伏马毒素降解酶、编码基因、重组载体、细胞、添加剂及其应用

摘要

本发明涉及生物技术领域，具体涉及伏马毒素降解酶、编码基因、重组载体、细胞、添加剂及其应用，更具体涉及伏马毒素降解酶，该酶具有SEQ ID NO：2所示序列或其突变体，该酶的编码基因，含有该编码基因的载体和细胞，含有该酶和/或细胞和/或其发酵产物的添加剂，该酶、该编码基因、载体、细胞或添加剂在降解伏马毒素和/或其他真菌毒素中的应用，以及降解伏马毒素/或其他真菌毒素的方法。本发明有如下优点：环境友好，可高效短时地对伏马毒素降解，且不产生任何有害副产物。所述酶可耐受高达70℃的高温催化，对pH值的要求也较低，稳定性好，还能够对呕吐毒素和T2毒素一定程度的降解。

权利要求

1.一种伏马毒素降解酶，其特征在于，该降解酶的氨基酸序列为如下（a）或（b）所示的氨基酸序列：（a）SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；

（b）SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的伏马毒素降解酶，其中，所述降解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.一种伏马毒素降解酶的编码基因，其特征在于，该基因的核苷酸序列为编码权利要求1或2所述的伏马毒素降解酶的核苷酸序列。

4.根据权利要求3所述的编码基因，其中，所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。

5.一种重组载体，其特征在于，该重组载体含有权利要求3或4所述的基因。

6.一种重组细胞，其特征在于，该重组细胞含有权利要求3或4所述的基因或者权利要求5所述的重组载体。

7.根据权利要求6所述的重组细胞，其中，所述重组细胞选自大肠杆菌、链霉菌属、汉逊酵母属、木霉属、芽孢杆菌属、乳杆菌属、曲霉属、芽孢杆菌属、木霉属的孢子和曲霉属的孢子中的一种或多种。

8.一种添加剂，其特征在于，该添加剂含有权利要求1或2所述的降解酶，和/或含有权利要求6或7所述的重组细胞和/或其发酵液。

9.根据权利要求8所述的添加剂，其中，所述添加剂还含有地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、两歧双歧杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、乳酸肠球菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、德式乳杆菌乳酸亚种、植物乳杆菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、产朊假丝酵母、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌、嗜热链球菌、罗伊氏乳杆菌、动物双歧杆菌、米曲霉、迟缓芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、纤维二糖乳杆菌、发酵乳杆菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种中的一种或多种。

10.根据权利要求9所述的添加剂，其中，所述添加剂用于青贮饲料，所述添加剂还含有产丙酸杆菌、布氏乳杆菌和副干酪乳杆菌中的至少一种；或者所述添加剂用于肉禽、生长育肥猪和水产养殖动物的饲料，所述添加剂还含有凝结芽孢杆菌和/或侧孢短芽孢杆菌。

11.根据权利要求8所述的添加剂，其中，所述添加剂还含有至少一种生理上可接受的载体；所述生理上可接受的载体选自麦芽糖糊精、石灰石、环糊精、小麦、麦麸、稻米或米糠、蔗糖、淀粉、Na2SO4、滑石粉和PVA中的一种或多种。

12.根据权利要求11所述的添加剂，其中，所述添加剂还含有一种或多种另外的酶。

13.根据权利要求12所述的添加剂，其中，所述一种或多种另外的酶，选自氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶和异构酶中的一种或多种。

