人源化基因改造动物模型的制备方法及应用转让专利
申请号 : CN201711402264.X
文献号 : CN108239659B
文献日 : 2020-03-03
发明人 : 沈月雷 , 白阳 , 黄蕤 , 尚诚彰 , 郭雅南 , 张美玲
申请人 : 百奥赛图江苏基因生物技术有限公司 , 北京百奥赛图基因生物技术有限公司
摘要 :
本发明涉及人源化基因改造非人动物，特别是基因改造啮齿动物，但尤其是基因改造小鼠，具体涉及人源化CD27基因动物模型的构建方法及其在生物医药领域的应用。
权利要求 :
1.一种用于制备CD27基因人源化的靶向载体，其包含：a)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自CD27基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；b)替换的供体DNA序列，其编码供体转换区；和c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自CD27基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸，其中，所述的待改变的转换区位于CD27基因第1号外显子至第5号外显子，所述的替换的供体DNA序列如SEQ ID NO：21所示。
2.根据权利要求1所述的用于制备CD27基因人源化的靶向载体，其特征在于，a)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其序列如NCBI登录号为NC_000072.6的第
125241195-125236893位核苷酸所示；c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，其序列如NCBI登录号为NC_000072.6的第125232413-125227672位核苷酸所示。
3.根据权利要求1或2所述的用于制备CD27基因人源化的靶向载体，其特征在于，所述用于制备CD27基因人源化的靶向载体还包括基因标记，阳性克隆筛选的抗性基因，和/或，特异性重组系统。
4.一种细胞，其特征在于，所述细胞包含权利要求1-3任一所述的用于制备CD27基因人源化的靶向载体。
5.权利要求1-3任一所述的用于制备CD27基因人源化的靶向载体、权利要求4所述的细胞在构建包含CD27基因人源化的非人动物或其子代中的应用。
6.一种制备CD27基因人源化非人动物或其子代的方法，其特征在于，包括导入人CD27基因，使得该人CD27基因在非人动物或其子代细胞中表达并且促进该细胞产生人源化的CD27蛋白，同时降低或消除了非人动物或其子代的体内动物来源的Cd27基因的表达，其中，所述的方法包括将动物来源的Cd27基因的第1-5号外显子部分替换为人CD27基因的第1-5号外显子的部分序列，所述的人CD27基因的第1-5号外显子的部分序列如SEQ ID NO：21所示。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，使用权利要求1-3任一所述的用于制备CD27基因人源化的靶向载体或权利要求4所述的细胞将动物来源的Cd27基因的第1-5号外显子部分替换为人CD27基因的第1-5号外显子的部分序列，所述的人CD27基因的第1-5号外显子的部分序列如SEQ ID NO：21所示。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
a)使用权利要求1-3任一所述的用于制备CD27基因人源化的靶向载体靶向细胞中的目标基因组以形成经遗传修饰的非人类哺乳动物细胞或提供权利要求4所述的细胞；其中，所述非人类哺乳动物细胞为胚胎干细胞；
(b)将所述细胞在培养液中进行培养；
(c)将培养后细胞移植至受体雌性非人类哺乳动物的输卵管内，允许所述细胞在所述雌性非人类哺乳动物的子宫中发育；
(d)鉴定步骤(c)的怀孕雌性动物的后代基因改造人源化动物中的种系传递。
9.根据权利要求6-8任一所述的方法，其特征在于，使用基因编辑技术进行CD27基因人源化动物模型的建立，所述基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、CRISPR/Cas9、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术或归巢核酸内切酶。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述动物为啮齿类动物。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述啮齿类动物为小鼠。
12.根据权利要求6-8和10-11任一所述的方法，其特征在于，所述动物用作动物模型。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述动物模型为荷瘤非人类哺乳动物模型。
14.根据权利要求6-8、10-11和13任一所述的方法，其特征在于，所述人源化的CD27蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：24所示。
15.根据权利要求6-8、10-11和13任一所述的方法，其特征在于，编码所述人源化的CD27蛋白的基因序列选自：a)所述基因编码权利要求14中所述人源化的CD27蛋白的氨基酸序列；
b)所述基因的mRNA序列如SEQ ID NO：23所示；
c)所述基因的CDS编码序列如SEQ ID NO：22所示。
16.一种制备多基因人源化非人动物的方法，其特征在于，包括如下步骤：(a)利用权利要求6-15任一所述的制备CD27基因人源化非人动物或其子代的方法制备获得的非人动物或其子代；
(b)将步骤(a)获得的动物或其子代与其他人源化动物交配、进行体外授精、直接进行基因编辑或直接进行基因修饰，并进行筛选，得到多基因人源化非人动物。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述多基因人源化非人动物为双基因人源化非人动物。
18.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述其他人源化动物为PD-1人源化动物或PD-L1人源化动物。
19.根据权利要求16-18任一所述的方法，其特征在于，所述动物为小鼠。
20.一种嵌合CD27蛋白，其特征在于，所述的嵌合CD27蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：
24所示。
21.一种编码嵌合CD27蛋白的基因，其特征在于，其选自：
a)所述基因编码权利要求20中所述的嵌合CD27蛋白的氨基酸序列；
b)所述基因的mRNA序列如SEQ ID NO：23所示；
c)所述基因的CDS编码序列如SEQ ID NO：22所示。
22.根据权利要求21所述的基因，其特征在于，其中SEQ ID NO：23所示序列为人源化小鼠CD27 DNA的非模板链、编码链或有义链。
23.一种表达权利要求20所述的嵌合CD27蛋白的构建体。
24.一种包含权利要求23所述构建体的细胞。
25.一种包含权利要求24所述细胞的组织。
26.一种细胞或细胞系或原代细胞培养物，其特征在于，所述细胞或细胞系或原代细胞培养物来源于权利要求6-15或权利要求16-19任一所述的方法制备的非人动物或其子代。
27.一种组织或器官，其特征在于，所述组织或器官来源于权利要求6-15或权利要求
16-19任一所述的方法制备的非人动物或其子代。
28.一种权利要求6-15或16-19任一所述的方法制备的非人动物或其子代、权利要求20所述的嵌合CD27蛋白、权利要求21-22任一所述的编码嵌合CD27蛋白的基因、权利要求23所述的构建体、权利要求24所述的细胞、权利要求25所述的组织、权利要求26所述的细胞或细胞系或原代细胞培养物、权利要求27所述的组织或器官在制备动物模型中的用途。
29.一种权利要求6-15或16-19任一所述的非人动物或其子代、权利要求20所述的嵌合CD27蛋白、权利要求21-22任一所述的编码嵌合CD27蛋白的基因、权利要求23所述的构建体、权利要求24所述的细胞、权利要求25所述的组织、权利要求26所述的细胞或细胞系或原代细胞培养物、权利要求27所述的组织或器官在与CD27基因或者蛋白相关的领域中的应用。
30.根据权利要求29所述的应用，其特征在于，所述的应用包括在需要涉及人类细胞的免疫过程的产品开发，制造人类抗体，或者作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的模型系统中的应用。
