RIPK4作为靶位点在制备治疗膀胱癌药物中的应用

摘要

本发明的研究表明，BUC中RIPK4明显上调，RIPK4的表达诱导过度，而沉默RIPK4抑制体外和体内BUC的侵袭和转移。因此，RIPK4可作为靶位点在制备治疗膀胱癌药物中的应用。所述膀胱癌是指BUC。此外，我们证明RIPK4的上调会导致血管内皮生长因子A(VEGF‑A)水平增加。因此，RIPK4在制备靶向负性调控VEGF‑A表达制剂中可应用。同时，VEGF‑A也可作为靶位点在制备治疗膀胱癌药物中应用。

权利要求

1.RIPK4的抑制剂在制备治疗膀胱癌药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述膀胱癌是指BUC。

说明书

RIPK4作为靶位点在制备治疗膀胱癌药物中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物医药技术领域，具体涉及RIPK4作为靶位点在制备治疗膀胱癌药物中的应用。

背景技术

[0002] 膀胱尿路上皮癌(BUC)的发病率和死亡率在中国泌尿生殖系统肿瘤居首。BUC可分为非侵入性和侵入性亚型，后者具有更大的转移风险。转移性BUC仍然是一种致死性疾病，除一线治疗之外几乎没有治疗选择：转移性疾病患者的5年生存率仅为5％。

[0003] 人膀胱肿瘤标本和小鼠模型研究BUC的进展和转移已经涉及多个信号通路。目前，对BUC中调节NF-κB通路的精确分子机制知之甚少。受体相互作用蛋白激酶4(RIPK4)是RIP激酶家族的成员，并且是丝氨酸/苏氨酸激酶。它最初被确定为角质形成细胞分化的重要调节因子，其编码基因在Bartsocas-Papas综合征中突变。最近，一些研究表明，RIPK4在某些类型的癌症如皮肤癌，卵巢癌，宫颈癌和结肠直肠癌中过表达，并且在异种移植肿瘤模型中，RIPK4表达增加促进卵巢癌。然而，RIPK4在BUC中的临床和生物学意义在很大程度上还不清楚。因此，需要广泛调查RIPK4在BUC中的功能。

发明内容

[0004] 本发明旨在提供一种可以用于制备治疗膀胱癌药物的新靶点。

[0005] 本发明通过评估RIPK4对NF-κB激活和BUC进展的影响。我们观察到，BUC中RIPK4明显上调，这种过度表达与BUC患者的生存期和临床病理特征显著相关。RIPK4的过度表达诱导，而沉默RIPK4抑制体外和体内BUC的侵袭和转移。此外，我们证明RIPK4可能通过K63连接，促进肿瘤坏死因子受体相关因子2(TRAF2)，受体相互作用蛋白(RIP)和NF-κB的必需调节因子(NEMO)的多聚泛素化，从而在控制BUC的侵袭和转移中起重要作用。这促进NF-κB-p65的细胞质核转位，使NF-κB活性增加，最终导致血管内皮生长因子A(VEGF-A)水平增加。我们的研究结果表明，RIPK4是BUC在侵袭和转移中的关键参与者，并且RIPK4可成为BUC这种恶性肿瘤患者的新型预后生物标志物和治疗靶标。

[0006] 本发明在25例冷冻保存的膀胱标本和112例BUC石蜡标本中检测RIPK4的表达。进行体内和体外测定来验证RIPK4对NF-κB通路介导的BUC进展的作用。

[0007] 本发明在BUC组织中观察到RIPK4的高表达，并且是总体生存差的独立预测因子。上调或下调RIPK4的表达分别增强或抑制BUC细胞在体外和体内的迁移和侵袭。机制上，RIPK4促进由K63连接的，肿瘤坏死因子受体相关因子2(TRAF2)，受体相互作用蛋白(RIP)和NF-κB必需调节因子(NEMO)的多聚泛素化。RIPK4还促进NF-κB-p65的核定位，并极大维持了NF-κB的活化，导致VEGF-A的上调，最终促进BUC细胞的侵袭性。

[0008] 本发明的数据强调了RIPK4在BUC中的分子病因学和临床的重要性：RIPK4的上调促进NF-κB活化，并上调VEGF-A和促进BUC进展。靶向RIPK4可能是提高BUC患者生存率的一种新的治疗策略。

