本发明涉及一种识别多种有机磷农药的适配体及其应用，其中适配体的核苷酸序列包括序列1：5’‑ATACCAGCTTATTCAATTGTGCAGGGGGAGGG GGATGGTGGCTCGCGGTG CGTGGTGGCTGTAGATAGT AAGTGCAATCT‑3’，以及与序列1同源程度较高的三条适配体序列。以上适配体可以用于识别有机磷农药，其具有较好的广谱性，增大了适配体识别有机磷农药的范围。
适配体的核苷酸序列为：序列1：5’-ATACCAGCTTATTCAATTGTGCAGGGGGAGGGGGATGGTGGCTCGCGGTGCGTGGTGGCTGTAGATAGTAAGTGCAATCT-3’；序列2：5’-ATACCAGCTTATTCAATTGGCGGGGCTACGAAGTAGTGATTTTTTCCGATGGCCCGTGAGATAGTAAGTGCAATCT-3’；序列3：5’-ATACCAGCTTATTCAATTCAACGGAAAACGCGGCGACAACACCATCATCTGCCCCGGTAGATAGTAAGTGCAATCT-3’；序列4：5’-ATACCAGCTTATTCAATTCCACCAACCGCCGAAACTGGAACCACTCAGCGCCCCCACGAGATAGTAAGTGCAATCT-
2.一种根据权利要求1所述的识别多种有机磷农药的适配体的应用，用于识别有机磷农药。
3.根据权利要求2所述的识别多种有机磷农药的适配体的应用，其特征在于：适配体识别的有机磷农药的结构式A为：R1为-CH3或者-CH2CH3；R2为-CH3或者-CH2CH3；R3为或者 中的一种。
4.一种根据权利要求1所述的识别多种有机磷农药的适配体的筛选方法，其特征在于：适配体的筛选方法包括如下步骤：(1)合成随机单链DNA文库的引物：随机文库：5’-ATACCAGCTTATTCAATT-N40-AGATAGTAAGTGCAATCT-3’；引物1：5’-ATACCAGCTTATTCAATT-3’；
引物2：5’-AGATTGCACTTACTATCT-3’；引物2的5’端进行标记；
(2)靶标预处理：靶标和蛋白通过活性酯法偶联制得靶标-蛋白复合物，靶标-蛋白复合物与磁珠通过碳亚二胺法偶联制得靶标-蛋白-磁珠复合物，蛋白与磁珠通过碳亚二胺法偶联制得蛋白-磁珠复合物；
(3)第一轮筛选：初级单链DNA文库中加入靶标-蛋白-磁珠复合物和缓冲液混合、正筛、洗脱；上清液进行PCR扩增，PCR扩增产物用分离柱分离，得到未标记生物素的单链DNA，采用阴阳离子交换柱进行脱盐，得到第一轮筛选产物；
(4)多轮筛选：从第二轮开始，将前一轮筛选产物用缓冲液稀释至200-300nmol/L，并作为下一轮筛选的DNA文库溶液，重复第一轮的筛选步骤；
(5)反筛选：从第五轮开始，每两轮正筛选之后都进行一次反筛选；反筛选的过程为：在上一轮正筛选后的单链DNA中加入蛋白-磁珠复合物，经过磁分离后，上清液进行PCR扩增；
PCR扩增产物用分离柱分离，得到未标记生物素的单链DNA，并用阴阳离子交换柱进行脱盐；
(6)经过若干轮筛选后，能与靶标特异性结合并具有高亲和力的DNA序列为该靶标的核酸适配体；高亲和力的DNA序列与靶标的平衡解离常数在微摩尔至纳摩尔之间。
5.根据权利要求4所述的识别多种有机磷农药的适配体的筛选方法，其特征在于：步骤(3)的具体步骤为：
400-450μL初级单链DNA文库和40-50μL缓冲液混合，在95-97℃加热3-5min，冰浴4-
5min；再加入20-30μL靶标-蛋白-磁珠复合物在室温下混合振荡45-50min制得混合物；
混合物进行磁分离，得到磁珠体系；磁珠体系中加入100-120μL缓冲液，并且在95-97℃下反应15-20min，得到上清液。
6.根据权利要求4所述的识别多种有机磷农药的适配体的筛选方法，其特征在于：步骤(5)的具体步骤为：400-450μL正筛得到的单链DNA和40-50μL缓冲液混合，并且在95-97℃加热3-5min，冰浴4-5min，再加入20-30μL蛋白-磁珠复合物，25-28℃下震荡45-50min制得混合物；混合物进行磁分离，吸取上清液进行PCR扩增。
7.根据权利要求4所述的识别多种有机磷农药的适配体的筛选方法，其特征在于：靶标选择化合物的结构式B为：
R1为-CH3或者-CH2CH3；R2为-CH3或者-CH2CH3；R3为
