LINC01814在胃癌诊治中的应用

摘要

本发明公开了LINC01814在胃癌诊治中的应用。本发明通过QPCR实验证实了LINC01814在胃癌组织中表达上调，且对LINC01814进行ROC分析，发现使用LINC01814进行诊断具有较高的准确性。本发明通过细胞实验证实了干扰LINC01814的表达可以抑制胃癌细胞的增殖，提示LINC01814可作为药物靶点应用于胃癌患者的个性化治疗。

权利要求

1.检测LINC01814水平的试剂在制备诊断胃癌的产品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术检测样本中LINC01814基因的表达水平的试剂。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂选自：特异性识别LINC01814的探针；或特异性扩增LINC01814的引物。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，特异性扩增LINC01814的引物序列如SEQ ID NO.1 2所示。

~

5.LINC01814的下调剂在制备治疗乳腺癌的药物组合物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述下调剂为siRNA。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.7 8所示。

~

说明书

LINC01814在胃癌诊治中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物医药领域，涉及LINC01814在胃癌诊治中的应用。

背景技术

[0002] 胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，同时肿瘤相关死亡率在全世界排在第三位。尽管随着医学科学的发展、手术方式的改进和医学诊疗技术的提高，许多的胃癌病人能得妥善和规范的治疗，并且已取得较好疗效，但胃癌的早期发现较难、进展期胃癌切除术后复发率和转移率高一直严重影响着胃癌病人的治疗效果与生存期。相对于其他肿瘤而言，胃癌的早期发现比例低，确诊时，进展期高达7％以上，进展期病人即使根治性切除后5年复发率较高。因此，在加强胃癌早期诊断研究的同时，阐述引起胃癌发生及转移的具体机制，建立新的早期胃癌或转移性胃癌的诊断标准，进而探索新的干预措施，防止胃癌的进一步复发及转移，提高胃癌术前术后的治疗效果，增加患者的存活率和生活质量对疾病的治疗和预防具有重大的意义。

[0003] 胃癌的发生、发展与癌基因的异常表达和抑癌基因功能失活相关，胃癌发生及转移等涉及细胞功能紊乱，病毒介导的免疫微环境改变，基质破坏、血管生成等多个环节，包括多因素诱导，多基因参与的复杂病理过程。因此，寻找有效的与胃癌发生或转移相关的基因表达谱及关键蛋白标志，预测其发生是保证临床治疗效果和提高生存率的重要步骤。随着高通量测序技术的发展，研究者已经证实在人类基因组中具有蛋白编码能力的RNA仅占人类基因组5％，但其它95％的非编码区大部分也发生转录，这些转录产物大部分是长链和短链的非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)，并且表明长期以来被认为是垃圾的基因组大部分区域其实有着重要的生物学作用。异常表达的lncRNA可通过不同途径和不同作用机制参与肿瘤的发生、发展、侵袭和转移的各个阶段，是肿瘤进展的关键因素。

[0004] 胃癌早期症状多缺乏特异性，早期病例仅占胃癌手术病例的10％～20％，大约2/3的患者在确诊时已处于中晚期或出现淋巴结、血行转移，其5年生存率仅为20％～30％。尽管专利CN201710300189.X、CN201710069880.1、CN201710069879.9相继公开了lncRNA LINC01234、ENSG00000225521、ENSG00000228742可应用于胃癌的诊断，但是其到临床应用仍需要很长的一段时间，因此寻找新的生物学靶标用于胃癌的癌变监测和干预，对于胃癌的诊断和治疗具有重要的意义。

发明内容

[0005] 为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可用于胃癌诊治的lncRNA生物标志物，本发明所提供的lncRNA生物标志物对于人胃癌具有较高的灵敏度和特异性，可作为新型生物标志物用于胃癌的检测。

[0006] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

[0007] 本发明提供了检测LINC01814水平的试剂在制备诊断胃癌的产品中的应用。

[0008] 进一步，所述产品包括通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术检测样本中LINC01814基因的表达水平的试剂。