31.根据权利要求29所述的应用，其特征在于，所述的应用包括在需要涉及人类细胞的免疫过程的生产和利用动物实验疾病模型，用于病原学研究、用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用。
32.根据权利要求29所述的应用，其特征在于，所述的应用包括在体内研究、人CD27信号通路调节剂的筛选、药效检测、筛选文库、疗效评估、筛选、验证、评价或研究CD27基因功能研究、人CD27抗体、针对人CD27靶位点的药物、药效研究，免疫相关疾病药物以及抗肿瘤药物方面的用途。
说明书 :
人源化基因改造动物模型的制备方法及应用
技术领域
[0001] 本申请涉及人源化基因改造动物模型的建立方法及应用，具体而言，涉及基于一种人源化CD27基因改造动物模型的构建方法及其在生物医药的应用。
背景技术
[0002] 实验动物疾病模型对于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发防治技术和药物是不可缺少的研究工具。但动物与人类的生理结构和代谢系统本身的差异，传统的动物模型并不能很好的反映人体的真实状况，在动物体内建立更接近人类的生理特征的疾病模型是生物医药行业的迫切需求。
[0003] 随着基因工程技术的不断发展和成熟，用人类基因替代或置换动物的同源性基因已经实现，通过这种方式开发人源化实验动物模型(humanized animal model)是动物模型未来的发展方向。其中基因人源化动物模型，即，利用基因编辑技术，用人源正常或突变基因替换动物基因组的同源基因，可建立更接近人类生理或疾病特征的正常或突变基因动物模型。基因人源化动物不但本身具有重要应用价值，如通过基因人源化可改进和提升细胞或组织移植人源化动物模型，更重要的是，由于人类基因片段的插入，动物体内可表达或部分表达人源蛋白，可作为仅能识别人蛋白序列的药物的靶点，为在动物水平进行抗人抗体及其它药物的筛选提供了可能。
[0004] 然而，由于动物与人类在生理学及病理学方面存在差异，加上基因(即遗传因子)的复杂性，如何能构建出“有效”的人源化动物模型用于新药研发仍是最大的挑战(Scheer N,Snaith M,Wolf CR,Seibler J.Generation and utility of genetically humanized mouse models,Drug Discov Today；18(23-24):1200-11,2013)。
[0005] 免疫疗法通过激活免疫系统攻击并杀死癌症细胞，是肿瘤研究的一个重要领域，近十年来已经应用在临床治疗中。研究表明，以T细胞的共刺激分子为目标进行治疗效果显著，是当前靶向基因治疗最成功的领域。其中，靶向抑制性受体CTLA-4、PD-1/PD-L1及其配体的单克隆抗体已经取得确切疗效，已有药品上市并获批多个适应症。但病人的应答率较低，且不能充分满足临床需求，更多靶向其它的T细胞的共刺激分子的新型药物正在或已经进入临床研究。
[0006] CD27是由二硫键连接单体组成的二聚体跨膜糖蛋白，属于I型跨膜糖蛋白(transmembrane glycoprotein)，主要表达于大多数T细胞、B细胞及NK细胞表面，是目前已经确定的T细胞刺激性受体之一。CD27是肿瘤坏死因子受体(TFNR)超家族的成员，其配体CD70属于肿瘤坏死因子(TNF)超家族，两者之间的相互作用可以调节T、B及NK细胞的增殖和分化。
[0007] 已有证据表明CD27-CD70信号通路在免疫调节中发挥重要作用。如在T细胞活化过程中，CD27的表达瞬时增加，但是当T细胞经过几轮分化后，CD27则下调；在人类B细胞上，CD27的激活能促进B细胞向浆细胞分化，从而刺激免疫球蛋白的产生；在IL-2及IL-12的存在下，通过CD70激活CD27能够直接增强NK细胞的活化。作为T细胞的刺激性受体，已有实验表明阻断CD27-CD70信号通路可改善相关自身免疫性疾病的表现，如实验性结肠炎和鼠胶原诱导的关节炎。此外，有研究表明在一定的环境下，如肿瘤微环境中，CD27-CD70共刺激信号通路通过对T细胞及NK等细胞增殖活化的促进作用，提高免疫系统的肿瘤清除能力。临床研究结果表明抗CD27抗体可能能够抑制肿瘤生长和转移，靶向CD27的(拮抗剂)目前均处于临床研究中。
[0008] 2000年，Hendriks,J等人使用ES方法将小鼠CD27基因的外显子主要部分用抗性基因替换成功制备了CD27缺陷小鼠(C57BL/6背景)，该小鼠可正常存活(＞6个月)。通过分析流感病毒在该小鼠上的反应，确定了CD27在CD4+和CD8+T细胞的增殖过程中是必需的，特别是在肺中，响应原发性感染。与野生型小鼠相比，CD27缺陷小鼠的记忆性T细胞应答延迟。然而CD27缺乏并没有影响杀伤性T细胞的功能或B细胞对流感病毒的应答(Hendriks,J.,Gravestein,L.A.,Tesselaar,K.,van Lier,R.A.W.,Schumacher,T.N.M.,Borst,J.CD27is required for generation and long-term maintenance of T cell immunity.Nature Immun.1:433-440,2000)。2011年VeerleDe Colvenaer等人使用同样方法制备了CD27缺陷小鼠，用于研究CD27在NK细胞的发育和功能。发现其NK细胞可正常分化，但刺激NK细胞后，脾和肝脏NK细胞产生的细胞因子及杀伤活性均降低，表明CD27可能在NK细胞的活化和功能方面具有重要作用(Veerle De Colvenaer,Sylvie Taveirne,Delforche,Magda De Smedt,Bart Vandekerckhove。CD27-deficient mice show normal NK-cell differentiation but impaired function upon stimulation,Immunology and Cell Biology,89:803-811,2011)。
[0009] 以上研究表明现有与CD27相关的模式动物较少，且主要用于研究基因信号通路、功能等方面。鉴于CD27基因在肿瘤免疫治疗领域具有巨大应用价值，为了使临床前期的试验更有效并使研发失败最小化，本发明在世界范围内首次提供一种建立人源化CD27基因改造动物模型的新方法，并得到世界首例CD27基因人源化动物。具体来说，本发明的目的是制备一种非人动物模型，该动物体内可正常表达CD27蛋白，且表达的CD27蛋白能识别并结合人CD27抗体/抗原，该方法在肿瘤药物筛选、验证等方面有着广阔的应用前景。
发明内容
[0010] 为了解决上述问题，本申请发明人惊奇的发现利用创造性劳动筛选设计独特的靶向载体，使非人动物CD27基因的特定片段被人CD27基因特定片段替换，本申请发明人成果得到世界首例人源化CD27基因非人动物模型，特别是CD27基因人源化小鼠。成功制备CD27基因人源化的模式动物，该模型体内可正常表达CD27蛋白，可用于CD27基因功能研究、靶向CD27抗体的筛选和评价。
[0011] 利用本发明制备的动物模型可用于针对人CD27靶位点的药物筛选、药效研究，免疫相关疾病和肿瘤治疗等应用，加快新药研发过程，节约时间和成本，降低药物开发风险。对于研究CD27蛋白的功能和肿瘤药物筛选等提供了有力工具。
[0012] 利用本发明还可得到基因敲除动物模型。以及利用本模型可以与其它人源化动物模型(包括但不限于，人源化PD-1抗体动物模型)交配得到双人源动物模型，可用于联合用药情况下筛选抗体及联合用药的药效评价等。
[0013] 本发明的第一方面，涉及一种靶向载体，其包含：a)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自CD27基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；b)插入或替换的供体DNA序列，其编码供体转换区；和c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自CD27基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。