14.根据权利要求13所述的添加剂，其中，所述一种或多种另外的酶，选自：黄曲霉毒素去毒酶、玉米赤霉烯酮内酯酶、伏马毒素羧基酯酶、伏马毒素氨基转移酶、氨基多元醇胺氧化酶、脱氧瓜萎镰菌醇环氧化物水解酶、羧肽酶、黑曲霉天冬氨酸蛋白酶PEPAa、黑曲霉天冬氨酸蛋白酶PEPAb、黑曲霉天冬氨酸蛋白酶PEPAc、黑曲霉天冬氨酸蛋白酶PEPAd、弹性蛋白酶、氨基肽酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、淀粉酶、阿拉伯糖酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、凝乳酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、半乳糖苷酶、葡聚糖裂解酶、葡萄糖氧化酶、葡糖醛酸酶、半纤维素酶、己糖氧化酶、漆酶、甘露糖苷酶、果胶酸裂解酶、果胶乙酰酯酶、果胶去聚合酶、果胶甲酯酶、果胶分解酶、植酸酶、多聚半乳糖醛酸酶、鼠李-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、转谷酰胺酶和酸性磷酸酶中的一种或多种。

15.根据权利要求8-14中任一项所述的添加剂，其中，所述添加剂以0.001-10g/kg添加剂的水平含有权利要求1或2所述的降解酶和/或权利要求3或4所述基因编码的蛋白。

16.权利要求1或2所述的降解酶、权利要求3或4所述的基因、权利要求5所述的重组载体、权利要求6或7所述的重组细胞和/或其发酵液或者权利要求8-15中任意一项所述的添加剂在降解伏马毒素中的应用。

17.一种降解伏马毒素的方法，其特征在于，该方法包括：在酶降解反应的条件下，将权利要求1或2所述的降解酶、权利要求6或7所述的重组细胞或者权利要求8-15中任意一项所述的添加剂与待处理的样品接触。

18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述待处理的样品为粮油和/或饲料。

说明书

伏马毒素降解酶、编码基因、重组载体、细胞、添加剂及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种伏马毒素降解酶及其编码基因，含有该编码基因的重组载体和重组细胞，含有所述降解酶和/或所述重组细胞和/或其发酵产物的添加剂，所述降解酶、所述降解酶的编码基因、所述重组载体、所述重组细胞或所述添加剂在降解伏马毒素和/或其他真菌毒素中的应用，以及一种降解伏马毒素/或其他真菌毒素的方法。

背景技术

[0002] 真菌毒素是产毒真菌在危害过程中产生的一类次生代谢物质，主要包括黄曲霉毒素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(又称呕吐毒素，DON)、玉米赤霉烯酮(ZEN)和伏马毒素(FUM)、赭曲霉毒素和T-2毒素等。其中，伏马菌素是一种霉菌毒素，是由串珠镰刀菌产生的水溶性代谢产物，是一类由不同的多氢醇和丙三羧酸组成的结构类似的双酯化合物。主要污染粮食及其制品，并对某些家畜产生急性毒性及潜在的致癌性，已成为继黄曲霉毒素之后的又一研究热点。

[0003] 到目前为止，发现的伏马菌素有FA1、FA2、FB1、FB2、FB3、FB4、 FC1、FC2、FC3、FC4和FP1共11种，其中FB1是其主要组分。FB1对食品污染的情况在世界范围内普遍存在，主要污染玉米及玉米制品。FB1为水溶性霉菌毒素，对热稳定，不易被蒸煮破坏，所以同AFT(黄曲霉毒素)一样，控制农作物在生长、收获和储存过程中的霉菌污染仍然是至关重要。有报道指出，伏马菌素对人、畜不仅是一种促癌物，而且完全是一种致癌物。动物试验和流行病学资料已表明，伏马菌素主要损害肝肾功能，能引起马脑白质软化症和猪肺水肿等，并与我国和南非部分地区高发的食道癌有关，现已引起世界范围的广泛注意。1996年我国对玉米、小麦等粮食作物中FB1 污染进行调查。发现不同地区均有不同程度污染。我国食道癌高发区林县的玉米伏马菌素污染率为48％。因此，人们怀疑该地区食道癌高发与食用污染此毒素玉米相关。

[0004] 1992年和1994年美国和南非的科学家研究表明，每天伏马毒素的摄取量在0.4mg/kg体重以上均可引发猪的肺水肿，还可造成猪生殖系统的紊乱，如早产、流产、死胎和发情周期异常等。这种病在美国及其他国家都有发现，并且容易对当地畜牧业造成较大的影响。

