涉及一种提高家蚕人工诱导孤雌生殖早期世代孵化率的方法。
背景技术
[0002] 家蚕孤雌生殖(Parthenogenesis)是指由一个雌性生殖细胞直接发育成新个体的现象。在自然状态下，其发生的频率很低，但人为地用理化因素进行刺激可获得一定比例的孤雌生殖发育卵或幼虫。细胞学证明家蚕发生孤雌生殖时，生殖细胞染色体并没有发生减数分裂，而仅仅进行了有丝分裂，子代完全复制了母体的基因型。对家蚕现行品种开展的孤雌生殖研究表明，家蚕孤雌生殖性状在不同品种间差异较大。遗传分析表明，家蚕孤雌生殖孵化率性状具有较高的狭义遗传力，孤雌生殖孵化率性状的微效基因累加作用较大，对低孤雌生殖品种进行多代的孵化率表型选择，可有效地提高品系的孤雌生殖孵化率性状。
[0003] 目前最有效的家蚕孤雌生殖诱导方法，是苏联科学家于上世纪五十年代建立的46℃温汤热激诱导18分钟的方法。浙江省农科院蚕桑所自1997年起，利用该方法对保存的家蚕种质资源进行孤雌生殖性状调查，获得部分雌蚕无性繁殖材料。并用了近6年时间，对无性繁殖材料进行5～10代的选择提高后，构建了17个孤雌生殖品系。目前部分经济性状优良的孤雌生殖品系(雌蚕品系)已应用于蚕桑生产。
[0004] 家蚕种质资源丰富，保存有近千个品系，不同品系间性状各不相同。同时，我国幅员辽阔，各地气候条件，饲养环境也并不相同，需要培育与之相适应的蚕品种。因而有必要筛选、建立更多新孤雌生殖品系，培育适合不同地域的雌蚕品系，提高蚕桑生产效率。然而，除了已建立孤雌生殖品系的资源外，在剩余的家蚕种质资源中，孤雌生殖性状普遍不佳。虽然孤雌生殖孵化率的微效基因可通过连续多代筛选逐步累加，但因早期世代的热激诱导孵化率极低，严重制约了新孤雌生殖品系的培育。
[0005] 家蚕孤雌生殖的发育生物学研究表明：成熟家蚕卵细胞中，相互配对同源染色体，阻滞于减数分裂I期等待受精。46℃，18分钟热激处理未受精卵，可破坏同源染色体配对机构，造成纺锤体解体，从而导致卵细胞越过减数分裂阶段，直接进入有丝分裂，染色单体分离，形成两个与卵细胞完全一致的子代细胞。46℃，18分钟热激处理虽然可以激活处于分裂阻滞的未受精卵恢复分裂，但也造成蛋白质发生变性失活，激活蚕卵凋亡机制，从而大大降低蚕卵的孵化率。
发明内容
[0006] 本发明目的是，针对家蚕种质资源中大部分品种经人工诱导孤雌生殖发育后，早期世代孵化率极低的现状，本发明提供了一种提高家蚕孤雌生殖早期世代孵化率的方法，本发明通过改进家蚕孤雌生殖诱导方法，在保持诱导未受精卵解除分裂阻滞，恢复有丝分裂的同时，减轻蚕卵孵化率下降的副作用，从而提高孤雌生殖早期世代孵化率。缩短孤雌生殖品种育种周期的方法。
[0007] 本发明目的通过以下技术方案得以实现：
[0008] 一种提高家蚕孤雌生殖早期世代孵化率的方法，该方法采用老熟雌蛹在羽化前1～2天注射浓度为0.5～2μmoL/L的蛋白酶体抑制剂MG132，羽化后摘取处女蛾的腹部，获得未受精蚕卵；未受精蚕卵浸入46℃水浴中，热激诱导15～18分钟；诱导后未受精卵进行保护，然后催青至孵化。
[0009] 作为优选，所述的老熟雌蛹的处理方法为：上蔟结茧后，常规保护10天后，削茧取蛹并鉴别雌雄；健康雌蛹倒入新鲜配制的0.25％漂白粉溶液中，浸洗2分钟，捞出室温晾干后，常规保护至羽化前1～2天。