[0009] 总之，本发明的研究表明，BUC中RIPK4明显上调，RIPK4的过度表达诱导，而沉默RIPK4抑制体外和体内BUC的侵袭和转移。因此，RIPK4可作为靶位点在制备治疗膀胱癌药物中的应用。所述膀胱癌是指BUC。此外，我们证明RIPK4的上调会导致血管内皮生长因子A(VEGF-A)水平增加。因此，RIPK4在制备靶向负性调控VEGF-A表达制剂中可应用。同时，VEGF-A也可作为靶位点在制备治疗膀胱癌药物中应用。

[0010] 下面对本发明做进一步解释和说明：

[0011] 我们的研究表明，NF-κB的激活在BUC进展中是重要的。因此，加强我们对NF-κB信号调节的理解可能会确定BUC治疗的新靶点。在本研究中，观察到RIPK4通过RIP的募集和泛素化促进NF-κB活动。沉默RIPK4显著减少NF-κB活动，而过度表达RIPK4促进NF-κB活动。因此，结果揭示了BUCs中活化NF-κB的新机制。

[0012] 含有N端RIP样激酶结构域和以11个重复锚蛋白为特征的C端区域的RIPK4是调节信号转导的Ser/Thr激酶家族的成员(Meylan等人，2002)。到目前为止，RIPK4在恶性肿瘤发病机制中的作用尚未被广泛研究。Liu和他的同事报道，RIPK4在宫颈鳞状细胞癌中过表达，体外RIPK4敲低减少了细胞迁移和侵袭(Liu等，2015)。类似地，RIPK4在皮肤，卵巢和结直肠癌中过表达(Huang等，2013)。然而，(Adams等人，2007)发现RIPK4在过度增殖的角质上皮细胞中下调(Adams等人，2007)；在肝细胞癌和舌鳞状细胞癌中，RIPK4的表达也下调(Heim等，2015；Wang等，2014)。这些研究中的不一致表明，在不同的肿瘤中，RIPK4具有不同的致癌机制。为了探讨RIPK4作为BUC的治疗靶点的用途，我们观察到BUC细胞系和原代BUC组织中RIPK4水平增加，并且与BUC中的进展和患者存活率正相关。过度表达RIPK4促进BUC的上皮间质转移和入侵/转移，但沉默RIPK4减少BUC的上皮间质转移和入侵/转移。因此，我们的研究结果表明，RIPK4在BUCs中起着致癌基因的作用，并且RIPK4过表达促进BUC进展。

[0013] 然而，RIPK4调节BUC细胞的分子机制转移/入侵尚不清楚。为了更深入地了解RIPK4参与的下游分子过程和BUC的侵袭和转移，使用DNA微阵列技术比较了用shRIPK4或shNC转染的T24细胞之间的全基因表达谱，与迁移和血管生成有关的差异表达的基因中，有17个差异表达≥2倍。随后，使用western印迹分析这17个基因的蛋白质水平。在RIPK4-shRNAT24和RT4细胞中使用western印迹在蛋白质水平验证VEGF-A的这种下调。相比之下，RIPK4的过度表达增加了BIU87细胞中VEGF-A的蛋白质水平。此外，我们观察到我们BUC队列的RIPK4水平和VEGF-A水平之间的显著正相关性。总之，我们的研究结果暗示RIPK4可能通过BUC细胞中VEGF-A调节细胞迁移和侵袭。

[0014] 近来，血管生成被确定为药理学抗BUC策略有效且重要的靶标；例如使用针对VEGF和VEGF受体的单克隆抗体(Vogelzang，2013)。迫切需要发现新的和改进的抗血管生成剂来治疗BUC患者。在本研究中，我们显示RIPK4的过度表达导致BUC细胞中某些已知的促血管生成因子如VEGF-A的上调。这表明RIPK4可能是BUC治疗的一个吸引人的靶标。因此，有必要进一步评估BUC患者血液中RIPK4水平与其存活率之间的相关性。我们的结果表明RIPK4在NF-κB活化中具有重要作用。此外，我们假设RIPK4反应中的NF-κB激活主要由RIP的募集和泛素化所刺激。我们的研究结果显示RIPK4对NF-κB通路激活有很大的影响，提示在不同的细胞类型中NF-κB调控的基因可能有不同的分子机制，这可能取决于细胞的具体情况。我们实验室正在研究RIPK4激活和维持NF-κB活性的机制。