[0005] 1991年南非科研人员对小鼠进行了伏马毒素的毒理试验，试验结果表明，以50mg/kg体重水平饲养小鼠，18-26个月后，发现肝肿瘤患病率急剧上升，这是首次发现伏马毒素引发肝癌的证据。1998年又对大鼠进行了伏马毒素毒理试验，获得相同的结果。

[0006] 早在1988年南非科学家就对食道癌发病率高和低的地区进行过调查，结果发现食道癌高发地区的主食玉米受伏马毒素的污染情况比低发区严重，食道癌发病率与伏马毒素污染呈正相关，进一步的动物试验也得到了相同的结果。1994年中国学者和日本学者对食道癌高发区的河南省林县进行了一次调查，发现该地区主食玉米中伏马毒素水平高达30-50mg/kg，发霉玉米中伏马毒素最高值达118.4mg/kg。

[0007] 目前对于真菌毒素的清除，目前国内外较为普遍的方法主要有物理去除及吸附、化学处理等。吸附剂在吸附毒素的同时还大量吸附了饲料和食品中的微量营养物质，被黏土吸附后的毒素，无法被分解，会引起二次污染。

[0008] 生物降解可以高效将毒素转化为无毒产物、环保安全。已经成为当前真菌毒素削减技术中最有发展前景的处理技术途径，其不仅安全、环保、高效，而且利用现代生物技术开展研究非常符合当前我国节能减排的发展趋势。当前利用真菌毒素污染粮食作为原料发酵生产乙醇是最主要的手段之一，但毒素在发酵生产得到的大量副产物酒糟中被进一步浓缩，大大超过国家限量标准而不能利用。

[0009] 而目前对于伏马毒素的生物脱除的方法或者是去除效率较低，或者是降解时间长，或者是热稳定性以及酸碱稳定性较差，因此亟需开发出一种能够节能环保且高效降解伏马毒素的方法。

发明内容

[0010] 本发明的目的是为了克服现有技术的如上缺陷，提供一种能够高效短时的降解伏马毒素的酶，且该酶具有提高的热稳定性以及耐酸碱性。

[0011] 为了实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种伏马毒素降解酶，其中，该降解酶具有如下(a)和/或(b)所示的氨基酸序列：

[0012] (a)SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；

[0013] (b)SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中第55、91和506位氨基酸残基中的一个或几个经过取代、缺失或添加后仍具有伏马毒素降解酶活性的氨基酸序列。

[0014] 第二方面，本发明还提供了一种伏马毒素降解酶的编码基因，其中，该基因具有编码如上所述伏马毒素降解酶的核苷酸序列。

[0015] 第三方面，本发明还提供了一种重组载体，其中，该重组载体含有如上所述的基因。

[0016] 第四方面，本发明还提供了一种重组细胞，其中，该重组细胞含有如上所述的基因或者如上所述的重组载体。

[0017] 第五方面，本发明还提供了一种添加剂，其中，该添加剂含有如上所述的降解酶和/或含有如上所述的重组细胞和/或其发酵产物。

[0018] 第六方面，本发明还提供了如上所述的降解酶、如上所述的基因、如上所述的重组载体、如上所述的重组细胞和/或其发酵产物或者如上所述的添加剂在降解伏马毒素和/或其他真菌毒素中的应用。

[0019] 第七方面，本发明还提供了一种降解伏马毒素/或其他真菌毒素的方法，其中，该方法包括：在酶降解反应的条件下，将如上所述的降解酶、如上所述的重组细胞和/或其发酵产物或者如上所述的添加剂与待处理的样品接触。

[0020] 本发明具有如下的优点：环境友好，可高效短时地对伏马毒素进行降解，并且不产生任何有害副产物。本发明提供的伏马毒素降解酶可耐受高达70℃的高温，且对pH值的要求也较低，具有稳定性好。另外，本发明的伏马毒素降解酶还能够对呕吐毒素和T2毒素一定程度的降解。