[0014] 优选的，所述的靶向载体，a)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂/受体，其选自与NCBI登录号为NC_000072.6至少具有90％同源性的核苷酸；c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂/受体，其选自NCBI登录号为NC_000072.6至少具有90％同源性的核苷酸。
[0015] 优选的，所述的靶向载体，a)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自如NCBI登录号为NC_000072.6的第125241195-125236893位核苷酸；c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段即3’臂，其选自如所示的NCBI登录号为NC_000072.6的第
125232413-125227672位核苷酸。
125232413-125227672位核苷酸。
[0016] 优选的，a)中的核苷酸长度为4303bp；c)中的核苷酸长度为4742bp。
[0017] 优选的，所述的待改变的转换区位于CD27基因的第1号外显子至第5号外显子。
[0018] 优选的，所述5’臂序列如SEQ ID NO：19所示；所述3’臂序列如SEQ ID NO：20所示。
[0019] 优选的，所述的靶向载体还包括可选择的基因标记。进一步优选的，所述标记基因为负筛选标记的编码基因。最优选的，所述负筛选标记的编码基因为白喉毒素A亚基的编码基因(DTA)。
[0020] 进一步优选的，所述靶向载体还包括阳性克隆筛选的抗性基因。最优选的，所述阳性克隆筛选的抗性基因为新霉素磷酸转移酶编码序列Neo。
[0021] 进一步优选的，所述靶向载体还包括特异性重组系统。最优选的，所述特异性重组系统为Frt重组位点(也可选择常规的LoxP重组系统)。所述的特异性重组系统为2个，分别装在抗性基因的两侧。
[0022] 优选的，所述的靶向载体，其中插入或替换的供体DNA序列片段来自人。进一步优选的，所述插入或替换的供体DNA序列为人CD27基因的核苷酸序列部分或全部。再进一步优选的，所述核苷酸序列包括人CD27基因DNA序列的第1号外显子、第2号外显子、第3号外显子、第4号外显子和第5号外显子中的全部或部分。
[0023] 优选的，所述人CD27的核苷酸序列编码如SEQ ID NO：18所示的NCBI登录号NP_001233.1所示人CD27蛋白的部分或全部序列。
[0024] 优选的，所述人CD27的核苷酸序列选自NCBI登录号为NC_000012.12的第6445096-6450905位核苷酸。进一步优选的，所述的靶向载体，其中插入或替换的供体DNA序列包含SEQ ID NO：21。
[0025] 本发明的第二方面，涉及一种细胞，其包含上述任一的靶向载体。
[0026] 优选的，所述细胞为非人类哺乳动物细胞。进一步优选的，所述非人类哺乳动物细胞是啮齿类动物细胞。最优选的，所述啮齿类动物细胞是小鼠细胞。
[0027] 优选的，所述细胞为胚胎干细胞。所述的胚胎干细胞来源于任何非人类动物。进一步优选的，所述胚胎干细胞细胞来源于啮齿类动物细胞。
[0028] 在本发明的一个具体实施例中，所述胚胎干细胞为C57BL/6背景鼠细胞。
[0029] 本发明的第三方面，涉及上述的靶向载体、上述的细胞在构建包含CD27基因人源化的非人动物或其子代中的应用。
[0030] 本发明的第四方面，涉及一种制备CD27基因人源化非人动物或其子代的方法，包括导入人CD27基因，使得该人CD27基因在非人动物或其子代细胞中表达并且促进该细胞产生人源化的CD27蛋白，同时降低或消除了非人动物或其子代的体内内源/动物来源的Cd27基因的表达。
[0031] 优选的，包括将动物来源的Cd27基因全部或部分替换为人CD27基因的全部或部分序列。进一步优选的，包括将动物来源的Cd27基因的第1-5号外显子全部或部分替换为人CD27基因的第1-5号外显子的全部或部分序列。最优选的，使用上述的靶向载体或上述的细胞将动物来源的Cd27基因的第1-5号外显子全部或部分替换为人CD27基因的第1-5号外显子的全部或部分序列。
[0032] 优选的，所述的方法，包括如下步骤：
[0033] (a)使用上述任一的靶向载体靶向细胞中的目标基因组以形成经遗传修饰的非人类哺乳动物细胞或提供一种上述的细胞；优选的所述非人类哺乳动物细胞为胚胎干细胞；
[0034] (b)将所述细胞在培养液中进行培养；
[0035] (c)将培养后细胞移植至受体雌性非人类哺乳动物的输卵管内，允许所述细胞在所述雌性非人类哺乳动物的子宫中发育；
[0036] (d)鉴定步骤(c)的怀孕雌性动物的后代基因改造人源化动物中的种系传递。
[0037] 优选的，所述步骤(c)中的动物为假孕雌性。
[0038] 优选的，使用基因编辑技术进行CD27基因人源化动物模型的建立，所述基因编辑技术包括基于胚胎干细胞的基因同源重组技术、CRISPR/Cas9、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。优选的，使用基于胚胎干细胞的基因同源重组技术进行CD27基因人源化动物模型的建立。
[0039] 优选的，所述动物为啮齿类动物；优选的，所述啮齿类动物为小鼠；更优选的，所述小鼠为C57BL/6背景。
[0040] 优选的，所述动物用作动物模型；优选的，所述动物模型为荷瘤非人类哺乳动物模型。
[0041] 本发明的第五方面，涉及根据上述的方法制备获得的非人动物或其子代。
[0042] 优选的，所述非人动物为啮齿类动物。进一步优选的，所述啮齿类动物为小鼠。最优选的，所述小鼠为C57BL/6背景。
[0043] 本发明的第六方面，涉及一种制备多基因人源化非人动物的方法，包括如下步骤：
[0044] (a)利用上述的非人动物或其子代；
[0045] (b)将步骤(a)获得的动物与其他人源化动物交配或进行体外授精或直接进行基因编辑/修饰，并进行筛选，得到多基因人源化非人动物。
[0046] 优选的，所述多基因人源化非人动物可以是双基因人源化动物、三基因人源化动物、四基因人源化动物、五基因人源化动物、六基因人源化动物、七基因人源化动物、八基因人源化动物或九基因人源化动物。
[0047] 在本发明的一个具体实施例中，所述的多基因人源化非人动物为双基因人源化非人动物；所述其他人源化动物为PD-1人源化动物或PD-L1人源化动物；所述动物是啮齿动物。进一步优选的，所述动物为小鼠。
[0048] 将步骤(a)获得的基因改造人源化小鼠与PD-1人源化小鼠或PD-L1人源化小鼠交配得到CD27和PD-1或PD-L1双人源化小鼠模型。
[0049] 上述方法产生的非人类哺乳动物或通过显微注射后培养受精卵细胞，将培养的受精卵细胞转移到假孕的非人类动物中产生的非人类哺乳动物。
[0050] 优选的，所述双人源化小鼠模型的基因组中含有人基因。优选的，所述非人动物表达人源化CD-27和/或人源化PD-1基因编码的蛋白质，或表达人源化CD-27和/或人源化PD-L1基因编码的蛋白质。
[0051] 本发明的第七方面，涉及上述制备多基因人源化非人动物的方法制备获得的多基因人源化非人动物或其子代。
[0052] 优选的，所述动物为非人哺乳动物。优选的，所述非人哺乳动物为啮齿类动物。更优选的，所述啮齿类动物为小鼠。进一步，所述小鼠为C57BL/6背景。
[0053] 本发明的第八方面，涉及人源化的CD27蛋白的氨基酸序列，其选自：
[0054] a)所述氨基酸序列如SEQ ID NO：24所示；
[0055] b)所述氨基酸序列与SEQ ID NO：24所示氨基酸的序列同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
[0056] c)由核酸序列编码的氨基酸序列，所述核酸序列在严格条件下，与编码SEQ ID NO：24所示的氨基酸的核苷酸序列杂交；
[0057] d)所述氨基酸序列与SEQ ID NO：24所示的氨基酸的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；
[0058] 和/或
[0059] e)所述氨基酸序列具有SEQ ID NO：24所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
[0060] 本发明的第九方面，涉及编码人源化CD27蛋白的基因，其选自：
[0061] a)所述基因编码上述人源化CD27蛋白的氨基酸序列；
[0062] b)所述基因的mRNA序列如SEQ ID NO：23所示；
[0063] c)所述基因的CDS编码序列如SEQ ID NO：22所示；
