能够结合肺特异X蛋白的抗体或抗体片段及其用途

摘要

本发明涉及抗体领域，公开了一种能够结合肺特异X蛋白的抗体或抗体片段及其用途。本发明的抗体或抗体片段包括重链CDR氨基酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3以及轻链CDR氨基酸序列SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6；或包括重链CDR氨基酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：3以及轻链CDR氨基酸序列SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。本发明的抗体或抗体片段能介导多种抗肿瘤机制，抗肿瘤效果较佳。本发明还得到了特异性和抗肿瘤活性仍保持在较佳水平的嵌合抗体。

权利要求

1.一种能够结合肺特异X蛋白的抗体或抗体片段，其特征在于，该抗体或抗体片段包括重链CDR氨基酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：3以及轻链CDR氨基酸序列SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。

2.根据权利要求1所述的抗体或抗体片段，其中，所述抗体或抗体片段能够结合SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的抗体或抗体片段，其中，所述抗体或抗体片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示；

所述抗体或抗体片段的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示。

4.一种组合物，其特征在于，该组合物含有权利要求1-3中任意一项所述的抗体或抗体片段以及药学上可接受的载体。

5.一种用于检测样品中肺特异X蛋白的试剂盒，该试剂盒含有权利要求1-3中任意一项所述的抗体或抗体片段。

6.权利要求1-3中任意一项所述的抗体或抗体片段在制备用于检测样品中肺特异X蛋白的试剂中的用途。

7.权利要求1-3中任意一项所述的抗体或抗体片段在制备用于抑制癌细胞的药物中的用途，所述癌细胞为肺癌细胞。

8.权利要求1-3中任意一项所述的抗体或抗体片段在制备用于抑制癌细胞的药物中的用途，所述癌细胞为非小细胞肺癌细胞。

9.编码权利要求1-3中任意一项所述的抗体或抗体片段的核酸。

10.一种重组载体，含有权利要求9所述的核酸。

11.一种转化子，含有权利要求9所述的核酸。

说明书

能够结合肺特异X蛋白的抗体或抗体片段及其用途

技术领域

[0001] 本发明涉及抗体领域，具体地，涉及一种能够结合肺特异X蛋白的抗体或抗体片段及其用途。

背景技术

[0002] 21世纪以来，抗体治疗取得了突飞猛进的发展，已经成为恶性肿瘤治疗最成功和最重要的策略之一。单克隆抗体药物凭其特异性高和毒性低的优势而成为目前分子靶向治疗研究的热点，临床实践已经表明单克隆抗体卓著的疗效已经把肿瘤治疗推向一个前所未有的新阶段。

[0003] 肺癌是近年来发病率和致死率最高的恶性肿瘤之一，其5年存活率仅为13％，因此急需寻找有效的肺癌生物治疗靶标，从而有利于肺癌的靶向单克隆抗体药物的治疗。目前肺癌临床主要分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌，而其中85％以上为非小细胞肺癌。大量研究证实肺特异X蛋白(LunX)的mRNA可作为肺癌诊断的特异性生物标志物，主要表达于非小细胞肺癌表面，且阳性率达到90％，还发现LunX蛋白表达越高的患者呈现更差的病理分期、更低的分化状态和生存周期。另外，在正常外周肺组织以及乳腺、肝脏、卵巢等其它器官中都没有检测到LunX的表达(Xiaohu Zheng et al.,Cancer Res；75(6)；1080-90.2015 AACR；Lynne Bingle et al.,J Pathol；2005；205:491-497)。

[0004] 肺特异X蛋白(LunX)，属于PLUNC家族，其基因是Iwao研究团队通过对人体13种不同组织中分离出来的RNA运用差异显示技术，于2001年发现的一种人肺组织特异性X蛋白。基因定位于20p11.1q12，全长1015bp，包括一个编码256个氨基酸的768个核苷酸的开放式阅读框。

[0005] 关于LunX在肺癌中过表达的功能，主要证实LunX促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，靶向干扰LunX能够明显抑制肿瘤的发生与发展。LunX作用于肿瘤相关蛋白14-3-3，通过促进14-3-3形成活化状态的同源或异源二聚体，进而活化下游的Erk1/2和JNK信号通路，最终导致肿瘤细胞的增殖和转移(Xiaohu Zheng et al.,Cancer Res；75(6))。

[0006] 因此，针对LunX的靶向抗体可能是肺癌治疗的潜在药物。研究报道鼠源的单克隆抗体应用于人类将产生强的免疫原性，可引起对异种蛋白的排斥反应，产生人抗鼠抗体(Human anti-mouse antibody，HAMA)反应，多次使用可能导致病人过敏性休克，其它副作用还体现在鼠源抗体的体内快速清除、心脏毒性以及快速耐药等。鉴于此，可以利用抗体工程技术对抗体结构进行改造，将动物来源的单克隆抗体人源化(Monoclonal humanization)，以降低其免疫原性，并同时保证抗体的特异性。