8.根据权利要求4-7任一项所述的识别多种有机磷农药的适配体的筛选方法，其特征在于：引物2的5’端采用生物素标记。
9.根据权利要求4-7任一项所述的识别多种有机磷农药的适配体的筛选方法，其特征在于：引物1和引物2采用对称PCR扩增，引物1和引物2的比例为1:1。
10.根据权利要求4-7任一项所述的识别多种有机磷农药的适配体的筛选方法，其特征在于：蛋白为牛血清白蛋白、血蓝蛋白或者鸡卵白蛋白中的一种。
一种识别多种有机磷农药的适配体及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物检测有机磷领域，具体涉及一种识别多种有机磷农药的适配体及其应用。
背景技术
[0002] 有机磷农药是广泛应用于防治农作物及其他植物病、虫、害的含有机磷化合物的一类农药的总称。有机磷农药目前在我国是生产和使用最多的一类农药，在农业和种植业中得到了普遍的应用，而且使用量较大，施用频率较高，有较强的急性毒性及潜伏期长的慢性毒性，故而造成的危害也较为严重，同时也会对环境造成污染，以及造成经济上的损失。因此，研发可识别环境中有机磷农药残留的适配体对环境和人类健康的保护具有深远的意义。
[0003] 核酸适配体(aptamer)是指通过指数富集的配体系统进化技术(systematicevolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)体外筛选能与靶标高亲和性和高特异性结合的核糖核酸(RNA)和单链脱氧核糖核酸(ssDNA)。核酸适配体的出现，对于识别环境中有机磷农药残留开辟了新的道路。但是由于农药属于小分子，筛选具有一定的难度。
[0004] 申请日为2015年2月6日、授权公告号为CN104597022B的中国专利所示。该专利公开了一种基于核酸适体的水胺硫磷和丙溴磷的荧光检测方法，其在核酸适体的5’端标记荧光基团FAM的识别水胺硫磷和丙溴磷的35个碱基的单链DNA，对水胺硫磷和丙溴磷进行特异性结合。国内外学者所筛选出的适配体和上述研究相似，通常只对特异性进行了研究，但是大多都不具有广谱性，得不到广泛应用。
发明内容
[0005] 本发明的目的是提供一种识别多种有机磷农药的适配体，其具有较好的广谱性，增大了适配体识别有机磷农药的范围。
[0006] 本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种识别多种有机磷农药的适配体，适配体的核苷酸序列为：序列1：5’-ATACCAGCTTATTCAATTGTGCAGGGGGAGGGGGATGGTGGCTCGCGGTGCGTGGTGGCTGT AGATAGTAAGTGCAATCT-3’；序列2：5’-ATACCAGCTTATTCAATTGGCGGGGCTACGAAGTAGTGATTTTTTCCGATGGCCCGTG AGATAGTAAGTGCAATCT-3’；序列3：5’-ATACCAGCTTATTCAATTCAACGGAAAACGCGGCGACAACACCATCATCTGCCCCGGT AGATAGTAAGTGCAATCT-3’；序列4：5’-ATACCAGCTTATTCAATTCCACCAACCGCCGAAACTGGAACCACTCAGCGCCCCCACG AGATAGTAAGTGCAATCT-3’。
[0007] 进一步地，适配体识别的有机磷农药的结构式A为： R1为-CH3或者-CH2CH3；R2为-CH3或者-CH2CH3；R3为
中的一种。
[0008] 进一步地，适配体的筛选方法包括如下步骤：
[0009] (1)合成随机单链DNA文库的引物：随机文库：5’-ATACCAGCTTATTCAATT-N40-AGATAGTAAGTGCAATCT-3’；引物1：5’-ATACCAGCTTATTCAATT-3’；引物2：5’-AGATTGCACTTACTATCT-3’；引物2的5’端进行标记；
[0010] (2)靶标预处理：靶标和蛋白通过活性酯法偶联制得靶标-蛋白复合物，靶标-蛋白复合物与磁珠通过碳亚二胺法偶联制得靶标-蛋白-磁珠复合物，蛋白与磁珠通过碳亚二胺法偶联制得蛋白-磁珠复合物；
[0011] (3)第一轮筛选：初级单链DNA文库中加入靶标-蛋白-磁珠复合物混合、正筛、洗脱，上清液进行PCR扩增；PCR扩增产物用分离柱分离，得到未标记生物素的单链DNA，采用阴阳离子交换柱进行脱盐，得到第一轮筛选产物；