[0064] d)在严格条件下，与SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：25所示的核苷酸杂交的基因序列；
[0065] e)与SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：25所示的核苷酸具有至少大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性程度的基因序列；
[0066] f)编码氨基酸的基因序列，所述氨基酸与SEQ ID NO：24所示的氨基酸的同一性程度为至少大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
[0067] g)编码氨基酸的基因序列，所述氨基酸的序列与SEQ ID NO：24的差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基；
[0068] 和/或
[0069] h)编码氨基酸的基因序列，所述氨基酸具有SEQ ID NO：24所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列。
[0070] 优选的，所述的基因，其中SEQ ID NO：23所示序列为人源化小鼠CD27DNA的非模板链、编码链或有义链。
[0071] 本发明的第十方面，涉及人源化小鼠CD27的基因组DNA，所述基因组DNA序列转录获得的mRNA逆转录后得到的DNA序列，与上述的DNA或基因序列一致或互补。
[0072] 本发明的第十一方面，涉及一种表达人源化小鼠CD27蛋白的构建体。
[0073] 本发明的第十二方面，涉及一种包含上述构建体的细胞。
[0074] 本发明的第十三方面，涉及一种包含上述细胞的组织。
[0075] 本发明的第十四方面，涉及一种细胞或细胞系或原代细胞培养物，所述细胞或细胞系或原代细胞培养物来源于上述的的非人动物或其子代。
[0076] 本发明的第十五方面，涉及一种组织或器官，所述组织或器官来源于上述的非人动物或其子代。优选的，所述组织或器官为脾脏、肿瘤或其培养物。进一步优选的，所述的组织为荷瘤非人类哺乳动物荷瘤后的瘤组织。
[0077] 本发明的第十六方面，涉及一种上述的非人动物或其子代、上述的嵌合CD27蛋白、上述的编码嵌合CD27蛋白的基因、上述的构建体、上述的细胞、上述的组织、上述的细胞或细胞系或原代细胞培养物、上述的组织或器官在制备动物模型中的用途。
[0078] 本发明的第十七方面，涉及一种上述的动物或其子代、上述的嵌合CD27蛋白、上述的编码嵌合CD27蛋白的基因、上述的构建体、上述的细胞、上述的组织、上述的细胞或细胞系或原代细胞培养物、上述的组织或器官在与CD27基因或者蛋白相关的领域中的应用。
[0079] 优选的，所述的应用包括在需要涉及人类细胞的免疫过程的产品开发，制造人类抗体，或者作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的模型系统中的应用或在需要涉及人类细胞的免疫过程的生产和利用动物实验疾病模型，用于病原学研究和/或用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用或在体内研究、人CD27信号通路调节剂的筛选、药效检测、筛选文库、疗效评估、筛选、验证、评价或研究CD27基因功能研究、人CD27抗体、针对人CD27靶位点的药物、药效研究，免疫相关疾病药物以及抗肿瘤药物方面的用途。
[0080] 本发明的第十八方面，涉及一种可稳定传代的人源化基因工程非人动物或其子代，所述非人动物体内表达人或人源化CD27蛋白。
[0081] 优选的，所述人源化基因工程人非人动物或其子代的动物基因组中含有外源DNA，所述外源DNA通过人工导入并整合入基因组中，且所述DNA表达特定的蛋白质。
[0082] 优选的，所述基因工程非人动物基因组中含有编码人CD27的DNA。所述DNA还包括特异的诱导物或阻遏物物质。
[0083] 优选的，所述特定的蛋白质为上述的嵌合CD27蛋白。
[0084] 优选的，所述非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述非人哺乳动物为啮齿类动物。再进一步优选的，所述啮齿类动物为大鼠或小鼠。
[0085] 在本发明的一个具体实施例中，所述小鼠为C57BL/6背景小鼠或其后代。
[0086] 优选的，用于如上描述的方法的受精卵是C57BL/6受精卵。也可用于本发明方法中的本领域所使用的受精卵包括但不限于FVB/N受精卵、BALB/c受精卵、DBA/1受精卵和DBA/2受精卵。除非特别说明，本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如：Molecular Cloning A Laboratory Manual，2ndEd.，ed.By Sambrook，Fritschand Maniatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press：1989)；DNA Cloning，Volumes I and II(D.N.Glovered.，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gaited.，1984)；
Mullisetal.U.S.Pat.No.4，683，195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames&
S.J.Higginseds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，AlanR.Liss，Inc.，
1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；the series，Methods In ENZYMOLOGY(J.Abelson and M.Simon，eds.-in-chief，Academic Press，Inc.，New York)，specifically，Vols.154and 155(Wuetal.eds.)and Vol.185，″Gene Expression Technology″(D.Goeddel，ed.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller and M.P.Caloseds.，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer and Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；
Handbook Of Experimental Immunology，Volumes V(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)；and Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。
Mullisetal.U.S.Pat.No.4，683，195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames&
S.J.Higginseds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，AlanR.Liss，Inc.，
1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；the series，Methods In ENZYMOLOGY(J.Abelson and M.Simon，eds.-in-chief，Academic Press，Inc.，New York)，specifically，Vols.154and 155(Wuetal.eds.)and Vol.185，″Gene Expression Technology″(D.Goeddel，ed.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller and M.P.Caloseds.，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer and Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；