[0007] 目前针对肿瘤靶向抗原的单克隆抗体可以通过两种机制发挥抗肿瘤作用。一种是直接机制，主要是抗体与肿瘤细胞表面的抗原结合后，改变抗原的活化形式或抗原的降解，进而阻断其相应的下游促癌信号通路的活化，最终抑制肿瘤细胞的增殖和转移；另一种是间接机制，主要是通过活化免疫反应实现，包括抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity，ADCC)和补体依赖的细胞毒作用(Complement Dependent Cytotoxicity，CDC)。为了获得更佳的抗肿瘤效果，都希望抗肿瘤药物能够通过上述多种机制发挥抗肿瘤作用，因此，开发能够介导多种抗肿瘤机制的抗LunX抗体显得尤为必要。

发明内容

[0008] 本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种能够介导多种抗肿瘤机制的抗体或抗体片段及其用途。

[0009] 为了实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种能够结合肺特异X蛋白的抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段包括重链CDR氨基酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3以及轻链CDR氨基酸序列SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6；

[0010] 或者，包括重链CDR氨基酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：3以及轻链CDR氨基酸序列SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。

[0011] 第二方面，本发明提供了一种组合物，该组合物含有第一方面所述的抗体或抗体片段以及药学上可接受的载体。

[0012] 第三方面，本发明提供了一种用于检测样品中肺特异X蛋白的试剂盒，该试剂盒含有第一方面所述的抗体或抗体片段。

[0013] 第四方面，本发明提供了第一方面所述的抗体或抗体片段在制备用于检测样品中肺特异X蛋白的试剂中的用途。

[0014] 第五方面，本发明提供了第一方面所述的抗体或抗体片段在制备用于抑制癌细胞的药物中的用途。

[0015] 第六方面，本发明提供了编码第一方面所述的抗体或抗体片段的核酸。

[0016] 第七方面，本发明提供了含有第六方面所述的核酸的重组载体或转化子。

[0017] 通过上述技术方案，本发明的抗体或抗体片段能够介导多种抗肿瘤机制，抗肿瘤效果较佳。而且，本发明的发明人进一步对所述抗体或抗体片段进行了人源化，所得嵌合抗体或人源化抗体或抗体片段的特异性和抗肿瘤活性仍保持在较佳水平。

[0018] 本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

[0019] 附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：

[0020] 图1是本发明一种实施方式中的嵌和抗体的ELISA分析结果图；

[0021] 图2是本发明一种实施方式中的嵌合抗体结合肺癌细胞表面LunX蛋白的活性结果图；

[0022] 图3是流式细胞术检测嵌合抗体的抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用的结果图；

[0023] 图4是本发明一种实施方式中的嵌合抗体抑制肿瘤体内生长的活性结果图。

具体实施方式

[0024] 以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

[0025] 在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

[0026] 在本发明中，在未作相反说明的情况下，使用的术语如“抗体片段”通常是指抗原结合性抗体片段，可以包括完整抗体的一部分，一般是抗原结合区或可变区，抗体片段的实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或scFv，双抗体，线性抗体，单链抗体分子等。

[0027] 术语“互补决定区”或“CDR氨基酸序列”或“CDR序列”是指抗体中负责抗原结合的氨基酸序列，例如，通常包括：轻链可变区中23-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)附近，和重链可变区中31-35B(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)附近的氨基酸残基(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))；和/或来自“高变环”(例如，轻链可变区中26-32(LI)、50-52(L2)和91-96(L3)，和重链可变区中26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)附近的氨基酸残基(Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。

[0028] 本发明提供的能够结合肺特异X蛋白的抗体或抗体片段包括重链CDR氨基酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3(N端至C端)以及轻链CDR氨基酸序列SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6(N端至C端)；

[0029] 或者，包括重链CDR氨基酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：3(N端至C端)以及轻链CDR氨基酸序列SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6(N端至C端)。

[0030] 本发明中，所述抗体或抗体片段能够结合肺特异X蛋白(抗原)，特别是如下SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列。优选情况下，本发明的抗体或抗体片段与肺特异X蛋白的亲和常数(K)在8×108以上。术语“亲和常数”表示抗体与抗原结合的紧密程度，可以通过竞争ELISE方法测得，计算公式为K＝1/Kd且A0/(A0-A)＝1+Kd/a0，其中，A0为竞争抗原为0时的OD值，A为各抗原浓度的OD值，a0为抗原总量，Kd为解离常数。