[0010] 作为优选，所述的注射蛋白酶体抑制剂MG132粉剂的方法为：射蛋白酶体抑制剂MG132粉剂用DMSO溶解，配制成抑制剂储存液，使用前用1×PBS稀释到合适的浓度；按每蛹20微升量，注射雌蛹腹部,使抑制剂终浓度为0.5～2μmoL/L，常规保护至羽化。
[0011] 作为优选，所述的未受精蚕卵获取方法为：摘取羽化后在室温下保持8小时处女蛾的腹部，经室温自来水冲洗后，在14目塑料网纱上搓揉，剥离出未受精蚕卵并去除组织杂质，再用室温自来水冲洗干净、室温晾干后，备用。
[0012] 作为优选，所述的热激诱导为方法为：将晾干后未受精卵装入40目尼龙网纱小袋中封口后，浸入46℃水浴中，热激诱导15～18分钟后，转入室温自来水中漂洗3分钟，室温晾干。
[0013] 作为优选，所述的诱导后未受精卵的保护方法为：将晾干后的未受精卵放置在16℃、湿度85％的培养箱中96小时，取出后在室温下放置30分钟，二化性品种以46℃、比重1.075的盐酸水溶液浸没5分钟，室温自来水冲洗2分钟，晾干后，在25℃、80％湿度条件下催青至孵化；多化性品种直接催青至孵化。
[0014] 作为最优选，该方法包括以下的步骤：
[0015] 1)老熟雌蛹的处理：上蔟结茧后，常规保护10天后，削茧取蛹并鉴别雌雄；健康雌蛹倒入新鲜配制的0.25％漂白粉溶液中，浸洗2分钟，捞出室温晾干后，常规保护至羽化前1～2天；
[0016] 2)抑制剂配制及蛹注射：用DMSO溶解蛋白酶体抑制剂MG132粉剂，配制成抑制剂储存液，使用前用1×PBS稀释到合适的浓度；按每蛹20微升量，注射雌蛹腹部,使抑制剂终浓度为0.5～2μmoL/L，常规保护至羽化；
[0017] 3)未受精卵的收集和清洗：摘取羽化后在室温下保持8小时处女蛾的腹部，经室温自来水冲洗后，在14目塑料网纱上搓揉，剥离出未受精蚕卵并去除组织杂质，再用室温自来水冲洗干净、室温晾干后，备用；
[0018] 4)温汤诱导处理：将晾干后未受精卵装入40目尼龙网纱小袋中封口后，浸入46℃水浴中，热激诱导15～18分钟后，转入室温自来水中漂洗3分钟，室温晾干；
[0019] 5)诱导后未受精卵的保护：将晾干后的未受精卵放置在16℃、湿度85％的培养箱中96小时，取出后在室温下放置30分钟，二化性品种以46℃、比重1.075的盐酸水溶液浸没5分钟，室温自来水冲洗2分钟，晾干后，在25℃、80％湿度条件下催青至孵化；多化性品种直接催青至孵化。
[0020] 本发明的有益效果是：
[0021] 1、本发明提供的家蚕非减数分裂型孤雌生殖诱导的新方法，可以有效地提高家蚕孤雌生殖早期世代的孵化率，从而提高家蚕孤雌生殖品系的育种效率。
[0022] 2、本发明首次以蛋白酶体抑制剂MG132，结合热激诱导的方法，在保持激活未受精卵进行孤雌发育的同时，降低了热激对蚕卵孵化的负面影响。对保存的低孤雌生殖品系，进行孤雌生殖诱导试验结果显示，早期世代的孵化个体较原诱导方法有较大的增多。
具体实施方式
[0023] 通过以下实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明的内容并不局限于此。