[0009] 进一步，所述试剂选自：特异性识别LINC01814的探针；或特异性扩增LINC01814的引物。

[0010] 进一步，特异性扩增LINC01814的引物序列如SEQ ID NO.1～2所示。

[0011] 本发明提供了一种诊断胃癌的产品，所述产品包括检测LINC01814水平的试剂，所述产品包括芯片、制剂或试剂盒。

[0012] 进一步，所述试剂选自：

[0013] 特异性识别LINC01814的探针；或

[0014] 特异性扩增LINC01814的引物。

[0015] 进一步，特异性扩增LINC01814的引物序列如SEQ ID NO.1～2所示。

[0016] 本发明中的芯片可用于检测包括LINC01814基因在内的多个基因(例如，与胃癌相关的多个基因)的表达水平；本发明中的试剂盒可用于检测包括LINC01814基因在内的多个基因(例如，与胃癌相关的多个基因)的表达水平。

[0017] 本发明提供了LINC01814在制备预防或治疗乳腺癌的药物组合物中的应用。

[0018] 进一步，所述药物组合物包括LINC01814的下调剂。

[0019] 所述下调剂选自：以LINC01814或其转录本为靶序列、且能够抑制LINC01814基因表达或基因转录的干扰分子，包括：shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸，或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物。优选的，所述的下调剂为siRNA。

[0020] 本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括LINC01814的下调剂，和/或与所述下调剂相配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。

[0021] 进一步，所述下调剂为siRNA。

[0022] 进一步，所述siRNA具有如SEQ ID NO.7～8所示的序列。

[0023] 本发明的药物还可与其他治疗胃癌的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。

[0024] 本发明的优点和有益效果：

[0025] 本发明首次发现了LINC01814的差异表达与胃癌的发生发展相关，通过检测受试者样本中LINC01814的水平，可以判断受试者是否患有胃癌，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。

附图说明

[0026] 图1是利用QPCR检测LINC01814基因在胃癌组织中的表达情况图；

[0027] 图2是利用QPCR检测LINC01814在不同胃癌细胞中的表达情况图；

[0028] 图3是利用QPCR检测LINC01814基因过表达载体对胃癌细胞中该基因表达水平的影响图；

[0029] 图4是用MTS法检测LINC01814基因对胃癌细胞增殖的影响图。

[0030] 具体的实施方式

[0031] 本发明经过广泛而深入的研究，通过高通量方法，检测胃癌组织和癌旁组织中lncRNA的表达水平，发现其中具有明显表达差异的lncRNA，探讨其与胃癌的发生发展之间的关系，从而为胃癌的早期检测及靶向治疗寻找更好的途径和方法。通过筛选，本发明首次发现了胃癌中LINC01814显著性上调。实验证明，siRNA干扰LINC01814，能够有效地抑制胃癌细胞的增殖，为胃癌的个性化治疗提供了新途径。

[0032] 生物标志物

[0033] 术语“生物标志物”是其在组织或细胞中的表达水平与正常或健康细胞或组织的表达水平相比发生改变的任何基因。

[0034] 本领域技术人员将认识到，本发明的实用性并不局限于对本发明的标志物基因的任何特定变体的基因表达进行定量。作为非限制性的实例，标志物基因的序列如目前国际公共核酸数据库GeneBank中LINC01814基因(NR_110257.1)所示。本发明中的LINC01814包括野生型、突变型或其片段。

[0035] 本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录水平上检测生物标志物的表达水平。

[0036] 在一些实施方案中，在转录水平上检测生物标志物的表达水平。利用核酸杂交技术进行具体DNA和RNA测量的多种方法是本领域技术人员已知的。一些方法涉及电泳分离(例如，用于检测DNA的Southern印迹和用于检测RNA的Northern印迹)，但是也可以在不利用电泳分离的情况下进行DNA和RNA的测量(例如，通过斑点印迹)。基因组DNA(例如，来自人)的Southern印迹可用于筛选限制性片段长度多态性(RFLP)，以检测影响本发明多肽的遗传病症的存在。可以检测所有形式的RNA。

[0037] 芯片

[0038] 本发明的所述的lncRNA芯片包括：固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于LINC01814所示的部分或全部序列。