[0031]

[0032] 本发明的优选实施方式中，所述抗体或抗体片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：12所示。

[0033] 本发明的另一种优选实施方式中，所述抗体或抗体片段的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：13所示。如前所示(SEQ ID NO：6)，所述抗体或抗体片段的轻链可变区的氨基酸序列还可以为SEQ ID NO：11第97位天冬氨酸残基(D)替换为谷氨酸残基(E)后的氨基酸序列所示、或者SEQ ID NO：13第97位谷氨酸残基(E)替换为天冬氨酸残基(D)后的氨基酸序列所示。

[0034] 根据本发明最优选的实施方式，所述抗体或抗体片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示，或者，所述抗体或抗体片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示。

[0035] 本发明的优选实施方式中，为了进一步提高抗体的生物可接受性，还可以对抗体进行人源化，即，所述抗体为嵌合抗体或人源化抗体。术语“嵌合抗体”是指利用重组DNA技术，将来自一个物种(如小鼠)的单克隆抗体的恒定区氨基酸序列替换为来自另一个物种(如人)的抗体的恒定区(如SEQ ID NO：20，由SEQ ID NO：21所示的核酸编码)而获得的重组抗体。术语“人源化抗体”是指利用重组DNA技术，将来自一个物种(如小鼠)的单克隆抗体的恒定区和可变区的非CDR(Fv骨架区(FR))氨基酸序列全部替换为来自另一个物种(如人)的抗体的恒定区和可变区的非CDR氨基酸序列而获得的重组抗体。也即，一个抗体的恒定区被人源化时称为嵌合抗体，而恒定区和可变区的非CDR氨基酸序列全部人源化后称为人源化抗体。人源化的方法可以参照常规的抗体工程技术进行，在此不再赘述。

[0036] 举例而言，本发明提供的嵌合抗体的氨基酸序列可以如下述SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19所示：

[0037]

[0038] 本发明提供的组合物含有上述抗体或抗体片段以及药学上可接受的载体。

[0039] 术语“药学上可接受的”表明组合物能够给药至受试者而不产生妨碍组合物给药的不良生理反应。例如，“药学上可接受的载体”是指在制备一般安全、无毒、可取的药物组合物中有用的载体，优选地，这些载体或稀释剂的实例包括但不限于：水、盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和5％人血清白蛋白，也可以使用脂质体和非水媒介物，例如不挥发油。

[0040] 本发明的组合物也可以相互组合、或与一种或多种其它的治疗化合物组合地给药，例如，与化疗剂组合给药。因此，所述组合物还可以含有化疗剂。

[0041] 通常，所述抗体或抗体片段以治疗有效量给药，即足以实现期望的治疗和/或预防效果的量，例如，引起与被治疗的疾病相关的症状的预防或缓解的量，所述疾病例如与肺特异X蛋白相关的疾病。给药至受试者的组合物的治疗有效量将取决于疾病的类型和严重度，以及取决于个体的特征，例如一般健康状态、年龄、性别、体重和对药物的耐受性；还将取决于疾病的严重程度和类型，本领域技术人员将能够根据这些因素等确定合适的剂量。

[0042] 本发明提供的用于检测样品中肺特异X蛋白的试剂盒含有上述抗体或抗体片段。所述样品可以为癌症患者(特别是肺癌患者，更优选是非小细胞肺癌患者)的组织，如肺组织或锁骨下淋巴结组织。所述试剂盒还可以包括常规用于检测肺特异X蛋白的试剂，如包被液等。

[0043] 本发明还提供了上述抗体或抗体片段在制备用于检测样品中肺特异X蛋白的试剂中的用途。如前所述，所述样品可以为癌症患者(特别是肺癌患者，更优选是非小细胞肺癌患者)的组织，如肺组织或锁骨下淋巴结组织。本发明的抗体或抗体片段与肺特异X蛋白具有良好的亲和性，能够有效地检测样品中的肺特异X蛋白。

[0044] 本发明还提供了上述抗体或抗体片段在制备用于抑制癌细胞的药物中的用途。所述癌细胞优选为肺癌细胞，更优选为非小细胞肺癌细胞。

[0045] 另外，本发明还涉及一种在体外抑制癌细胞的方法，该方法包括：将有效量的癌细胞(如前所述)与本发明的抗体或抗体片段或者组合物接触。

[0046] 本发明还涉及一种抑制患者体内癌细胞(如前所述)的方法，该方法包括：将治疗有效量的本发明的抗体或抗体片段或者组合物给药至患者。其中，给药的方式可以为静脉注射给药和/或腹腔内给药。