[0012] (4)多轮筛选：从第二轮开始，将前一轮筛选产物稀释至200-300nmol/L，并作为下一轮筛选的DNA文库溶液，重复第一轮的筛选步骤；
[0013] (5)反筛选：从第五轮开始，每两轮正筛选之后都进行一次反筛选；反筛选的过程为：在上一轮正筛选后的单链DNA中加入蛋白-磁珠复合物，经过磁分离后，上清液进行PCR扩增；PCR扩增产物用分离柱分离，得到未标记生物素的单链DNA，并用阴阳离子交换柱进行脱盐；
[0014] (6)经过若干轮筛选后，能与靶标特异性结合并具有高亲和力的DNA序列为该靶标的核酸适配体；高亲和力的DNA序列与靶标的平衡解离常数在微摩尔至纳摩尔之间。
[0015] 采用以上技术方案，正筛选和反筛选交替进行，并且采用磁珠辅助分离，具有方便快捷，重新分散性好的特点，分离效率更好。并且每一轮的起始浓度相同，利于后续PCR扩增；若每一轮的起始浓度太低，单链DNA浓度较低，影响单链DNA的富集；若每一轮的起始浓度太高，PCR扩增后杂带太多，不利于分离。
[0016] 优选地，步骤(3)的具体步骤为：
[0017] 400-450μL初级单链DNA文库和40-50μL缓冲液混合，在95-97℃加热3-5min，冰浴4-5min；再加入20-30μL靶标-蛋白-磁珠复合物在室温下混合振荡45-50min制得混合物；
[0018] 混合物进行磁分离，得到磁珠体系；磁珠体系中加入100-120μL缓冲液，并且在95-97℃下反应15-20min，得到上清液。
[0019] 优选地，步骤(5)的具体步骤为：400-450μL正筛得到的单链DNA和40-50μL缓冲液混合，并且在95-97℃加热3-5min，冰浴4-5min，再加入20-30μL蛋白-磁珠复合物，25-28℃下震荡45-50min制得混合物；混合物进行磁分离，吸取上清液进行PCR扩增。
[0020] 进一步地，靶标选择化合物的结构式B为： R1为-CH3或者-CH2CH3；R2为-CH3或者-CH2CH3；R3为
[0021] 采用以上技术方案，选择结构式B的化合物作为筛选用靶标，其内部含有羧基，提高靶标与蛋白的有效结合。
[0022] 优选地，引物2的5’端采用生物素标记。
[0023] 优选地，引物1和引物2采用对称PCR扩增，引物1和引物2的比例为1:1。
[0024] 进一步地，蛋白为牛血清白蛋白、血蓝蛋白或者鸡卵白蛋白中的一种。
[0025] 以上各种蛋白与靶标均可以得到较好的结合，优选使用牛血清白蛋白。
[0026] 本发明的另一目的在于提供一种识别多种有机磷农药的适配体，用于识别有机磷农药。
[0027] 综上所述，本发明具有以下有益效果：
[0028] 1、本发明中高通量测序得到的16条适配体序列同源性较高，可以从其中几条序列的亲和性推测所有序列的亲和性程度；
[0029] 2、本发明制得的适配体对有机磷农药的亲和性较高，其Kd值可达到纳摩尔级别；
[0030] 3、本发明制得的适配体具有广谱性，其能够特异性识别具有结构式A为：R1为-CH3或者-CH2CH3；R2为-CH3或者-CH2CH3；R3为
的有机磷农药。
具体实施方式
[0031] 以下结合实施例对本发明作进一步详细说明。
[0032] 以下是通过SELEX技术筛选特异结合部分适配体、制备方法以及快速检出部分适配体与有机磷的解离常数方面的应用。
[0033] 1、合成随机单链DNA文库和引物(生工生物工程(上海)股份有限公司)初级单链DNA文库：5’-ATACCAGCTTATTCAATT-N40-AGATAGTAAGTGCAATCT-3’，构建了长度为76nt的随机单链DNA文库，两端是固定引物序列，中间为40个碱基的随机序列；引物1：5’-ATACCAGCTTATTCAATT-3’；引物2：5’-AGATTGCACTTACTATCT-3’，5’采用生物素标记；
[0034] 将随机单链DNA文库和两种引物用去离子水分别配制成浓度为100μmol/L的溶液备用。
[0035] 2、靶标预处理
[0036] 选择结构式B为 作为靶标，以下命名为OP3，该靶标具有有机磷农药的共有结构。
[0037] 筛选用磁珠为BeaverBeadsTM Mag NH2。