[0015] 总之，我们在BUC中报道了RIPK4的表达模型，并证实了RIPK4在癌症侵袭中的潜在作用。此外，RIPK4的功能和机制研究表明，通过NF-κB通路上调VEGF-A，其在细胞上皮间质转移，侵袭和转移中起关键作用。我们还发现RIPK4的水平与BUC中VEGF-A的水平相关。我们的研究结果显示，RIPK4的高表达是BUC患者新的独立预后因素，使临床医生能够识别需要更强化治疗的高危患者。因此，靶向RIPK4途径可能是BUC或其他癌症患者改善治疗和存活的一种新策略。为了增强我们对癌症进展的生物基础的理解，需要进一步研究RIPK4在人类癌症中的表达机制。

附图说明

[0016] 图1.RIPK4在BUC细胞系和组织中的表达。(A)通过western印迹检测的5个BUC细胞系中RIPK4蛋白的水平。(B)通过qRT-PCR分析分析确定，与来自15位患者的配对的相邻正常膀胱尿路上皮组织标本相比，BUC组织中的RIPK4表达增加。(D)免疫组织化学的典型图像显示在一个BUC组织样品中RIPK4的低表达和在三个BUC组织样品中RIPK4的高表达。原始放大倍数，×200。(E)Kaplan-Meier生存曲线比较所有BUC患者的低和高RIPK4表达水平与累积生存率之间的关系。

[0017] 图2.下调或上调RIPK4的表达分别增强或抑制体外和体内BUC细胞的迁移和入侵能力。(A)用表达RIPK4shRNA-1，shRNA-2，shRNA-3和shRNA-4的慢病毒或对照shRNA感染T24和RT4细胞；蛋白质印迹测量RIPK4蛋白质水平。(B)伤口愈合测定显示与对照细胞相比，RIPK4沉默的T24和RT4细胞具有较低的运动性。(C)Matrigel入侵检测显示，与对照细胞相比，RIPK4沉默的T24和RT4细胞的侵袭能力降低。(D)条件培养基培养沉默RIPK4和对照shNC人脐静脉内皮细胞(HUVEC)典型图像。(E)在严重联合免疫缺陷(SCID-Beige)小鼠体内，沉默RIPK4抑制T24和RT4细胞侵袭和转移。上图：用T24-载体，T24-shRIPK4，RT4-载体，RT4-shRIPK4细胞注射的小鼠的四个肺结节样品进行苏木精和曙红染色的实例。原始放大倍数，×200；下图：尾部注射混和的对照shRNAT24和对照shRNART4，和RIPK4shRNAT24与RIPK4shRNART4细胞后8周，小鼠肺部转移的数目(每组n＝7)，在解剖显微镜下检查结节。对照shRNAT24和RT4细胞(红色；平均值±SEM，T24为13.3±4.1，RT4为14.4±7.0)RIPK4shRNA T24和RIPK4shRNA RT4(蓝色；平均值±SEM，T24为6.2±2.8，RT4为3.4±2.8)。(F)蛋白质印迹显示BIU87-RIPK4细胞中的异位RIPK4表达显著高于BIU87-载体细胞中RIPK4的表达。(G)伤口愈合测定证明BIU87-RIPK4细胞比BIU87-载体细胞具有更高的运动性。(H)细胞侵袭实验(transwell)表明RIPK4的异位过表达增强BIU87细胞的侵袭。(I)用条件培养基培养RIPK4-过表达细胞和载体对照细胞的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的典型图像。(J)体内重度联合免疫缺陷(SCID-Beige)小鼠，其RIPK4的过表达促进BIU87细胞侵袭和转移。上图：BIU87载体和BIU87-RIPK4细胞注射小鼠的四个肺结节样品，用苏木精和伊红染色，原始放大倍数，×200。下图：尾部注射BIU87-载体细胞和BIU87-RIPK4细胞8周，在解剖显微镜下检查小鼠肺部转移结节的数目(每组n＝7)。BIU87-载体细胞(红色；平均值±SEM，3.0±2.2)和BIU87-RIPK4细胞(蓝色；平均值±SEM，平均值±SEM，11.1±4.9)。通过Student's t检验，*P<0.05，**P<0.01。