[0039] 具体地，可根据本发明所述的lncRNA，设计出适合的探针，固定在固相载体上，形成“寡核苷酸阵列”。所述的“寡核苷酸阵列”是指具有可寻址位置(即以区别性的，可访问的地址为特征的位置)的阵列，每个可寻址位置均含有一个与其相连的特征性寡核苷酸。根据需要，可将寡核苷酸阵列分成多个亚阵。

[0040] 术语“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严格性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。

[0041] 术语“互补的”或“互补性”用于指代通过碱基配对原则相关的多核苷酸(即，核苷酸的序列)。例如，序列“5'-A-G-T-3'”与序列“3'-T-C-A-5'”互补。互补性可以是“部分的”，其中只有一些核酸的碱基根据碱基配对原则匹配。或者，也可在核酸之间存在“完全”或“总”互补性。核酸链之间的互补程度对于核酸链之间的杂交效率和强度具有显著的影响。这在扩增反应以及依赖核酸之间的结合的检测方法中尤其重要。

[0042] 本发明中针对LINC01814基因的寡核苷酸探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。

[0043] 本发明中所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料，例如但不限于尼龙膜，经活性基团(如醛基、氨基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。

[0044] 所述的LINC01814芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法。例如，如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5’端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的lncRNA芯片。

[0045] 本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒可用于检测LINC01814的表达。

[0046] 优选的，所述的制剂或试剂盒中还含有用于标记RNA样品的标记物，以及与所述标记物相对应的底物。此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取RNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液等。此外，所述的试剂盒中还包括使用说明书和/或芯片图像分析软件。

[0047] LINC01814的下调剂和药物组合物

[0048] 基于发明人的发现，本发明提供了一种LINC01814的功能性表达下调剂，所述下调剂的性质对本发明来说并不重要，只要它抑制LINC01814基因的功能性表达即可，这些下调剂作为对于下调LINC01814有用的物质，可用于预防或治疗胃癌。

[0049] 在本发明中，关于LINC01814的“功能性表达”，意指功能性基因产物的转录和/或翻译。对于像LINC01814的非蛋白编码基因，“功能性表达”可以在至少两个水平上失调。第一，在DNA水平上，例如通过基因的缺失或破坏，或者是没有转录发生(在两种情况下都阻止相关基因产物的合成)。转录的缺失可以例如由表观遗传的变化(例如DNA甲基化)或由功能缺失性突变导致。。如本文中所使用的“功能缺失”或“LOF”突变是，相对于赋予蛋白质增强的或新的活性的功能获得性突变而言，阻止、减少或消除基因产物的功能的突变。功能性缺失可由广泛的突变类型引起，包括但不限于整个基因或基因部分的删除、剪接位点突变、由小的插入和删除引起的移码突变、无义突变、取代了必需氨基酸的错义突变、和阻止产物的正确细胞定位的突变。该定义也包括LINC01814基因的启动子或调控区域的突变，如果这些突变干扰了基因的功能。无效突变是完全破坏基因产物功能的LOF突变。一个等位基因中的无效突变通常将使表达水平降低50％但可能对基因产物的功能具有严重影响。值得注意的是，功能性表达也可以因为功能获得性突变而失调：通过赋予蛋白质新的活性，蛋白质的正常功能失调，表达的功能活性蛋白减少。反之亦然，功能性表达可以例如通过基因复制或通过缺乏DNA甲基化而增加。功能性表达也可以因为功能获得性突变而失调：通过赋予蛋白质新的活性，蛋白质的正常功能失调，表达的功能活性蛋白减少。反之亦然，功能性表达可以例如通过基因复制或通过缺乏DNA甲基化而增加。

[0050] 第二，在RNA水平上，例如通过缺乏有效的翻译，例如因为mRNA的不稳定(例如通过UTR变体)，可以导致在转录物翻译之前mRNA被降解。或者通过缺乏有效的转录，例如因为突变诱导了新的剪接变体。