[0021] 本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

具体实施方式

[0022] 以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

[0023] 在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

[0024] 第一方面，本发明提供了一种伏马毒素降解酶，其中，该降解酶具有如下(a)和/或(b)所示的氨基酸序列：

[0025] (a)SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；

[0026] (b)SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中第55、91和506位氨基酸残基中的一个或几个经过取代、缺失或添加后仍具有降解酶活性的氨基酸序列。

[0027] 组成蛋白质的20种氨基酸残基，按照侧链极性可以分成四类：1、非极性的氨基酸：丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)和脯氨酸(Pro)；2、极性不带电荷的氨基酸：甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、天冬氨酸(Asn)、谷氨酰胺(Gln)和酪氨酸(Tyr)；3、带正电荷的氨基酸：精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)和组氨酸(His)；4、带负电荷的氨基酸：天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)(参见“生物化学”(第二版) 上册，沈同、王镜岩，第82-83页，高等教育出版社，1990年12月)。蛋白质中如果发生同属一个类别的氨基酸残基取代，例如由Arg取代Lys或由 Leu取代Ile，所述残基在蛋白质结构域中所起的作用(比如提供正电荷或形成疏水囊袋结构的作用)没有改变，因此对蛋白质的立体结构并不会产生影响，因此仍然可以实现蛋白的功能。所述同属一个类别的氨基酸残基取代可以发生在上述酶的任意一个氨基酸残基位置上。

[0028] 如前所述，本发明提供的酶还可以进行修饰或突变，得到衍生的蛋白质。本发明所述“衍生的蛋白质”指与具有上述氨基酸序列的酶具有氨基酸序列上的差异，也可以有不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白包括天然或诱导的遗传变异体。所述诱导变异体可以通过各种技术得到，如辐射或诱变剂等产生的随机突变，也可以通过如定点突变法或其他已知分子生物学的技术。所述“衍生的蛋白质”还包括具有天然L型氨基酸的残基的类似物(如D型氨基酸)，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β-氨基酸、γ-氨基酸等)的类似物。

[0029] 修饰(通常不改变一级结构，即不改变氨基酸序列)形式包括：体内或体外的蛋白的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的蛋白。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的蛋白。而在本发明中，在所述降解酶的天冬酰胺(Asn)、丝氨酸(Ser)和苏氨酸(Thr)残基任一者处进行N-和/或O-糖基化修饰可以进一步改善溶解性和热稳定性。

[0030] 为了方便纯化，还可以采用本领域常见的标签(如Poly-Arg、Poly-His、 FLAG、Strep-tagⅡ和c-myc中的至少一种)对(a)或(b)进行添加修饰。所述标签不会影响本发明提供的酶的活性，在实际应用过程中，可以根据需求选择是否添加标签。

[0031] 在优选的情况下，所述降解酶具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

[0032] 第二方面，本发明还提供了一种编码伏马毒素降解酶的基因，其中，该基因具有编码上述降解酶的核苷酸序列。

[0033] 本领域公知的是，组成蛋白质的20种不同的氨基酸中，除Met(ATG) 或Trp(TGG)分别为单一密码子编码外，其他18种氨基酸分别由2-6个密码子编码(Sambrook等，分子克隆，冷泉港实验室出版社，纽约，美国，第二版，1989，见950页附录D)。即由于遗传密码子的简并性，决定一个氨基酸的密码子大多不止一个，三联体密码子中第三个核苷酸的置换，往往不会改变氨基酸的组成，因此编码相同蛋白的基因的核苷酸序列可以不同。本领域人员根据公知的密码子表，从本发明公开的氨基酸序列，以及由所述氨基酸序列得到的酶活性不变的氨基酸序列，完全可以推导出能够编码它们的基因的核苷酸序列，通过生物学方法(如PCR方法、突变方法)或化学合成方法得到所述核苷酸序列，因此该部分核苷酸序列都应该包括在本发明范围内。