Handbook Of Experimental Immunology，Volumes V(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)；and Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。
[0087] 以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。
[0088] 本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。
附图说明
[0089] 以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：
[0090] 图1：小鼠Cd27基因和人CD27基因对比示意图(非按比例)；
[0091] 图2：打靶策略及打靶载体设计示意图(非按比例)；
[0092] 图3：人源化基因改造CD27小鼠基因示意图，从图A到图B显示了FRT重组过程；
[0093] 图4：pBs-Neo质粒示意图；
[0094] 图5：分别用BamHI、XhoI和EcoRI酶切割打靶载体pDTA-down-ABC的结果图，其中，M为Marker，1-1、1-2、2-1、2-2为质粒编号；
[0095] 图6：鼠尾PCR鉴定结果(F1)，其中，WT为野生型，+为未去NEO的小鼠对照，F1-1、F1-4、F1-7、F1-9、F1-10和F1-12为小鼠编号；
[0096] 图7：流式分析结果，其中，图A、B为未经刺激的C57BL/6野生型鼠，图C、D为经鼠CD3抗体刺激的C57BL/6野生型鼠，图E、F为经人CD3抗体刺激的人源化CD27杂合子小鼠，分别使用mCD27APC和mTcRβPerCP(图A、C、E)或hCD27PE和mTcRβPerCP(图B、D、F)对胞外蛋白同时染色进行细胞标记；
[0097] 图8：RT-PCR检测结果，其中，+/+为野生型C57BL/6小鼠，H/+为CD27人源化杂合子小鼠，mCD27为鼠源引物，hCD27为人源引物；
[0098] 图9：流式分析结果，其中，图A、D为未经刺激的C57BL/6野生型鼠，图B、E为经鼠CD3抗体刺激的C57BL/6野生型鼠，图C、F为经鼠CD3抗体刺激的CD27人源化鼠纯合子，分别使用mCD27APC(图A、B、C)和mTcRβPerCP及hCD27PE(图D、E、F)和mTcRβPerCP进行细胞标记；
[0099] 图10：RT-PCR鉴定结果，其中，H/H为CD27人源化基因纯合子，+/+为野生型对照，mCD27为鼠源引物，hCD27为人源引物；
[0100] 图11：鼠尾PCR鉴定结果，其中，M为Marker，图A、B中，+为CD27纯合子对照，-为野生型对照，图C、D中，WT为野生型对照，-/-为PD-1基因人源化小鼠纯合子，+/-为PD-1基因人源化小鼠杂合子；
[0101] 图12：流式分析结果，其中，图A、D为未经刺激的野生型C57BL/6鼠，图B、E为经鼠CD3抗体刺激的野生型C57BL/6鼠，图C、F为经鼠CD3抗体刺激的CD27/PD-1人源化鼠纯合子，分别使用mCD27APC(图A、B、C)和mTcRβPerCP及hCD27PE(图D、E、F)和mTcRβPerCP进行细胞标记；
[0102] 图13：流式分析结果，其中，图A、D为未经刺激的野生型C57BL/6鼠，图B、E为经鼠CD3抗体刺激的野生型C57BL/6鼠，图C、F为经鼠CD3抗体刺激的CD27/PD-1人源化鼠纯合子，分别使用mPD-1PE(图A、B、C)和mTcRβPerCP及hPD-1FITC(图D、E、F)和mTcRβPerCP进行细胞标记；
[0103] 图14：RT-PCR鉴定结果，其中，H/H为CD27/PD-1人源化基因纯合子，+/+为野生型对照，mCD27为鼠源引物，hCD27为人源引物；
[0104] 图15：RT-PCR鉴定结果，其中，H/H为CD27/PD-1人源化基因纯合子，+/+为野生型对照，mPD-1为鼠源引物，hPD-1为人源引物；
[0105] 图16：鼠尾PCR鉴定结果，其中，M为Marker，-为野生型对照，6065-6080为小鼠编号，图A、B中，+为CD27纯合子对照，图C、D中，+为PD-L1基因人源化小鼠杂合子；
[0106] 图17：小鼠结肠癌细胞MC38植入人源化CD27小鼠纯合子体内，并利用人CD27抗体Ab-1、Ab-2、Ab-3中的1种进行抗肿瘤药效试验，图为实验周期内小鼠体重测量结果；
[0107] 图18：小鼠结肠癌细胞MC38植入人源化CD27小鼠纯合子体内，并利用人CD27抗体Ab-1、Ab-2、Ab-3中的1种进行抗肿瘤药效试验，图为实验周期内小鼠体重变化结果；
[0108] 图19：小鼠结肠癌细胞MC38植入人源化CD27小鼠纯合子体内，并利用人CD27抗体Ab-1、Ab-2、Ab-3中的1种进行抗肿瘤药效试验，图为实验周期内小鼠肿瘤体积测量结果；
[0109] 图20：小鼠结肠癌细胞CT26植入人源化CD27小鼠纯合子体内，并利用人CD27抗体Ab-4进行体内药效试验，图为实验周期内小鼠体重测量结果；
[0110] 图21：小鼠结肠癌细胞CT26植入人源化CD27小鼠纯合子体内，并利用人CD27抗体Ab-4进行体内药效试验，图为实验周期内小鼠体重变化结果；
[0111] 图22：小鼠结肠癌细胞CT26植入人源化CD27小鼠纯合子体内，并利用人CD27抗体Ab-4进行体内药效试验，图为实验周期内小鼠肿瘤体积测量结果。
具体实施方式
[0112] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0113] 在下述每一实施例中，设备和材料是从以下所指出的几家公司获得：
[0114] C57BL/6小鼠和Flp工具鼠购自中国食品药品检定研究院国家啮齿类实验动物种子中心；
[0115] BALB/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司；
[0116] B-hPD-1小鼠、B-hPD-L1小鼠来源北京百奥赛图基因生物技术有限公司；
[0117] 含有鼠CD27基因的细菌人工染色体(Bacterial Artificial Chromosome，BAC)、含有人CD27基因的BAC菌均订购自invitrogen；
[0118] 逆转录试剂盒来源TakaRa，货号6110A；
[0119] AIO试剂盒来源北京百奥赛图基因生物技术有限公司，货号BCG-DX-004；
[0120] BamHI、EcoRI、XhoI、HpaI酶购自NEB，货号分别为；R3136M、R3101M、R0146S、R0105S；
[0121] TOP10感受态细胞购自Tiangen公司，货号为CB104-02；
[0122] APC Hamster Anti-Mouse CD27(mCD27APC)购自BD Pharmingen，货号为：560691；
[0123] PE Mouse Anti-Human CD27(hCD27PE)购自BD Pharmingen，货号为：557330；
[0124] PerCP/Cy5.5anti-mouse TCRβchain(mTcRβPerCP)购自Biolegend，货号为：109228；
[0125] PE anti-mouse CD279(PD-1)Antibody(mPD-1PE)来源Biolegend，货号109104；
[0126] FITC anti-human CD279(PD-1)Antibody(hPD-1FITC)来源Biolegend，货号329904；
[0127] APC anti-mouse CD274(B7-H1,PD-L1)Antibody(mPD-L1APC)来源Biolegend，货号为124312；
[0128] PE anti-human CD274(B7-H1,PD-L1)Antibody(hPD-L1PE)来源Biolegend，货号为329706；
[0129] G418培养基购自Thermofisher，货号为：11811023；
[0130] 鼠CD3抗体来源BD，货号563123；
[0131] 流式细胞仪生产厂家BD，型号为Calibur。
[0132] 实施例1同源重组片段引物设计和PCR扩增
[0133] 根据实验设计方案，设计扩增7段同源重组片断(A1，A2-1，A2-2，A3，B，C1，C2)的引物，引物序列见表1。
[0134] 表1同源重组片段及对应的长度和引物序列
[0135]
[0136]