[0051] 作为本发明的一种优选方式，所述LINC01814的下调剂是一种LINC01814特异性的小干扰RNA分子。如本文所用，所述的“小干扰RNA”是指一种短片段双链RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA，这个过程就是RNA干扰(RNA interference)过程。小干扰RNA可以制备成双链核酸的形式，它含有一个正义链和一个反义链，这两条链仅在杂交的条件下形成双链。一个双链RNA复合物可以由相互分离的正义链和反义链来制备。因此，举例来讲，互补的正义链和反义链是化学合成的，其后可通过退火杂交，产生合成的双链RNA复合物。

[0052] 在筛选有效的siRNA序列时，本发明人通过大量的比对分析，从而找出最佳的有效片段。本发明人设计合成了多种siRNA序列，并将它们分别通过转染试剂转染胃癌细胞系进行验证，选出干扰效果最佳的siRNA，进一步地在细胞水平实验，结果证明对于该siRNA在能有效的抑制细胞中LINC01814基因的水平，以及胃癌细胞的增殖。

[0053] 本发明的核酸抑制物如siRNA可以化学合成，也可以通过一个重组核酸结构里的表达盒转录成单链RNA之后进行制备。siRNA等核酸抑制物，可通过采用适当的转染试剂被输送到细胞内，或还可采用本领域已知的多种技术被输送到细胞内。

[0054] 药物组合物

[0055] 本发明中的药物组合物包括LINC01814的下调剂、和/或与所述下调剂配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。

[0056] 术语“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、缓冲液。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。所述的载体中还可以含有细胞转染试剂。

[0057] 本发明中，可以采用本领域熟知的多种方法来将所述的下调剂、或其药物组合物给药于哺乳动物。包括但不限于：皮下注射、肌肉注射、经皮给予、局部给予、植入、缓释给予等；优选的，所述给药方式是非肠道给予的。

[0058] 优选的，可采用基因治疗的手段进行。比如，可直接将LINC01814的下调剂通过诸如注射等方法给药于受试者；或者，可通过一定的途径将携带LINC01814的下调剂的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，具体情况需视所述的下调剂的类型而定，这些均是本领域技术人员所熟知的。

[0059] 本发明所述的LINC01814的下调剂的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的LINC01814的下调剂的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。

[0060] 术语“样本”以其最广泛的含义使用。在一种含义中，意在包括从任何来源获得的标本或培养物，以及生物和环境样本。生物样本可获自动物(包括人)并涵盖液体、固体、组织和气体。生物样本包括血液制品，诸如血浆、血清等。然而，此类样本不应解释为限制适用于本发明的样本类型。

[0061] 本发明的药物还可以以单独的组合物或与主要的活性成分不同的剂量形式单独给予其它治疗性化合物。主要成分的部分剂量可以与其它治疗性化合物同时给药，而其它剂量可以单独给药。在治疗过程中，可以根据症状的严重程度、复发的频率和治疗方案的生理应答，调整本发明药物组合物的剂量。

[0062] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

[0063] 实施例1筛选与胃癌相关的基因标志物

[0064] 1、样品收集

[0065] 分别收集8例胃癌癌旁组织和胃癌组织样本全部病例在手术前均未接收化疗和放疗，所有的患者均已知情同意，并取得均通过组织伦理委员会的同意。

[0066] 2、RNA样品的制备

[0067] 利用QIAGEN的组织RNA提取试剂盒进行组织RNA的提取，按说明书的具体步骤进行操作。

[0068] 3、总RNA定量与纯度分析

[0069] 使用Bio-Red紫外分光光度计测定总RNA在280nm和260nm处的光密度值，当OD260/OD280的值在1.8～2.0时认为总RNA的纯度是可靠的，用于下一步的实验。

[0070] 4、lncRNA表达芯片分析

[0071] 利用Arraystar公司的Arraystar Human 1ncRNA Array检测胃癌组织和癌旁组织中lncRNA表达谱的差异。Arraystar 1ncRNA芯片设计探针为60nt长度的寡核苷酸，这些长寡核苷酸探针在高度严格的杂交条件下可以得到高灵敏度及特异性的理想实验结果。针对每条序列都设计了多条探针，增加了信号的可靠度。

[0072] 5、数据分析

[0073] 利用Agilent GeneSpring软件对芯片结果进行分析，筛选表达量具有显著性差异(标准为该lncRNA在癌与癌旁的表达量相差2倍以上，而且p<0.05)的lncRNA。