[0018] 图3.RIPK4调节BUC细胞和组织中的VEGF-A表达。(A)使用DNA微阵列实验，转染T24-shRIPK4与转染对照T24-shNC相比较，差异表达基因(>2倍，P<0.001)根据它们的功能分类。每个类别中的基因用括号括起来。(B)T24-shRIPK4细胞与T24-shNC细胞相比较，CDH1，CD82，HPSE，MMP7，MET，TP53，SMAD2，CD44，FN1，FAT1，ITGB3，KISS1，MMP11，MMP13，VEGF-A，TGFB1和MTSS1这17个与迁移/血管生成相关基因，显示超过2倍的mRNA差异表达。(C)蛋白质印迹分析显示在T24和RT4细胞中通过shRNA转染导致RIPK4沉默，VEGF-A水平降低而CD82水平升高；而在BIU87细胞中，通过pcDNA-RIPK4转染RIPK4异位过表达，VEGF-A水平升高和CD82水平降低。(D)免疫组织化学图像显示了典型BUC组织样品中高表达的RIPK4和高表达的VEGF-A。原始放大倍数，×200。RIPK4和VEGF-A水平呈正相关(P＝0.005)。(E)VEGF-A的上调与BUC患者的存活率低显著相关。

[0019] 图4.特定shRNA沉默VEGF-A或NF-κB-p65后可部分抑制RIPK4介导的BUC的BIU87细胞EMT和入侵/迁移。(A)通过western印迹，测量表达VEGF-A shRNA-1，shRNA-2，shRNA-3和shRNA-4的慢病毒或对照shRNA感染BIU87细胞的VEGF-A蛋白水平。(B)通过western印迹，测量表达NF-κB-p65shRNA-1，shRNA-2，shRNA-3和shRNA-4的慢病毒或对照shRNA感染BIU87细胞的NF-κB-p65蛋白水平。(C)Western blot结果显示沉默RIPK4-BIU87细胞的VEGF-A或NF-κB-p65，细胞核内NF-κB-p65和VEGF-A表达下降。使用β-肌动蛋白作为内部参照。(D)Western blot结果显示，沉默RIPK4-BIU87细胞的VEGF-A或NF-κB-p65沉默后，间充质细胞标志物(波形蛋白和纤连蛋白)水平降低，上皮标志物E-钙粘蛋白和β-catenin)增加。使用β-肌动蛋白作为内部参照。(E)伤口愈合测定显示沉默VEGF-A或NF-κB-p65可抑制RIPK4-BIU87细胞增强的迁移能力。(F)Transwell实验显示shVEGF-A或shNF-κB-p65处理后RIPK4-BIU87细胞的侵袭能力受到显著抑制。三个独立的实验数据，平均值±SE。(G)所示条件培养基培养转导载体，RIPK4，RIPK4shNF-κB-p65，RIPK4shVEGF-A的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，其血管形成实验的典型图像。Student t检验*P<0.05。

[0020] 图5.过度表达RIPK4激活NF-κB信号传导。(A)在所示细胞中分析NF-κB萤光素酶报道基因的活性。每条代表三次独立实验的平均值±SD。(B)EMSA显示在RIPK4转导的细胞中内源性NF-κB活性增加并且在RIPK4沉默的细胞中活性降低。OCT-1-DNA结合复合物作对照。(C)Western印迹所示细胞中核NF-κB-p65，细胞质NF-κB-p65，IKK，p-IKK，IκB和p-IκB水平。
使用β-肌动蛋白作为对照。(D)相对于对照shNC T24和RT4细胞，免疫荧光染色显示shRIPK4T24和RT4细胞中p65水平降低，以及与BIU87-载体细胞相比，BIU87-RIPK4细胞中p65水平升高。Student's t检验，*P<0.05，**P<0.01。

[0021] 图6.RIPK4维持NF-κB激活。(A)RIPK4稳定BUC细胞中的TRAF2，RIP和NEMO含量。(B)用TNF-α(10ng/mL)处理的指定细胞，Western印迹分析K63连接的RIP(上图)，TRAF2(中图)和NEMO(下图)多聚泛素化水平。(C)Western印迹分析TNF-α(10ng/mL)处理的指定细胞中的IκBα表达的水平，使用β-肌动蛋白作对照。

[0022] 图7：BUC细胞系和组织中RIPK4的表达和EMT标志物之间的相关性。(A，B)蛋白质印迹和免疫荧光染色测定显示与那些对照shRNA处理的细胞相比，shRIPK4敲低RIPK4导致T24细胞中上皮生成物(E-钙粘蛋白和β-连环蛋白)水平升高和间充质标志物(波形蛋白和纤连蛋白)水平降低。(C，D)蛋白质印迹和免疫荧光染色测定显示与对照shRNA处理的细胞相比，shRIPK4敲低RIPK4导致RT4细胞中上皮生成物(E-钙粘蛋白和β-连环蛋白)水平增加和间充质标志物(波形蛋白和纤连蛋白)水平降低。(E，F)Western印迹和免疫荧光染色测定显示与BIU87-载体细胞相比，BIU87-RIPK4细胞中的上皮标志物(E-钙粘蛋白和β-连环蛋白)水平降低以及间充质标志物(波形蛋白和纤连蛋白)水平升高。(G)免疫组织化学染色显示BUC组中高水平的RIPK4伴随E-钙粘蛋白和β-连环蛋白水平的降低以及波形蛋白和纤连蛋白水平增加。原始放大倍数，×200。