[0137] 以BAC为模板，使用KOD-plus-聚合酶扩增7段同源重组片断。其中，A1、A3、B、C1、C2选择含有鼠Cd27基因组的BAC为模板，A2-1、A2-2选择含有人CD27基因组的BAC为模板。具体PCR反应体系及反应条件如表2所示。
[0138] 表2PCR反应体系及反应条件
[0139]
[0140] 将PCR扩增得到的产物片断A1，A2-1，A2-2，A3，B，C1，C2回收后直接用于构建同源重组打靶载体。
[0141] 实施例2构建同源重组打靶载体
[0142] 小鼠Cd27基因和人CD27基因对比示意图如图1所示。本发明人设计了图2所示的打靶策略，并显示了打靶载体的设计。小鼠Cd27(基于NM_001033126.2，即SEQ ID NO：15，及其对应蛋白表达NP_001028298.1，即SEQ ID NO：16)共有6个外显子，本发明人将小鼠1-5号外显子(全部或部分)用人CD27基因(基于NM_001242.4即SEQ ID NO：17，及其对应蛋白表达NP_001233.1，即SEQ ID NO：18)片段替换，并在3’UTR后增加neo基因用于阳性克隆筛选。其5’同源臂(SEQ ID NO：19)的长度为4303bp，3’同源臂的长度分别为4742bp(SEQ ID NO：
20)，人DNA片段长度为5810bp(SEQ ID NO：21)。最终期望得到的人源化小鼠CD27基因的CDS区、mRNA序列及其编码的蛋白序列分别如SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24所示。
20)，人DNA片段长度为5810bp(SEQ ID NO：21)。最终期望得到的人源化小鼠CD27基因的CDS区、mRNA序列及其编码的蛋白序列分别如SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24所示。
[0143] 其中，打靶载体构建过程具体如下：
[0144] 1，将片段B使用酶切连接的方式(BamHI/NotI)连接至pBs-Neo载体，得到pBs-Neo-B质粒，送测序公司验证正确；
[0145] 2，片段A1与A2-1；A2-2与A3使用overlap PCR(phusion酶)连接后(反应体系及条件见表3)，送测序公司测序，确认A1+A2-1与A2-2+A3片段连接无误后，再将片段酶切连接至pBs-Neo-B质粒(XhoI/HpaI/EcoRI)，得到pBs-Neo-(A1+A2-1+A2-2+A3+B)质粒；
[0146] 3，将pBs-Neo-(A1+A2-1+A2-2+A3+B)质粒电转化含有人BAC的菌，获得含有AB片段(如图2所示，SEQ ID NO：25)的pBs-Neo-(AB)质粒；
[0147] 4，将pBs-Neo-(AB)质粒电转化含有小鼠BAC的菌，得到含有AB片段的AB重组BAC菌；
[0148] 5，片段C1和片段C2连接至AIO试剂盒中的pDTA-down载体，得到pDTA-down-C质粒，送测序公司验证正确；
[0149] 6，将pDTA-down-C质粒电转化含有AB重组BAC的菌，获得含有5’同源臂、AB片段和3’同源臂(如图2所示)的pDTA-down-ABC质粒。
[0150] 表3PCR反应体系及反应条件
[0151]
[0152]
[0153] 连接片段A1与A2-1时，表3所述引物F为SEQ ID NO：1，引物R为SEQ ID NO：4，模板DNA为实施例1扩增A1片段和A2-1片段的回收产物；连接片段A2-2与A3时，引物F为SEQ ID NO：5，引物R为SEQ ID NO：8，模板DNA为实施例1扩增A2-2片段和A3片段的回收产物；
[0154] 电转化方法：
[0155] 1)电转化感受态细胞的制备：将所述打靶载体构建步骤使用的BAC菌液接种于含对应抗生素(见表4)的LB液体培养基(5mL)中，30℃、250rpm培养12-16小时。第二天，以1：50的比例倒入含对应抗生素(见表4)的LB液体培养基中，30℃、250rpm培养2-3小时，待OD值在0.15～0.2时，取30mL菌液加1.2mL阿拉伯糖(0.4％)，诱导45～60min后将菌液在冰上预冷
30min后，分装到50mL预冷的离心管中，-1℃，5000rpm离心10min后弃上清，再加入预冷的ddH2O(10mL)进行洗涤，-1℃，5000rpm离心10min后弃上清。重复洗涤1次后，将菌液在冰上混匀，制备成感受态细胞。
30min后，分装到50mL预冷的离心管中，-1℃，5000rpm离心10min后弃上清，再加入预冷的ddH2O(10mL)进行洗涤，-1℃，5000rpm离心10min后弃上清。重复洗涤1次后，将菌液在冰上混匀，制备成感受态细胞。
[0156] 2)电转化步骤：取15μL待转线性化质粒(0.2-0.3ng/μL)加入1.5mLEP管，冰上预冷后取85μL感受态细胞转移至此离心管，小心混匀后转移至已预冷的电极杯中。打开预热好的电转仪(厂家及型号：美国BTX，ECM-630)，调节电压为1.3kV，50μF，125Ω。电击结束后立即加入800μL LB液体培养基，混合均匀后全部转至1.5mL EP管，30℃、150rpm轻摇1小时后LB涂板(含相应涂板抗生素，见表4)，30℃倒置培养30小时以上。
[0157] 表4打靶载体构建过程中对应的抗生素
[0158]
[0159]
[0160] pBs-Neo质粒来源：
[0161] pBs-Neo载体图谱参见图4。该质粒骨架来源Agilent，货号212205。由质粒合成公司合成含有frt和neo抗性片段序列(SEQ ID NO：26)的DNA并依次通过酶切(EcoRI/BamHI)连接至骨架载体上，经专业测序公司测序验证，结果表明获得了目的质粒。
[0162] 实施例3载体pDTA-down-ABC的验证
[0163] 随机挑选4个pDTA-down-ABC克隆，使用3组酶进行酶切验证，其中，使用BamHI酶切后应出现6817p+4629bp+3682bp+2952bp+2618bp+1786bp+1035bp，使用XhoI酶切后应出现9976bp+5502bp+4037bp+2210bp+1477bp+317bp，使用EcoRI酶切后应出现8679bp+6589bp+
5033bp+3218bp。酶切结果均符合预期，参见图5，表明所有质粒酶切验证结果正确。其中编号为1-1和2-1的质粒经测序公司测序验证结果正确。
5033bp+3218bp。酶切结果均符合预期，参见图5，表明所有质粒酶切验证结果正确。其中编号为1-1和2-1的质粒经测序公司测序验证结果正确。
[0164] 实施例4C57BL/6小鼠胚胎干细胞的培养、转染及克隆筛选
[0165] 1、胚胎干细胞的培养
[0166] 在铺有饲养细胞的培养皿中培养C57BL/6胚胎干细胞，并置于37℃、5％CO2、饱和湿度的孵育箱培养。所用培养基的成分如下表5所示。
[0167] 表5C57BL/6胚胎干细胞的培养基组成成分
[0168]培养基组成成分 体积
Knockout DMEM 500mL
FBS(胎牛血清) 90mL
MEM NEAA(非必需氨基酸溶液) 6mL
L-谷氨酰胺 6mL
ESGRO LiF(白血病抑制因子) 60μL
β-巯基乙醇 600μL
Knockout DMEM 500mL
FBS(胎牛血清) 90mL
MEM NEAA(非必需氨基酸溶液) 6mL
L-谷氨酰胺 6mL
ESGRO LiF(白血病抑制因子) 60μL
β-巯基乙醇 600μL
[0169] 2、电穿孔转染
[0170] 在转染前确认C57BL/6胚胎干细胞的生长处于良好状态。
[0171] 将长满细胞的100mm培养皿从CO2培养箱中取出后，吸除培养基。加入5mL磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution，PBS)，清洗两遍。每皿加入1.5mL 0.25％胰酶，铺匀后置37℃孵育箱消化3min。每皿加入3.5mL ES培养基终止消化，充分吹打使细胞都处于单个悬浮状态。转入50mL离心管计数细胞。取出1.2×107的细胞悬液加入新50mL离心管中。1200rpm、4℃离心5min。吸走上清，加入适量冰浴的无酚红RPMI，将细胞重悬混匀后转入含打靶DNA的1.5mL无菌离心管中，轻轻混匀。冰水浴5min，转入冰浴的4mm电击杯中。280V，500μF进行电击，记录电击时间10ms。将电击杯冰水浴5min后常温静置5min。将电击杯内的细胞悬液转入含40mL胚胎干细胞培养基的50ml离心管中混匀，均分至4个含MMC饲养细胞的