[0038] 用3mLN,N-二甲基甲酰胺中溶解0.4mmolOP3，并加入0.4mmol二环己基碳二亚胺和0.4mmol N-羟基丁二酰亚胺，室温下搅拌活化10h之后离心，得上清液。
[0039] 取0.0012mmol牛血清白蛋白，溶于15mLPBS缓冲液(pH＝7.4,2mmol/L)进行溶解，上述上清液逐滴加入缓冲液中磁力搅拌(350r/min)12h，得到OP3-牛血清白蛋白复合物，并且在4℃下透析纯化三天。
[0040] 0.5mLMES缓冲液、5mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、5mgN-羟基丁二酰亚胺混合，在其中加入0.5mLOP3-牛血清白蛋白复合物反应15min，活化OP3-牛血清白蛋白复合物的羧基。
[0041] 将200μL活化后的OP3-牛血清白蛋白复合物与磁珠振荡反应3小时，使OP3-牛血清白蛋白复合物与磁珠偶联，得到OP3-牛血清白蛋白-磁珠复合物，以下简称OP3-BSA-Beads。
[0042] 采用同样的方法将牛血清白蛋白与磁珠偶联，制得牛血清白蛋白-磁珠复合物，以下简称BSA-Beads。
[0043] 3、SELEX筛选步骤：
[0044] (1)第一轮筛选：
[0045] 取20μLBSA-OP3-beads，用PBS缓冲液清洗BSA-OP3-beads两次。
[0046] 将450μL初级单链DNA文库与50μL10×结合缓冲液(1×结合缓冲液组分为100nmol/L，20nmol/LTris-HCl，pH＝7.6,2nmol/LMgCl2，5nmol/LKCl，1nmol/LCaCl2,0.02％Tween 20)混合，在95℃加热3min，在0℃冰浴5min。加入20μLBSA-OP3-beads，室温下混合振荡45min制得混合物。
[0047] 混合物置于磁力架上进行磁分离，弃去上清液，得到磁珠体系；磁珠体系采用结合缓冲液清洗清洗2次，除去与OP3弱结合的单链DNA。在磁珠体系中加入100μL结合缓冲液在95℃下反应15min，以破坏DNA与磁珠的结合。之后磁吸取上清液，将100μL上清液进行PCR扩增，并进行电泳确认。将PCR产物用分离柱分离，使其从双链DNA变成单链DNA，只保留未标记生物素的单链DNA，将单链DNA用阴阳离子交换柱进行脱盐处理。
[0048] (2)第二轮筛选
[0049] 从第二轮筛选开始，取上一轮筛选得到的解链脱盐后的DNA样品，用结合缓冲液将浓度稀释为250nmol/L，取450μL作为每轮筛选的文库，重复第一轮筛选的步骤。
[0050] (3)反筛
[0051] 将正筛得到的单链DNA样品在95℃加热3min，然后在0℃冰浴5min，之后加入20μLBSA-beads，室温下轻微振荡45min得到混合物。将上述混合物置于磁力架上进行磁分离，磁吸取上清液。将上清液进行PCR扩增，电泳确认。
[0052] 将PCR产物用分离柱分离，使其从双链DNA变成单链DNA，将未标记生物素的单链DNA用阴阳离子交换柱进行脱盐。
[0053] (4)按照上述筛选步骤，进行19轮SELEX筛选过程，从第5轮开始，每经过两轮正筛选进行一次反筛。
[0054] (5)19轮筛选结束后，将每轮筛选遗留下的单链DNA样品调整到浓度为500nmol/L，按照筛选步骤进行结合实验，实验结果如图1所示。图1中每一轮可以和OP3结合的DNA在260nm处进行吸光度表征，每轮的吸光度除第5轮的吸光度为纵坐标，轮数为横坐标，对数据进行logistics拟合。从图1中可以看出，从第14轮开始，吸光度基本水平，选定最优轮数为
14轮。
[0055] 4、高通量测序
[0056] 将第14轮的样品进行PCR扩增，取40μL送往生工生物工程(上海)股份有限公司，利用Illumina公司Miseq平台进行高通量测序，高通量测序结果如表1所示。
[0057] 表1高通量测序结果
[0058] 高通量测序的序列分为以下四组：
[0059] (1)以测序丰度为20596的序列作为参照，其他均是只有1个碱基突变，外加1条2个碱基突变
[0060]
[0061] (2)以测序丰度为140的序列作为参照，其他均是有3-5个碱基突变
[0062]
[0063]
[0064] (3)以测序丰度为121的序列作为参照，另一条有5个碱基突变
[0065]
[0066] (4)其他