[0034] 在优选的情况下，所述基因具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。

[0035] 如上所述，相应地，核苷酸序列的5'端和/或3'端还可以连接有本领域常见的标签(如Poly-Arg、Poly-His、FLAG、Strep-tagⅡ和c-myc中的至少一种)的编码序列。

[0036] 本发明提供的核苷酸序列通常可以用聚合酶链式反应(PCR)扩增法、重组法或人工合成的方法获得。例如，本领域技术人员根据本发明所提供的核苷酸序列，可以很容易得到模板和引物，利用PCR进行扩增获得有关序列。

[0037] 一旦获得了有关核苷酸序列，就可以用重组法大批量的获得有关氨基酸序列。通常将所得核苷酸序列克隆入载体，再转入宿主中，然后通过常规的方法从增殖后的宿主细胞分离得到有关核苷酸序列。

[0038] 第三方面，本发明还提供了一种重组载体，其中，该重组载体含有上述基因。

[0039] 在本发明中，所述重组载体可以含有本发明提供的上述基因。重组载体中使用的“载体”可选用本领域已知的各种载体，如市售的各种质粒、粘粒、噬菌体及反转录病毒等，本发明优选使用质粒作为载体。重组载体的构建可以采用能够在载体多克隆位点具有切割位点的各种核酸内切酶(如对于 pUC18，可以使用Sal Ⅰ、BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ等；对于pPICZɑA，可以使用Nde Ⅰ、Nhe Ⅰ、EcoR Ⅰ、Bam H、Hind Ⅲ等；对于PET30a，可以使用BamH I、Hind III、Nde I、Xho I等)进行酶切获得线性质粒，与采用相同核酸内切酶切割的基因片段连接，获得重组质粒。本发明优选采用Nde I 和Xho I双酶切PET30a载体及与其连接的基因片段，经连接酶连接，构建得到重组载体。

[0040] 第四方面，本发明还提供了一种重组细胞，其中，该重组细胞含有上述基因或者上述重组载体。

[0041] 在本发明中，所述细胞可以为含有本发明所述基因的细胞，也可以通过本领域常规的方法将上述重组载体转化、转导或者转染到宿主细胞中以获得的重组细胞，如氯化钙法、化学转化或电击转化，优选电击转化。

[0042] 在本发明一种优选的实施方式中，所述细胞为孢子。应当理解的是，本文所用的术语“孢子”是指真菌或细菌孢子、内孢子或外孢子。

[0043] 根据本发明的细胞可以是任何合适的细胞。更优选地，是任何合适的细菌、真菌或植物细胞。甚至更优选的是，该细胞选自大肠杆菌、链霉菌属 (Streptomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、木霉属(Trichoderma)(特别是里氏木霉(T.reesei))、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、曲霉属(特别是黑曲霉)、植物细胞和/或芽孢杆菌属、木霉属或曲霉属的孢子。

[0044] 第五方面，本发明还提供了一种添加剂，其中，该添加剂含有本发明提供的降解酶，和/或含有上述重组细胞和/或其发酵产物。

[0045] 在优选的情况下，所述添加剂以本发明提供的降解酶作为活性成分。在所述添加剂中，所述降解酶的含量为0.001-10g/kg，优选为0.01-8g/kg，更优选为0.1-5g/kg。另外，所述添加剂中还可以含有本领域技术人员公知的溶剂 (如甘油、糖类和蛋白酶抑制剂等蛋白保护剂)、激动剂等。

[0046] 根据本发明，所述饲料和添加剂中还含有生理学上可接受的载体，其中，所述生理上可接受的载体选自如下物质中的至少一种：麦芽糖糊精、石灰石 (碳酸钙)、环糊精、小麦、麦麸或小麦组分、稻米或米糠、蔗糖、淀粉、 Na2SO4、滑石粉和PVA以及它们的混合物。