[0024] 实施例1：
[0025] 一种提高家蚕孤雌生殖的方法，该方法按以下步骤进行：
[0026] 1)老熟雌蛹的处理：上蔟结茧后，常规保护10天后，削茧取蛹并鉴别雌雄；健康雌蛹倒入新鲜配制的0.25％漂白粉溶液中，浸洗2分钟，捞出室温晾干后，常规保护至羽化前1～2天；
[0027] 2)抑制剂配制及蛹注射：用DMSO溶解蛋白酶体抑制剂MG132粉剂，配制成抑制剂储存液，使用前用1×PBS稀释到合适的浓度；按每蛹20微升量，注射雌蛹腹部,使抑制剂终浓度为0.5～2μmoL/L，常规保护至羽化；
[0028] 3)未受精卵的收集和清洗：摘取羽化后在室温下保持8小时处女蛾的腹部，经室温自来水冲洗后，在14目塑料网纱上搓揉，剥离出未受精蚕卵并去除组织杂质，再用室温自来水冲洗干净、室温晾干后，备用；
[0029] 4)温汤诱导处理：将晾干后未受精卵装入40目尼龙网纱小袋中封口后，浸入46℃水浴中，热激诱导15～18分钟后，转入室温自来水中漂洗3分钟，室温晾干；
[0030] 5)诱导后未受精卵的保护：将晾干后的未受精卵放置在16℃、湿度85％的培养箱中保护3天，取出后在室温下放置30分钟，二化性品种以46℃、比重1.075的盐酸水溶液浸没5分钟，室温自来水冲洗2分钟，晾干后，在25℃、80％湿度条件下催青至孵化；多化性品种直接催青至孵化。
[0031] 实施例2：
[0032] 本例步骤(1)中：雌蛹常规保护至羽化前2d；步骤(2)中：注射后抑制剂MG132的终浓度为0.5μmoL/L；步骤(4)中：热激诱导18分钟；其余步骤工艺同于实施例1。
[0033] 实施例3：
[0034] 本例步骤(1)中：雌蛹常规保护至羽化前2d；步骤(2)中：注射后抑制剂MG132的终浓度为1.33μmoL/L；步骤(4)中：热激诱导18分钟；其余步骤工艺同于实施例1。
[0035] 实施例4：
[0036] 本例步骤(1)中：雌蛹常规保护至羽化前2d；步骤(2)中：注射后抑制剂MG132的终浓度为0.67μmoL/L；步骤(4)中：热激诱导15分钟；其余步骤工艺同于实施例1。
[0037] 对照例1：
[0038] 本例步骤(1)中：雌蛹常规保护至羽化前1d；步骤(2)中：注射后抑制剂MG132的终浓度为1μmoL/L；步骤(4)中：热激诱导10分钟；其余步骤工艺同于实施例1。
[0039] 对照例2：
[0040] 本例步骤(1)中：雌蛹常规保护至羽化前1d；步骤(2)中：注射后抑制剂MG132的终浓度为5μmoL/L；步骤(4)中：热激诱导18分钟；其余步骤工艺同于实施例1。
[0041] 对照例3：
[0042] 本例步骤(1)中：雌蛹常规保护至羽化前2d；步骤(2)中：注射后抑制剂MG132的终浓度为0.0μmoL/L；步骤(4)中：热激诱导15分钟；其余步骤工艺同于实施例1。
[0043] 对照例4：
[0044] 本例步骤(1)中：雌蛹常规保护至羽化前2d；步骤(2)中：注射后抑制剂MG132的终浓度为0.0μmoL/L；步骤(4)中：热激诱导18分钟；其余步骤工艺同于实施例1。
[0045] 表1 2017年Nistari品种的不同诱导方法的孤雌生殖诱导结果(每个处理10蛾)[0046]
[0047]