100mm平皿。标记后37℃、5％CO2孵育箱培养。20小时后更换G418培养基。
100mm平皿。标记后37℃、5％CO2孵育箱培养。20小时后更换G418培养基。
[0172] 3、正负筛选
[0173] 转染细胞培养20小时后，更换G418培养基进行正负筛选。当出现细胞集落时，将细胞集落挑出，转移到96孔板内。待细胞长满后依次转移到48孔、6孔及60mm平皿中，抽提细胞DNA，用PCR和Southern杂交检测外源基因的整合情况筛选出正确重组进重组载体的阳性克隆细胞。
[0174] 实施例5显微注射、胚胎移植及阳性小鼠的鉴定
[0175] 利用显微注射仪将实施例4中筛选鉴定正确的阳性克隆细胞通过显微注射技术注射入BALB/c小鼠的囊胚中。按照《小鼠胚胎操作实验手册(第三版)》中的方法进行显微注射，注射后的囊胚转移至培养液中短暂培养，然后移植至受体母鼠的输卵管，生产嵌合体鼠(F0代)。选取嵌合体鼠与Flp工具鼠交配，产生出灰色和黑色后代(F1代)，将其中黑色小鼠剪尾提取DNA进行PCR分析，用琼脂糖凝胶电泳鉴定其是否为阳性杂合小鼠。F1代基因型鉴定所用引物如表6所示。
[0176] 表6基因型鉴定所用引物序列及长度
[0177]
[0178] 循环参数条件为：
[0179] 95℃ 5min；
[0180] 95℃ 30sec，62℃ 30sec，72℃ 25sec，共35个循环；
[0181] 72℃ 10min；
[0182] 4℃ 10min；
[0183] 其中，引物对WT-F和WT-R用于扩增野生型小鼠Cd27基因5号外显子片段，引物对Mut-F和WT-R用于扩增改造后的5号外显子序列片段，用以验证重组载体是否存在并正确插入基因组位点。引物对Frt-F和Frt-R用以扩增neo片段以验证抗性片段是否去除。引物对Flp-F2和Flp-R2用以确认Flp片段的存在。
[0184] 12只F1代小鼠中，共有6只PCR鉴定为阳性小鼠。6只小鼠的PCR鉴定结果见图6。图中，F1-1、F1-4、F1-7、F1-9、F1-10和F1-12为阳性杂合子小鼠。
[0185] 实施例6基因改造人源化小鼠的表达情况分析
[0186] 选取1只阳性F1代杂合子小鼠，另选2只野生型C57BL/6小鼠作为对照，给小鼠腹腔注射7.5μg鼠CD3抗体，24h后取脾脏，用注射器尾部对脾脏进行研磨，过70μm细胞筛网，将过滤好的细胞悬液离心弃上清，加入红细胞裂解液，裂解5min后加入PBS溶液中和裂解反应，离心弃上清后用PBS清洗细胞1次，分别进行流式分析(FACS)检测和RT-PCR检测。
[0187] FACS检测：用鼠CD27抗体mCD27APC和鼠T细胞表面抗体mTcRβ及人CD27抗体hCD27PE和鼠T细胞表面抗体mTcRβ对胞外蛋白同时进行染色，PBS清洗细胞1次，进行流式检测蛋白表达。流式分析结果(见图7)显示，与未经刺激(图7A、B)和经过鼠CD3抗体刺激(图7C、D)脾脏中T细胞激活后的C57BL/6小鼠相比，鼠CD27抗体可在C57BL/6小鼠和人源化杂合子小鼠体内检测到表达鼠CD27蛋白的细胞(图7A、C、E)，人CD27抗体检测到人源化小鼠脾脏内表达人或人源化CD27蛋白的细胞(图7F)；而在C57BL/6对照鼠的脾脏内未检测到表达人或人源化CD27蛋白的细胞(图7B、D)。
[0188] RT-PCR检测：提取小鼠脾脏细胞RNA，利用逆转录试剂盒逆转录成cDNA，利用引物mCD27RT-PCR F2：5’-CTGCAGGCATTGTAACTCTGGT-3’(SEQ ID NO：35)和mCD27RT-PCR R2：5’-CATGAGGTAAGTGGGTGGGTG-3’(SEQ ID NO：36)扩增大小为194bp的鼠Cd27片段；利用引物hCD27RT-PCR F2：5’-CTACTGGGCTCAGGGAAAGCTG-3’(SEQ ID NO：37)和hCD27RT-PCR R2：5’-ATTGGCAGTGATGGTGCAGTT-3’(SEQ ID NO：38)扩增大小为211bp的人CD27片段。PCR反应体系20μL，反应条件：95℃，5min；(95℃，30sec；60℃，30sec；72℃，30sec，35个循环)；72℃，
10min；4℃保温。GAPDH作为内参。实验结果显示(图8)，野生型C57BL/6小鼠和F1代杂合子小鼠活化细胞中均可检测到鼠Cd27的mRNA表达，F1代杂合子小鼠活化细胞中可检测到人源化CD27的mRNA表达。
10min；4℃保温。GAPDH作为内参。实验结果显示(图8)，野生型C57BL/6小鼠和F1代杂合子小鼠活化细胞中均可检测到鼠Cd27的mRNA表达，F1代杂合子小鼠活化细胞中可检测到人源化CD27的mRNA表达。
[0189] 进一步的，将鉴定为阳性的F1代小鼠互相交配，可得到CD27人源化基因工程小鼠纯合子。按照F1代杂合子小鼠的方法对纯合子进行FACS和RT-PCR检测。FACS结果(图9)显示，可在CD27人源化纯合鼠体内，用人CD27抗体检测到表达人源化CD27蛋白的细胞(图9F)，而在未经刺激的(图9D)或经鼠CD3刺激的C57BL/6小鼠(图9E)体内未检测到人或人源化CD27蛋白的细胞。RT-PCR结果显示(图10)，野生型C57BL/6小鼠活化T细胞中可检测到鼠Cd27的mRNA表达，纯合子小鼠活化细胞中可检测到人源化CD27的mRNA表达而未检测到鼠Cd27的mRNA表达，证实所选小鼠为人源化CD27纯合子小鼠。
[0190] 以上检测表明本方法制备得到的CD27基因改造人源化小鼠可以表达人源化CD27蛋白，并被人CD27抗体识别。该模型小鼠可用于靶向人CD27抗体的筛选和检测。
[0191] 实施例7双重人源化或多重人源化小鼠的制备及鉴定
[0192] 包含人源化CD27基因的小鼠(如利用本方法或制得的CD27基因人源化动物模型)还可以用于制备双重人源化或多重人源化动物模型。如，前述实施例4中，显微注射及胚胎移植过程使用的受精卵细胞选择来源于其它基因修饰小鼠的受精卵细胞进行注射，或对CD27基因人源化小鼠的受精卵细胞进行基因编辑，可以进一步得到CD27人源化与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的小鼠模型。另外，也可将本方法得到的CD27基因人源化模型纯合或杂合子与其它基因修饰纯合或杂合动物模型以自然交配或体外受精(IVF)的方式进行繁殖，对其后代进行筛选，根据孟德尔遗传规律，可有一定几率得到CD27人源化与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的杂合动物模型，再将杂合子相互交配可以得到双基因或多基因修饰的纯合子动物模型。
[0193] 以双重人源化CD27/PD-1小鼠的生成为例，由于小鼠Cd27与Pd-1基因不在同一条染色体上，可通过将CD27基因人源化小鼠与包含人源化PD-1基因的小鼠(如B-hPD-1小鼠)以体外受精(IVF)的方式进行繁殖，通过阳性子代小鼠的筛选和交配扩繁，最终得到双重人源化CD27/PD-1小鼠。
[0194] 分别使用4对引物对双重人源化CD27/PD-1小鼠的鼠尾基因组DNA进行PCR分析，具体序列及产物长度见表7，反应体系和条件见表8、9。多只双重人源化CD27/PD-1小鼠的鉴定结果见图11，其中图11A、B中编号为680-695的小鼠为CD27纯合子小鼠；图11C、D中编号为680-695的小鼠为PD-1纯合子小鼠；综合两组结果表明，编号为680-695的小鼠为双重人源化CD27H/H/PD-1H/H纯合子小鼠。
[0195] 表7鼠尾基因组DNA PCR分析的序列及产物长度
[0196]
[0197]
[0198] 表8PCR反应体系
[0199] 2×Master Mix 10μL上游引物(10μM) 0.5μL
下游引物(10μM) 0.5μL
鼠尾基因组DNA(100-200ng/20mL) 2μL
ddH2O 补至20μL
下游引物(10μM) 0.5μL
鼠尾基因组DNA(100-200ng/20mL) 2μL
ddH2O 补至20μL
[0200] 表9PCR反应条件
[0201]
[0202] 进一步的对双重人源化CD27/PD-1小鼠的表达情况进行检测。选取1只双重人源化CD27/PD-1小鼠纯合子(9周龄)，另选2只野生型C57BL/6小鼠作为对照，小鼠腹腔注射7.5μg鼠CD3抗体，24h后分离脾淋巴细胞进行FACS检测和RT-PCR检测。