[0047] 对本领域技术人员显而易见的是，可将这些添加剂添加至污染有真菌毒素的饲料和/或粮油材料以降低存在的毒素水平。

[0048] 本发明的饲料材料可以包括：a)谷类，例如小粒谷物(如小麦、大麦、裸麦、燕麦以及它们的组合)和/或大粒谷物如玉蜀黍或高粱；b)来自谷类的副产物，例如玉米蛋白粉、干酒糟及可溶物(DDGS)、麦麸、小麦粗粉、小麦次粉、米糠、稻壳、燕麦壳，棕榈仁和柑橘渣；c)青贮饲料；d)得自如下来源的蛋白质：例如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蚕豆、棉花、卡诺拉、鱼粉、干血浆蛋白、肉和骨粉、马铃薯蛋白、乳清、干椰肉、芝麻；e)从植物和动物来源获得的油和脂肪；f)矿物质和维生素。

[0049] 本发明的粮油是指对谷类、豆类等粮食和油料及其加工成品和半成品的统称，特别是指人类可以食用的产品。例如，所述粮油可以为本领域常见的人类可以食用的粮油产品，具体地，所述粮油可以包括谷物及其农副产品、油和脂肪制品、酒类、奶及其制品等中的至少一种。

[0050] 对于本领域技术人员显而易见的是，根据本发明的饲料或添加剂可还包含其他组分如稳定剂和/或增量剂和/或酶类。

[0051] 其中，所述酶可以选自但并不限于：黄曲霉毒素去毒酶、赭曲霉毒素内酯酶、伏马毒素羧基酯酶、伏马毒素氨基转移酶、氨基多元醇胺氧化酶、脱氧瓜萎镰菌醇环氧化物水解酶、羧肽酶、黑曲霉天冬氨酸蛋白酶PEPAa、 PEPAb、PEPAc和PEPAd，弹性蛋白酶、氨基肽酶、胃蛋白酶或胃蛋白酶样蛋白酶、胰蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶、细菌蛋白酶、涉及淀粉代谢、纤维降解、脂质代谢的酶、涉及糖原代谢的蛋白质或酶、淀粉酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯呋喃糖酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、凝乳酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、表异构酶、酯酶、半乳糖苷酶、葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、内切葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶，葡糖苷酶，包括β-葡糖苷酶，葡糖醛酸酶、半纤维素酶、己糖氧化酶、水解酶、转化酶、异构酶、脂解酶、漆酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂解、果胶乙酰酯酶、果胶去聚合酶、果胶甲酯酶、果胶分解酶、过氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、多聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、鼠李-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、非洲甜果素、转移酶、转运蛋白、转谷酰胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶、酸性磷酸酶和它们的组合。

[0052] 优选地，制备根据本发明的添加剂的方法包括混合步骤，该混合步骤包括混合如上所述的降解酶、重组细胞和其发酵产物中的至少一种，任选与至少一种生理上可接受的载体、溶剂、激动剂、稳定剂、增量剂或酶类一起混合。

[0053] 对技术人员显而易见的是，作为预防步骤，可将添加剂添加至任何饲料和/或粮油材料中。

[0054] 例如，当所述添加剂用于养殖动物的饲料时，所述添加剂中还含有地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、两歧双歧杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、乳酸肠球菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、德式乳杆菌乳酸亚种、植物乳杆菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、产朊假丝酵母、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌、嗜热链球菌、罗伊氏乳杆菌、动物双歧杆菌、米曲霉、迟缓芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、纤维二糖乳杆菌、发酵乳杆菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种中的至少一种。

[0055] 例如，当所述添加剂用于青贮饲料或牛饲料时，所述添加剂中还含有产丙酸丙酸杆菌、布氏乳杆菌和副干酪乳杆菌中的至少一种。

[0056] 例如，当所述添加剂用于肉禽、生长育肥猪和水产养殖动物的饲料时，所述饲料或添加剂中还含有凝结芽孢杆菌和/或侧孢短芽孢杆菌。

[0057] 基于如上的描述，本发明还提供了一种粮油或饲料，其中，该粮油或饲料含有上述添加剂。

[0058] 第六方面，本发明还提供了如上所述的降解酶、如上所述的基因、如上所述的重组载体、如上所述的重组细胞和/或其发酵产物或者如上所述的添加剂在降解伏马毒素和/或其他真菌毒素中的应用。