[0074] 6、结果

[0075] 结果显示，LINC01814在胃癌组织中的水平显著高于癌旁组织中的水平，差异具有统计学意义(P<0.05)。

[0076] 实施例2 QPCR测序验证LINC01814基因的差异表达

[0077] 1、对LINC01814基因差异表达进行大样本QPCR验证。按照实施例1中的样本收集方式选择胃癌癌旁组织和胃癌组织各50例。

[0078] 2、RNA提取

[0079] 利用QIAGEN的组织RNA提取试剂盒进行组织RNA的提取，按说明书的具体步骤进行操作。

[0080] 3、逆转录

[0081] 1)反应体系：

[0082] RNA模板1μl，随机引物1μl，双蒸水加至12μl，混匀，低转速离心，65℃5min，冰上冷却，继续加入下列成分：5×反应缓冲液4μl，RNA酶下调剂(20U/μl)1μl，10mM dNTP混合液2μl，AMV反转录酶(200U/μl)1μl；充分混匀并进行离心处理；

[0083] 2)逆转录反应条件

[0084] 25℃5min，42℃60min，70℃5min，4℃保温60min。

[0085] 3)聚合酶链反应

[0086] 引物设计：

[0087] 根据Genebank中LINC01814基因和GAPDH基因的序列设计QPCR扩增引物，由上海生物工程有限公司合成。具体引物序列如下：

[0088] LINC01814基因：

[0089] 正向引物为5’-CCATATCCTTGCCAATACA-3’(SEQ ID NO.1)；

[0090] 反向引物为5’-CCACCATCACCAATAATCA-3’(SEQ ID NO.2)。

[0091] GAPDH基因：

[0092] 正向引物为5’-AATCCCATCACCATCTTCCAG-3’(SEQ ID NO.3)；

[0093] 反向引物为5’-GAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3’(SEQ ID NO.4)。

[0094] 配制PCR反应体系：

[0095] 2×qPCR混合液12.5μl，基因引物2.0μl，反转录产物2.5μl，ddH2O 8.0μl。

[0096] PCR反应条件：95℃10min，(95℃15s，60℃60s)×40个循环，60℃5min延伸反应。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。

[0097] 4、ROC曲线分析

[0098] 使用R语言中的pROC包分析LINC01814的受试者工作特征，计算二项精确置信空间，绘制ROC曲线。

[0099] 5、统计学方法

[0100] 实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，癌与癌旁组织的配对比较采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

[0101] 6、结果

[0102] 结果如图1所示，与胃癌癌旁组织相比，LINC01814在胃癌组织中表达上调，差异具有统计学意义(P<0.05)，同芯片检测结果一致；ROC分析结果显示，LINC01814的ROC曲线下面积(AUC)的值高达0.910125，提示LINC01814作为生物标志物应用于胃癌的临床诊断具有较高的准确性。

[0103] 实施例3 LINC01814在胃癌细胞中的表达情况

[0104] 1、细胞培养

[0105] 人永生化胃粘膜上皮细胞系GES-1、人胃癌细胞系HGC-27、MGC-803、AGS(均购自广州莱德尔生物科技有限公司)在含10％胎牛血清和1％P/S的RPMI1640培养基于37℃、5％CO2、相对湿度为90％的培养箱中培养。2-3天换液1次，使用0.25％含EDTA的胰蛋白酶常规消化传代，取处于对数生长期的细胞用于实验。

[0106] 2、RNA的提取

[0107] 使用QIAGEN细胞RNA提取试剂盒提取细胞中的总RNA，具体步骤详见说明书。

[0108] 3、逆转录

[0109] 具体步骤同实施例2.