[0203] FACS检测：按照实施例6中的方法检测双重人源化CD27/PD-1小鼠体内的CD27蛋白表达。用鼠CD27抗体mCD27APC和鼠源T细胞表面抗体mTcRβPerCP或人CD27抗体hCD27PE和鼠源T细胞表面抗体mTcRβPerCP对T细胞胞外蛋白同时进行染色检测CD27蛋白表达；用鼠PD-1抗体mPD-1PE和鼠T细胞表面抗体mTcRβPerCP或人PD-1抗体hPD-1FITC和鼠T细胞表面抗体mTcRβPerCP对T细胞胞外蛋白同时进行染色检测PD-1蛋白表达。流式分析结果如图12、13显示，与未经刺激和经过鼠CD3抗体刺激脾脏中T细胞激活后的C57BL/6小鼠相比，人CD27抗体和人PD-1抗体可以检测到人源化CD27/PD-1纯合子小鼠脾脏内表达人源化CD27和人源化PD-1蛋白的细胞；而在C57BL/6对照鼠的脾脏内未检测到表达人或人源化CD27，或者人或人源化PD-1蛋白的细胞。
[0204] RT-PCR检测：提取野生型C57BL/6小鼠和双人源化CD27/PD-1纯合子小鼠脾脏细胞总RNA，利用逆转录试剂盒逆转录成cDNA。
[0205] 利用引物mCD27RT-PCR F2(SEQ ID NO：35)和mCD27RT-PCR R2：(SEQ ID NO：36)扩增大小为194bp的鼠CD27片段；利用引物hCD27RT-PCR F2(SEQ ID NO：37)和hCD27RT-PCR R2(SEQ ID NO：38)扩增大小为211bp的人CD27片段；
[0206] 利用引物mPD-1RT-PCR F3：5’-CCTGGCTCACAGTGTCAGAG-3’(SEQ ID NO：42，和mPD-1RT-PCR R3：5’-CAGGGCTCTCCTCGATTTTT-3’(SEQ ID NO：43)扩增大小为297bp的鼠Pd-1片段；
[0207] 利用引物hPD-1RT-PCR F3：5’-CCCTGCTCGTGGTGACCGAA-3’(SEQ ID NO：44)，和hPD-1RT-PCR R3：5’-GCAGGCTCTCTTTGATCTGC-3’(SEQ ID NO：45)扩增大小为297bp的人PD-1片段。
[0208] PCR反应体系20μL，反应条件：95℃，5min；(95℃，30sec；60℃，30sec；72℃，30sec，35个循环)；72℃，10min；4℃保温。使用GAPDH作为内参。
[0209] 实验结果显示(见图14、15)，野生型C57BL/6小鼠活化细胞中可检测到鼠Cd27和Pd-1的mRNA表达，CD27/PD-1纯合子小鼠活化细胞中可检测到人源化CD27和人源化PD-1的mRNA表达。
[0210] 再以双重人源化CD27/PD-L1小鼠的生成为例，由于小鼠Cd27与Pd-l1基因不在同一条染色体上，可通过将CD27基因人源化小鼠与包含人源PD-L1基因的小鼠(如B-hPD-L1小鼠)以体外受精(IVF)的方式进行繁殖，通过阳性子代小鼠的筛选和交配扩繁，最终得到双重人源化CD27/PD-L1小鼠。分别使用4对引物对双重人源化CD27/PD-L1小鼠的鼠尾基因组DNA进行PCR分析，具体序列及产物长度见表10，反应体系和条件见表8、9。多只双重人源化CD27/PD-L1小鼠的鉴定结果见图16，其中图16A、B中编号为6065-6080的小鼠为CD27人源化杂合子小鼠；图16C、D中编号为6065-6080的小鼠为PD-L1杂合子小鼠；综合两组结果表明，编号为6065-6080的小鼠为双重人源化CD27H/+/PD-L1H/+杂合子小鼠。
[0211] 表10鼠尾基因组DNA的PCR分析序列及产物长度
[0212]
[0213]
[0214] 实施例8B-hCD27基因人源化动物模型体内药效验证
[0215] 试验1：取B-hCD27纯合小鼠(4-6周)，皮下接种小鼠结肠癌细胞MC38，待肿瘤体积约100mm3后随机分为对照组或治疗组(n＝5/组)。治疗组随机选择3种人CD-27单克隆抗体(AB-1、AB-2、AB-3，3个抗体均是通过常规方法免疫普通小鼠得到)中的1种，给药剂量均为10mg/kg，对照组注射空白溶剂。给药方式：腹腔注射，每周给药2次，共给药6次。每周测量肿瘤体积2次，接种后单只小鼠肿瘤体积达到3000mm3时执行安乐死。
[0216] 表11中列出了各个实验的主要数据和分析结果，具体包括分组时(第0天)和分组后14天时的肿瘤体积、实验结束时(第21天)的肿瘤体积、小鼠存活情况、无肿瘤小鼠(tumor free)的情况、肿瘤(体积)抑制率(Tumor Growth Inhibition value，TGITV)以及治疗组与对照组的小鼠体重、肿瘤体积之间的统计学差异(P值)。
[0217] 表11肿瘤体积、存活情况及肿瘤抑制率
[0218]
[0219] 整体来看，各组实验过程中，动物健康状态良好。在各实验终点时，各组动物体重增长良好且均无明显区别(图17)，所有治疗组与对照组相比，动物体重和体重变化均无显著差异(图17、18)，表明动物对所述3种抗体耐受良好，这3种抗体未对动物产生明显毒性作用，安全性较好。从肿瘤体积测量结果上看(图19)，对照组小鼠肿瘤在实验周期内均持续生长，而所有治疗组小鼠的肿瘤体积相比对照组均呈现不同程度的缩小(见表11)，实验终点3 3 3
时，各治疗组的小鼠平均肿瘤体积为2286±271mm (G2)，1299±469mm (G3)，1860±541mm(G4)，抗体AB-2(G3)治疗组的肿瘤体积小于最小，表明这3种人CD27单抗在CD27人源化小鼠体内表现出不同的抑制肿瘤生长的效果，且抗体AB-2体内治疗肿瘤效果略优于抗体AB-1、AB-3。证明了B-hCD27小鼠可用于筛选人CD27抗体及体内药效检测，可作为体内研究的活体替代模型，用于人CD27信号通路调节剂的筛选、评估和治疗。
时，各治疗组的小鼠平均肿瘤体积为2286±271mm (G2)，1299±469mm (G3)，1860±541mm(G4)，抗体AB-2(G3)治疗组的肿瘤体积小于最小，表明这3种人CD27单抗在CD27人源化小鼠体内表现出不同的抑制肿瘤生长的效果，且抗体AB-2体内治疗肿瘤效果略优于抗体AB-1、AB-3。证明了B-hCD27小鼠可用于筛选人CD27抗体及体内药效检测，可作为体内研究的活体替代模型，用于人CD27信号通路调节剂的筛选、评估和治疗。
[0220] 试验2：本试验与前述试验方案类似，在本试验中，小鼠皮下接种的细胞选择BALB/c来源的小鼠结肠癌细胞CT26。由于使用的B-hCD27纯合小鼠为C57BL/6背景，接种的CT26细胞应当不易生长或不易成瘤。接种后第3天将小鼠随机分为2组(n＝5/组)。其中1组为给药组，选择人CD-27单克隆抗体Ab-4，给药剂量为3mg/kg，对照组注射空白溶剂。给药方式：腹腔注射，分组后每周给药2次，共给药7次。每周测量小鼠体重2次，给药2周后开始每周测量肿瘤体积2次，接种后单只小鼠肿瘤体积达到3000mm3时执行安乐死。
[0221] 表12中列出了各个实验的主要数据和分析结果，具体包括分组时(第0天)和分组后17天时的肿瘤体积、实验结束时(第20天)的肿瘤体积、小鼠存活情况、无肿瘤小鼠(tumor free)的情况以及治疗组与对照组的小鼠体重、肿瘤体积之间的统计学差异(P值)。
[0222] 表12肿瘤体积、存活情况及肿瘤抑制率
[0223]
[0224] 整体来看，实验过程中各组动物健康状态良好。在各实验终点时，各组动物体重增长良好且均体重无显著性差异(P＞0.05)(图20)，且所有治疗组与对照组相比，动物体重和体重变化均无显著差异(图20、21)，表明动物对Ab-4抗体耐受良好，该抗体未对动物产生明显毒性作用，安全性较好。从肿瘤体积测量结果上看(图22)，对照组小鼠肿瘤在实验周期内变化不大，而给药组小鼠的肿瘤体积在实验周期内均持续生长，实验终点时，对照组有4只小鼠(80％)无肿瘤，给药组仅1只小鼠(20％)为无肿瘤小鼠，对照组小鼠平均肿瘤体积为53±53mm3，给药组的平均肿瘤体积为562±194mm3(G2)，两组瘤体积相比均具有显著的差异(P＜0.05)，表明该人CD-27单克隆抗体Ab-4在CD27人源化小鼠体内表现出明显的促进异源细胞生长的效果。证明B-hCD27小鼠还可用于筛选具有免疫抑制作用的靶向人CD27抗体及其体内药效检测，进一步的证明了CD27人源化小鼠可作为体内研究的活体替代模型，用于靶向人CD27信号通路调节剂的筛选、评估和治疗。以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0225] 另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
[0226] 此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。