[0023] 图8：RIPK4/NF-κB/VEGF-A轴在人类BUCs中的临床相关性。(A)EMSA显示NF-κB-DNA复合物；蛋白质印迹显示RIPK4表达；qRT-PCR分析临床样本VEGF-AmRNA的表达。(B)112例人原发BUC标本，RIPK4水平与NF-κB-p65表达正相关，显示两个典型案例。原始放大倍数，×200。(C)p-p65的阳性表达与BUC患者的较差存活显著相关。

[0024] 图9：GEPIA的RIPK4和VEGF-AmRNA表达的分析。(A)在BUC中RIPK4水平与VEGF-A表达正相关。(B)黑素瘤中RIPK4水平与VEGF-A表达正相关。(C)胸腺瘤中RIPK4水平与VEGF-A表达呈正相关。

[0025] 表1显示了BC患者中RIPK4水平与临床病理学变量之间的关系。

[0026] 表2单变量分析112例BC患者生存，显示对BUC生存有影响的变量。

[0027] 表3多变量分析112例BC患者生存，显示对BUC生存有影响的变量。

[0028] 表4显示RIPK4表达水平和EMT maker之间的关系。

[0029] 表5显示17个与转移和血管生成有关差异表达的基因(超过2倍的变化；P<0.001)。

[0030] 表6显示BC患者RIPK4表达与VEGF-A,CD82,NF-κB-p65之间的关系。

具体实施方式

[0031] 下面结合附图和实验数据对本发明做进一步的解释和说明

[0032] 1、载体，逆转录病毒感染和转染

[0033] 通过将PCR扩增的人RIPK4编码序列亚克隆到载体pMSCV(Clontech)中，构建过表达人RIPK4的载体pMSCV/RIPK4。我将四种短发夹RNA(shRNA)寡核苷酸沉默内源性RIPK4克隆到载体pSuper-retro-puro产生pSuper-retro-RIPK4-的shRNA(S)。构建慢病毒ShRNA的NF-κB-p65，构建慢病毒VEGF-A的ShRNA。慢病毒感染后48小时，选择稳定表达RIPK4，RIPK4-ShRNA,NF-κB-p65-ShRNA,and VEGF-A-ShRNA。

[0034] 2、BUC患者RIPK4上调

[0035] 为了评估在BUC中RIPK4的表达模型，我们对包括BIU87,5637，T24，EJ和RT4细胞在内的几种BUC细胞系中的RIPK4蛋白水平进行了分析，发现具有较强的侵袭性的T24，EJ和RT4中RIPK4水平高，而弱侵袭性的BIU87和5637中，RIPK4水平低，(图1A)。对15对人原代BUC组织及其相应的非癌性膀胱尿路上皮组织进行qRT-PCR。与相应的非癌组织相比，在原始BUC的86.7％(13/15)中检测到RIPK4在mRNA水平的过度表达(图1B)。与qRT-PCR分析的结果相一致，western blotting显示，86.7％(13/15)的人原代BUC组织中RIPK4的水平高于相同患者的匹配的非癌组织(图1C)。此外，在接受根治性膀胱切除术的112个临床组织中，使用IHC检测RIPK4的蛋白质水平。IHC结果显示RIPK4蛋白主要存在于癌细胞的细胞质中。在54/112(48.2％)的BUC中观察到RIPK4的水平高，其余58例(51.8％)的RIPK4水平低(图1D)。表1显示了BUC患者中RIPK4水平与临床病理学变量之间的关系。BUCs中高水平的RIPK4与高级别的pT状态(P＝0.003)和pN状态(P＝0.004)显著相关。RIPK4水平与其他临床病理特征无明显相关性，包括患者的年龄，性别，肿瘤大小，肿瘤大小多样性或肿瘤分级。Kaplan-Meier分析显示BUC患者的高水平的RIPK4其总体生存率(OS)较低，(P<0.001，图1E)。