[0059] 根据本发明，所述其他真菌毒素优选为呕吐毒素和T2毒素。

[0060] 第七方面，本发明还提供了一种降解伏马毒素/或其他真菌毒素的方法，其中，该方法包括：在酶降解反应的条件下，将如上所述的降解酶、如上所述的重组细胞和/或其发酵产物或者如上所述的添加剂与待处理的样品接触。

[0061] 根据本发明，所述接触的条件可以包括：温度为20-70℃，pH值为2-9；优选地，温度为30-70℃，pH值为4-8。

[0062] 在本发明中，所述酶降解反应的时间可以为5-60min，优选为10-30min。根据本发明，所述其他真菌毒素优选为呕吐毒素和T2毒素。

[0063] 根据本发明，所述待处理的样品可以为粮油和/或饲料。所述粮油和/或饲料在如上已经进行了详细介绍，此处不再赘述。

[0064] 以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

[0065] 以下实施例和对比例中，伏马毒素A、呕吐毒素和T2毒素标准品购于西格玛公司；

[0066] 按照GB 5009.240-2016标准中的方法通过高效液相色谱法对伏马毒素 FB1进行检测、按照GB/T 30956-2014标准中的方法对呕吐毒素进行检测，按照GB/T 23501-2009标准中的方法对T2毒素进行检测；

[0067] 毒素降解率％＝(反应前样品中毒素的质量-反应后样品中毒素的质量)/ 反应前样品中毒素的质量×100％。

[0068] 实施例1

[0069] 本实施例用于说明本发明提供的降解酶及其制备方法和应用。

[0070] (1)基因的获得

[0071] 通过人工化学合成法合成(委托宝生物工程(大连)有限公司，下同) 如下的核苷酸片段；在SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的5’端添加起始密码子ATG和Nde I酶切位点、3’端终止密码子TAG之前添加Xho I酶切位点。

[0072] (2)重组质粒的构建

[0073] 使用限制性内切酶Nde I和Xho I(购自NEB公司)对PET30a质粒(具有His标签，购于美国Invitrogen公司)进行双酶切，于37℃水浴酶切4h，酶切体系(50μL)如下：

[0074]

[0075] 将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳后，纯化回收。然后，使用T4连接酶 (购于Takara公司)进行连接反应，于室温下连接4h，获得重组质粒。使用的连接体系(10μL)如下：

[0076]

[0077] (3)重组菌株的获得

[0078] 在Bio-Rad Gene Pulse电转仪上使用由步骤(2)获得的重组质粒电转 DH5α感受态细胞(购自Takara公司)，电转化条件为：电压1500V，电容 25μF，电阻200Ω，转化时间随DNA样品的不同而变化，并由仪器自动给出，通常在3.5-4s范围内。然后，将转化后的细胞涂布于含有卡那霉素的LB固体平板上进行筛选，于37℃倒置培养2天，挑取阳性菌落接种于LB液体培养基中，以获得重组菌株。

[0079] 然后使用本领域公知的方法对质粒进行提取，然后委托宝生物工程(大连)有限公司进行测序，结果显示，如上的基因已经成功的转化到大肠杆菌中，表明本发明的重组菌株构建成功。

[0080] (4)酶的制备

[0081] 将得到的重组菌株接种于LB液体培养基(牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，补水至1000mL，115℃灭菌20min备用，pH 7)中，于37℃培养 3天至OD600值在2-6之间，离心收集菌体，用磷酸盐缓冲液(PBS，135mM NaCl，2.7mM KCl，1.5mM KH2PO4，8mM K2HPO4，pH 7.2)溶液悬浮后，超声波破碎，离心取上清获得粗酶液。