[0067]
[0068] 5、二级结构模拟
[0069] 取高通量测序结果中重复数大于30的序列按同源性程度对其进行分组，用mfold对其进行二级结构模拟，对于二级结构相同的序列，选择其中一条测定亲和力，初步选出可用于亲和性测定的序列16条。采用上述选定最优轮数的方法，将浓度为1000nmol/L的16条适配体分别与15μLOP3-BSA-Beads进行结合实验，测定洗脱后的适配体在波长为260nm的吸光度，16条适配体与OP3结合吸光度如图2所示。
[0070] 从16条适配体中选出吸光度较高的4条适配体，并分别命名为PES11(Sequence ID No.1：ATACCAGCTTATTCAATTGTGCAGGGGGAGGGGGATGGTGGCTCGCGGTGCGTGCGTGGTGGCTGTAGATAGTAAGTGCAATCT)、PES19(Sequence ID No.2：ATACCAGCTTATTCAATTGGCGGGGCTACGAAGTAGTGATTTTTTCCGATGGCCCGTGAGATAGTAAGTGCAATCT)、PES20(Sequence ID No.3：ATACCAGCTTATTCAATTCAACGGAAAACGCGGCGACAACACCATCATCTGCCCCGGTAGATAGTAAGTGCAATCT)、PES21(Sequence ID No.4：ATACCAGCTTATTCAATTCCACCAACCGCCGAAACTGGAACCACTCAGCGCCCCCACGAGATAGTAAGTGCAATCT)。
[0071] 6、适配体亲和力分析
[0072] 生工生物工程(上海)股份有限公司分别合成上述四条适配体，并用荧光染料FAM标记，参照最优轮数优化方法，将各适配体分别稀释为以下浓度：250nmol/L、50nmol/L、10nmol/L、2nmol/L、0.4nmol/L、0.08nmol/L，并与15μL BSA-OP3-beads进行实验，得到200μL上清液，得到与OP3结合的DNA。
[0073] 选取空白组为200μL结合缓冲液。
[0074] 使用荧光酶标仪测定上清液在激发波长492nm，发射波长518nm的荧光强度。得到各浓度点的荧光强度，减去空白组的荧光强度，绘制不同浓度适配体对OP3的饱和曲线分别如图3、图4、图5和图6所示，由拟合曲线计算的Kd值如表2所示。
[0075] 表2各适配体与OP3的结合程度
[0076] 适配体 解离常数Kd(nmol/L)PES11 276±13.4
PES19 29±4.57
PES20 28.85±3.30
PES21 45.30±4.24
[0077] 由以上数据可知，以上四种适配体对OP3的亲和性较高，其Kd值可达到纳摩尔级别。
[0078] 7、广谱性分析
[0079] 选取OP3、倍硫磷、对硫磷、甲基对硫磷、杀螟松、丰索磷和辛硫磷标准品作为待测组，将上述七种待测农药采用N,N-二甲基甲酰胺稀释至浓度为20mmol/L，每份待测农药取80μL，加入20μL结合缓冲液，再分别加入100μL浓度为100nmol/L标记有FAM的PES11、PES19、PES20、PES21在室温下反应45min。
[0080] 空白组为80μL N,N-二甲基甲酰胺、20μL结合缓冲液、100μL100nmol/L相对应适配体的混合溶液。四个待测组的适配体与各种农药结合后的荧光强度变化值(相对于空白组)如图7、图8、图9和图10所示。
[0081] 有机磷农药与适配体结合的评定表如表3所示。
[0082] 表3有机磷农药与适配体结合的评定表
[0083]
[0084]
[0085] 结合程度划分的评定标准为：观察反应后对照组相对于空白组的荧光强度变化值，若变化值大于3000，则评定为++；小于3000，评定为+；未下降评定为—。即表2中的各符号中—代表无结合，+代表能结合，++代表结合程度大。
[0086] 由以上数据可知，以上适配体均能识别至少两种农药，尤其PES11则能将OP3、倍硫磷、对硫磷、甲基对硫磷、杀螟松、丰索磷、辛硫磷这七种农药全部识别。说明这四条适配体序列均具有广谱性，可识别多种农药，且PES11的识别范围更广。
[0087] 本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。