[0036] 在单变量分析中，BUC患者高水平的RIPK4与较低的总体生存率密切相关(P<0.001；补充表S2)。除了RIPK4水平外，还对患者的年龄，患者性别，肿瘤大小，肿瘤多样性，肿瘤分级和肿瘤分期值进行了单变量分析其对总生存率的影响。在单变量分析中显示对患者生存有显著影响的变量列于表2中，进一步进行多变量分析。结果显示高水平RIPK4是BUC患者总体生存率低的独立预测因子(P<0.001；附表S3)。

[0037] 3、下调或上调RIPK4的表达增强或抑制体外和体内BUC细胞的迁移和入侵能力[0038] 为了确定RIPK4在BUC侵袭和转移中的功能，我们构建了转染shRNA或阴性对照shNC至T24和RT4细胞的几种稳定细胞系。在所测试的四种RIPK4shRNA中，ShRNA-3在T24和RT4细胞系中产生最一致的敲低结果，因此被选择用于后续研究(图2A)。伤口愈合和基质胶侵袭实验表明，与对照shNC细胞相比，ShRNA-3转染敲低RIPK4显著降低了T24和RT4细胞的迁移和侵袭能力(图2B和C)。另外，RIPK4-shRNA T24和RIPK4-shRNART4细胞的条件培养基显示出诱导HUVEC的促血管生成能力下降(图2D)。更重要的是，在肺转移体内动物模型，敲低T24和RT4细胞中的RIPK4后，转移结节的大小和数目显著减少(图2E)。这些结果意味着敲低RIPK4抑制BUC细胞的侵袭和转移。为了进一步评估RIPK4在BUC进展中的功能，我们在BUC细胞系BIU87中短暂表达RIPK4。通过蛋白质印迹，在BIU87-RIPK4稳定细胞中发现RIPK4蛋白质的水平高，而在对照组稳定的BIU87-Vector细胞系中RIPK4蛋白质的水平低(图2F)。RIPK4的过表达，使BIU87细胞的迁移和侵袭能力显著增加(图2G和H)。另外，RIPK4转导的BIU87细胞的条件培养基显示诱导HUVEC血管形成的能力增强(图2I)。此外，在体内肺转移动物模型的BIU87细胞中，过度表达RIPK4后其转移结节的大小和数量急剧增加(图2J)。这些结果与敲低RIPK4数据一致，并显示RIPK4促进BUC细胞的侵袭和转移。

[0039] 4、RIPK4上调了VEGF-A的表达

[0040] 为了进一步研究在BUC中RIPK4介导的细胞迁移/侵入的基本分子机制，使用DNA微阵列比较转染了shRNARIPK4和shNC的T24细胞的全基因表达谱。在233个差异表达基因中(超过2倍的变化；P<0.001)，97个上调，136个下调(图3A)。其中有17个基因与转移和血管生成有关(CDH1，CD82，HPSE，MMP7，MET，TP53，SMAD2，CD44，FN1，FAT1，ITGB3，KISS1，MMP11，MMP13，VEGF-A，TGFB1和MTSS1)(图3B和Supplementary Table S5)。Western印迹也显示，使用shRIPK4转染敲低RIPK4显著下调VEGF-A水平，并显著增加T24和RT4细胞中CD82的丰度(图3C)。一致地，通过pcDNA-RIPK4转染BIU87细胞使RIPK4过度表达，显著上调VEGF-A水平，降低CD82水平(图3C)。此外，我们在112例BUC标本上进行了RIPK4和VEGF-A的IHC染色。结果显示，在该BUC组中，RIPK4水平与VEGF-A水平呈正相关(P＝0.005，图3D和补充表6)。然而，低RIPK4和高RIPK4组之间的CD82水平没有显著差异(P＝0.411，补充表6)。重要的是，我们观察到BUC组中较高的VEGF-A水平和较差的存活率之间的关系(P<0.001，图3E)，这与BUC标本中RIPK4的水平较高一致。这些结果表明VEGF-A在RIPK4促进BUC的侵袭和转移中起主要作用。