[0082] 将粗酶液置于冰上，缓慢加入磨碎的硫酸铵粉末，边加边搅拌，添加到硫酸铵饱和为止。在4℃静置24h左右，12000r/min离心50min，弃上清，用少量PBS(pH 7.2)溶解沉淀。将PBS溶解的沉淀透析，除去硫酸铵，重悬于缓冲液(pH 7.4，50mM NaCl，含10mM咪唑)中。根据表达出的重组酶含有His标签，利用Ni柱进行亲和层析纯化，1mL/min平衡Ni柱后，以流量0.5mL/min直接将重悬的粗酶液上样；继续使用缓冲液(pH 7.4，50mM NaCl，含10mM咪唑)
1mL/min洗脱未吸附或吸附的非特异性杂蛋白；以缓冲液(pH 7.4，50mM NaCl，500mM咪唑)洗脱收集目的蛋白，以获得纯化的酶液。

[0083] (5)温度和pH对酶活性的影响

[0084] 取适量的步骤(4)得到的酶液以及适量的伏马毒素FB1标准品，使用生理盐水以配制使得得到的混合液中，酶的浓度为100ng/ml，伏马毒素FB1 的浓度为1000ppb。反应温度为分别为30℃、37℃、60℃和80℃(pH值4 )，反应的pH值分别为2、3、5、7和9(温度37℃)，反应30min后20μL反应产物进行高效液相色谱检测伏马毒素FB1的残留，并计算降解率。结果如表1和2所示。

[0085] 实施例2

[0086] 本实施例用于说明本发明提供的降解酶及其制备方法和应用。

[0087] 根据实施例1的方法制备降解酶，并测定温度和pH对酶活性的影响，所不同的是，使用SEQ ID NO：3替换SEQ ID NO：1。

[0088] 实施例3

[0089] 本实施例用于说明本发明提供的降解酶及其制备方法和应用。

[0090] 根据实施例1的方法制备降解酶，并测定温度和pH对酶活性的影响，所不同的是，使用SEQ ID NO：4替换SEQ ID NO：1。

[0091] 实施例4

[0092] 本实施例用于说明本发明提供的降解酶及其制备方法和应用。

[0093] 根据实施例1的方法制备降解酶，并测定温度和pH对酶活性的影响，所不同的是，使用SEQ ID NO：5替换SEQ ID NO：1。

[0094] 对比例1

[0095] 本对比例为空白对照

[0096] 根据实施例1的方法制备降解酶，所不同的是，使用未转入基因的空白载体PET30a质粒代替实施例1中使用的重组质粒。

[0097] 对比例2

[0098] 本实施例用于说明本发明提供的降解酶及其制备方法和应用。

[0099] 根据实施例1的方法制备降解酶，并测定温度和pH对酶活性的影响，所不同的是，使用SEQ ID NO：6(来自CN102159706A中的 酶序列)替换 SEQ ID NO：1。

[0100] 表1

[0101]

[0102] 表2

[0103]

[0104] 通过以上实施例的结果可知，本发明提供的伏马毒素降解酶可以高效地降解伏马毒素FB1，并且该酶的稳定性较高，适用于工业化生产。并且，本发明提供的伏马毒素降解酶还具有耐酸和耐高温的特性，这进一步扩大其应用的范围。

[0105] 另外，实验结果显示，本发明提供的SEQ ID NO：1 中55、91和506 位氨基酸残基经取代、缺失或添加(SEQ ID NOs ：3-5)后同样能够有效地对伏马毒素FB1进行降解，另外，经实验证实，本发明提供的伏马毒素降解酶对其他10种伏马毒素的降解效率为伏马毒素FB1的85.6％ - 89％，对于呕吐毒素以及T2毒素的降解效率分别为伏马毒素FB1的75.1％和80.6％。

[0106] 以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

[0107] 另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

[0108] 此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。