[0110] 4、统计学方法

[0111] 实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

[0112] 5、结果

[0113] 结果如图2所示，与胃粘膜上皮细胞相比，LINC01814基因在胃癌细胞HGC-27、MGC-803、AGS中表达均上调，差异具有统计学意义(P<0.05)，其中在HGC-27细胞中的差异最为显著，因此选择HGC-27细胞进行后续的实验研究LINC01814对胃癌细胞的作用。

[0114] 实施例4 LINC01814基因的沉默

[0115] 1、细胞培养步骤同实施例3

[0116] 2、siRNA的设计

[0117] 针对LINC01814基因的序列设计siRNA，设计的siRNA序列如下所示：

[0118] 阴性对照siRNA序列(siRNA-NC)：

[0119] 正义链：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’(SEQ ID NO.5)，

[0120] 反义链：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3’(SEQ ID NO.6)；

[0121] siRNA1：

[0122] 正义链：5’-UUUGCUUUCGCGAAGUAGGAG-3’(SEQ ID NO.7)，

[0123] 反义链：5’-CCUACUUCGCGAAAGCAAAAC-3’(SEQ ID NO.8)；

[0124] siRNA2：

[0125] 正义链：5’-UUAGGAAUAAAUUCCAAUCUC-3’(SEQ ID NO.9)，

[0126] 反义链：5’-GAUUGGAAUUUAUUCCUAAGC-3’(SEQ ID NO.10)；

[0127] siRNA3：

[0128] 正义链为5’-UUUGAACAAUCUAGAAGACAC-3’(SEQ ID NO.11)，

[0129] 反义链为5’-GUCUUCUAGAUUGUUCAAAGA-3’(SEQ ID NO.12)

[0130] siRNA4：

[0131] 正义链为5’-ACUCAUUGAAGACUUGUUCUA-3’(SEQ ID NO.13)，

[0132] 反义链为5’-GAACAAGUCUUCAAUGAGUGC-3’(SEQ ID NO.14)

[0133] 3、转染

[0134] 将HGC-27细胞按2×105/孔接种到六孔细胞培养板中，在37℃、5％CO2培养箱中细胞培养24h；在无双抗、含10％FBS的DMEM培养基中，转染按照脂质体转染试剂3000(购自于Invitrogen公司)的说明书转染。

[0135] 实验分为空白对照组(HGC-27)、阴性对照组(siRNA-NC)和实验组(siRNA1、siRNA2、siRNA3、siRNA4)，其中阴性对照组siRNA与LINC01814基因的序列无同源性，浓度为20nM/孔，同时分别进行转染。

[0136] 4、QPCR检测LINC01814基因的转录水平

[0137] 4.1细胞总RNA的提取

[0138] 使用QIAGEN细胞RNA提取试剂盒提取细胞中的总RNA，具体步骤详见说明书。

[0139] 4.2逆转录步骤同实施例2。

[0140] 4.3 QPCR扩增步骤同实施例2。

[0141] 5、统计学方法

[0142] 实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件进行统计分析。

[0143] 6、结果

[0144] 结果如图3显示，与HGC-27和转染空载siRNA-NC组相比，实验组(siRNA1～4)能降低LINC01814的水平，其中siRNA1能显著降低LINC01814的水平，因此选择siRNA1进行后续实验。

[0145] 实施例5 LINC01814基因对胃癌细胞增殖的影响

[0146] 采用MTS实验检测LINC01814基因对胃癌细胞增殖能力影响。

[0147] 1、细胞培养与转染步骤同实施例4。

[0148] 2、各组处理的细胞经胰酶消化后重悬细胞、计数，调整细胞浓度为l×105/ml[0149] 按100μL/孔的密度接种于96孔板，即每孔细胞数为1×104个。

[0150] 3、待细胞到达相应的检测时间点(0d、24h、48h、72h、96h)后，按10μL/孔加入CelITiter96AQ单溶液细胞增殖检测(MTS)试剂，微量振荡器振荡1～2min；置于5％CO2、37℃的细胞培养箱中孵育4h。

[0151] 4、酶标仪读板，在490nm波长测定其吸光度(A)值。

[0152] 5、统计学分析

[0153] 实验都是按照重复3次来完成的，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

[0154] 6、结果

[0155] 结果如图4所示，与对照相比，实验组(siRNA1)的细胞生长速度明显低于对照组的细胞的生长速度，差异具有统计学意义(P<0.05)，上述结果表明LINC01814的过表促进胃癌细胞的增殖。

[0156] 上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。