[0041] 5、VEGF-A介导RIPK4诱导BUC细胞EMT和侵袭/转移

[0042] 为了研究RIPK4和EMT之间的关系，在沉默T24和RT4细胞中的RIPK4后，如western印迹(图7A和C)和免疫荧光染色(图7B和D)所示两种上皮标志物E-钙粘蛋白(E-cadherin)和β-连环蛋白(β-catenin)的蛋白质水平增加，而两种间充质标志物纤连蛋白(fibronectin)和波形蛋白(vimentin)的蛋白质水平降低。相比之下，在BIU87细胞中RIPK4异位过表达后，Western印迹(图7E)和免疫荧光染色(图7F)显示，E-钙粘蛋白和β-连环蛋白水平降低，而纤连蛋白和波形蛋白的纤连蛋白和波形蛋白增加。此外，对112个主要BUC组织进行IHC染色。图7G显示了BUC组织中EMT标志物的典型IHC染色。RIPK4水平与间充质标志物Vimentin(P<0.001)，fibronectin(P＝0.002)呈正相关，与上皮标志物E-cadherin(P<0.001)，β-catenin(P<0.001)呈负相关(表4)这些数据表明，在BUC进展中，RIPK4促成了EMT过程。

[0043] VEGF-A和NF-κB-p65促进RIPK4诱导BUC细胞的EMT。免疫荧光染色显示RIPK4-BIU87T24细胞沉默VEGF-A或NF-κB-p65后，E-cadherin水平升高。免疫荧光染色显示RIPK4-BIU87T24细胞沉默VEGF-A或NF-κB-p65后，β-catenin水平升高。免疫荧光染色显示RIPK4-BIU87T24细胞中沉默VEGF-A或NF-κB-p65后，波形蛋白的水平降低。免疫荧光染色显示RIPK4-BIU87T24细胞沉默VEGF-A或NF-κB-p65后，纤连蛋白水平降低。

[0044] 为了研究在RIPK4诱导BUC细胞的EMT和侵袭/转移是否需要VEGF-A，使用shRNA使BIU87-RIPK4细胞中的VEGF-A表达沉默(图4A和C)。ShVEGF-A处理抑制RIPK4诱导的EMT，如BIU87-RIPK4细胞中上皮标志物(E-钙粘蛋白和β-连环蛋白)丰度上升和间充质标志物(波形蛋白和纤连蛋白)水平降低所示(图4D和图8)。另外，创伤愈合(图4E)，侵袭实验(transwell assays)(图4F)和HUVEC血管形成实验(图4G)表明，VEGF-A沉默后，显著抑制BIU87-RIPK4细胞的迁移和侵袭能力。总之，这些数据提供了证据表明VEGF-A介导RIPK4诱导的EMT和BUC细胞的侵袭/转移。

[0045] 6、过表达的RIPK4激活NF-κB信号

[0046] NF-κB是VEGF-A转录的关键调节因子(Karin和Greten，2005)。因此，我们研究了BUC中RIPK4参与调节NF-κB通路。RIPK4的过度表达显著提高了NF-κB荧光素酶报告基因的活性，而RIPK4的沉默显著降低了报告基因的活性(图5A)。重要的是，在RIPK4沉默的细胞中NF-κB-p65的核水平显著降低，而在RIPK4转导的细胞中则增加(图5B和C)。相比之下，通过免疫荧光染色证明的(图5D)，在BIU87细胞中异位过表达RIPK4后，NF-κB-p65的水平增加，而沉默RIPK4NF-κB-p65的水平减低。为了进一步证实RIPK4介导BUC的EMT和侵袭/转移通过NF-κB活化发生，在RIPK4-过表达细胞中使用靶向编码NF-κB-p65(RELA)，shRNA-NF-κB-p65基因的shRNA(图4B和4C)阻断NF-κB途径。正如所料，shRNA-NF-κB-p65抑制了RIPK4过表达对NF-κB活化的刺激作用(图4C)。此外，正如BIU87-RIPK4中上皮标志物(E-钙粘蛋白和β-连环蛋白)水平升高和间充质标志物(波形蛋白和纤连蛋白)水平降低(图4D和图8)，RIPK4诱导的EMT也被shRNA-NF-κB-p65抑制。此外，通过伤口愈合(图4E)，transwell实验(图4F)和HUVEC血管生成实验(图4G)证实，shRNA-NF-κB-p65减少了RIPK4诱导的侵袭和转移。综上[0047] 所述，我们的结果表明RIPK4的致癌活性依赖于NF-κB的激活。

[0048] 7、RIPK4维持NF-κB激活

[0049] 刺激肿瘤坏死因子(TNF)诱导NF-κB受体复合物中的RIP，TRAF2和NEMO在快速募集和泛素化，该过程对于TNF诱导的NF-κB活化是关键的(Ea等，2006；Wang等al，2001)。与载体对照细胞相比，分离RIPK4过表达细胞的细胞膜，观察到RIP，TRAF2和NEMO的水平显著增加，并且与RNAi载体转导的细胞相比，分离沉默RIPK4细胞的细胞膜，相同蛋白质(RIP，TRAF2和NEMO)的水平显著降低(图6A)。图6B显示RIPK4转导的细胞K63连接RIP，TRAF2和NEMO的多聚泛素化水平高于相应的对照细胞，RIPK4沉默的细胞中K63-多聚泛素化水平低。这表明在NF-κB信号传导中，RIPK4促进泛素共轭结合。NF-κB信号通路可根据不同的诱导因子如TNF和IL-1β进一步细分；因此，我们进一步观察到，TNF-α处理过表达RIPK4细胞的IκB下降水平显著延长，而在RIPK4沉默的细胞中缩短(图6C)。这些结果表明RIPK4通过促进NF-κB信号传导的相关蛋白泛素化结合来维持NF-κB活化。

[0050] 8、人BUC中RIPK4诱导的NF-kB激活的临床相关性

[0051] 最后，我们研究了BUC细胞RIPK4激活NF-κB的临床相关性。EMSA和qRT-PCR结果显示人类BUC的RIPK4水平与NF-κB活性呈正相关，并且与NF-κB下游基因VEGF-AmRNA表达水平呈正相关(图8A)。一致的是，对112个组织标本的IHC分析显示，RIPK4水平与p-p65水平呈正相关(P<0.001；图8B)。重要的是，p-p65的阳性与该BUC队列的生存率差有关(P＝0.001，图8C)。此外，根据标准处理流程，GEPIA(http://gepia.cancerpku.cn)分析TCGA中的23种癌症和正常样品的RNA测序表达数据的结果，BUC(r＝0.2，P＝5.5e-05)，黑色素瘤(r＝0.45，P＝3.5e-05)和胸腺瘤组织(r＝0.73，P＝9.7e-21)中RIPK4的水平与VEGF-A表达水平显著相关(图9)。这些数据支持了我们的假设，即RIPK4过表达激活NF-κB信号转导途径，最终导致侵袭性的BUC表型和BUC的不良临床结果。

[0052] 表1显示了BC患者中RIPK4水平与临床病理学变量之间的关系。

[0053] Supplementary  Table  1.Correlationbetween  RIPK4andthe clinicopathological features of BC

[0054]

[0055]

[0056] Abbreviations:aChi-square test；bmedian age；cmedian size；BC＝bladder urothelial carcinoma；Significant associations are shown in bold face in thep-value column(p-value<0.05).

[0057] 表2单变量分析112例BC患者生存，显示对BUC生存有影响的变量。

[0058]

[0059]

[0060] Abbreviations:amedian age；bmedian size；HR＝hazard ratio；CI＝[0061] confidence interval；BC＝bladder urothelial carcinoma；Significant[0062] associations are shown in bold face in thep-value column(p-value<0.05).

[0063] 表3多变量分析112例BC患者生存，显示对BUC生存有影响的变量

[0064] Supplementary Table3.Multivariate analysis ofsurvival in 112cases of BC

[0065]

[0066] Abbreviations:HR＝hazard ratio；CI＝confidence interval；BC＝bladder urothelial carcinoma；Significant associations are shown in bold face in thep-value column(p-value<0.05).

[0067] 表4显示RIPK4表达水平和EMT maker之间的关系

[0068] Supplementary Table 4.Association between the expression ofRIPK4and EMT markers in BC

[0069]

[0070] Abbreviations:aFisher’s exact test；EMT＝epithelial-mesenchymal transition；BC＝bladder urothelial carcinoma；Significant associations are shown in bold face in the p-value column(p-value<0.05).

[0071] 表5显示17个与转移和血管生成有关差异表达的基因(超过2倍的变化；P<0.001)Supplementary Table 5A list ofdifferentially expressed genes related to migration and angiogenesis ofBC(Fold change>2；P<0.001)

[0072]

[0073] 表6显示BC患者RIPK4表达与VEGF-A,CD82,NF-κB-p65之间的关系

[0074] Supplementary Table6.Associationbetween the expression ofRIPK4and VEGF-A,CD82NF-κB-p65in BC

[0075]

[0076]

[0077] Abbreviations:aFisher’s exact test；BC＝bladder urothelial carcinoma；Significant associations are shown in bold face in thep-value column(p-value<
0.05).