[0047] 使用的术语“抑制”包括抑制癌细胞的增殖、生长和/或转移。本发明中涉及的“患者”或“受试者”一般指哺乳动物，如灵长类动物和/或啮齿类动物，特别是人或鼠。

[0048] 本发明还提供了编码上述抗体或抗体片段的(分离的)核酸以及含有该核酸的重组载体和转化子。所述核酸优选为基因工程手段获得的表达盒。

[0049] 编码本发明的抗体或抗体片段的重链和/或轻链的核酸在本发明的范围内，根据重链和/或轻链的氨基酸序列，本领域技术人员能够很容易得到相应的核酸序列，例如，编码抗体或抗体片段的重链的核酸的碱基序列如SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：16所示，编码抗体或抗体片段的轻链的核酸的碱基序列如SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：17所示。

[0050] 重组载体可以指克隆载体，也可以指表达载体，可以通过将所述核酸与商购的载体(如质粒或病毒载体)可操作地连接而获得，常用的质粒包括pSeTag2、PEE14、pMH3等。

[0051] 转化子可以通过使上述核酸或重组载体转化宿主细胞而获得，所述宿主细胞可以为常规使用的各种细胞，如CHO-K1、CHO-S等。

[0052] 以下将通过实施例对本发明进行详细描述。实施例或测试例中，未注明具体条件的实验方法的，均按照常规条件进行。

[0053] 实施例1

[0054] (I)抗LunX单克隆抗体的制备

[0055] 参照常规杂交瘤细胞融合技术(St Groth和Sheidegger 1980,J Immunol Methods 35:1-21；Kohler与Milstein，1976，European J of Immunol 6:511-519；Mechetner 2007,Methods mol Biol378:1-13)稍作调整后制备抗LunX的单克隆抗体，具体如下。并选择在酶联免疫吸附鉴定(ELISA)及流式细胞术鉴定(FACS)中具有高结合活性的单抗以便进一步分析。

[0056] (1)用于免疫及结合鉴定的重组LunX蛋白

[0057] 人工合成LunX全长基因(NCBI Reference Sequence:NM_016583.3)。PCR扩增SEQ ID NO：9所示的抗原蛋白片段，在目的序列的C端依次引入6His-Tag和终止密码子并克隆入pET-22b(+)载体(Novagen)，转入Rosetta(DE3)感受态菌(Novagen公司，货号70954-3)中，产生LunX原核重组融合蛋白表达质粒pET22b-LunX。挑选的单克隆菌落接种于LB培养基中，置于37℃摇床中，200转/分钟培养至OD600nm＝0.6-0.8时，加入1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，继续培养4-6小时诱导蛋白表达。4℃、6000g离心10分钟收菌，沉淀用裂菌缓冲液(50mM Tris、100mM NaCl、pH8.5)洗涤之后，用高压破碎方法裂菌。裂菌后的混合体用镍柱亲和层析纯化，不同浓度的咪唑洗脱目的蛋白，在100mM咪唑洗脱液(50mM Tris、100mM NaCl、200mM咪唑、pH9)中得到一定纯度的重组目的蛋白；进一步用分子筛层析(S-200)纯化，洗脱得到纯度大于90％、浓度为1mg/ml的目的重组蛋白。质谱鉴定显示，目的蛋白的肽段和LunX序列匹配，证明该重组蛋白即为重组LunX蛋白。

[0058] (2)动物免疫、杂交瘤细胞融合及克隆筛选

[0059] LunX蛋白与等体积完全弗氏佐剂(CFA)充分混合，初次免疫8-10周龄的BALB/c雌鼠(购自上海莱斯克，体重20g左右)，每只小鼠腹腔注射40-60μg的LunX蛋白；以后每2周免疫一次，相同剂量的LunX蛋白与等体积不完全弗氏佐剂混合，总共免疫5次后，ELISA检测小鼠血清效价不低于1:105时，最后注射40-60μg的LunX蛋白进行强化。在强化后的第三天，使用标准技术(Gefter，M.L.et al，1977Somat Cell Genet，3:231-236)分离脾细胞，并和鼠骨髓瘤细胞SP2/0细胞(ATCC编号CRL-1581)融合。在ELISA和FACS两者鉴定都显示阳性信号的杂交瘤细胞进行亚克隆筛选，得到两株杂交瘤细胞Ab2和Ab1。

[0060] (3)单克隆抗体的表达及纯化

[0061] 单克隆抗体的制备采用小鼠腹腔接种法，首先500μl无菌的液体石蜡通过腹腔免疫8-10周龄的BALB/C鼠，一周之后腹腔注射1×106杂交瘤细胞，7-10天左右收集腹水，高速离心收集上清。通过上述方法获得的抗体，用Protein A亲和层析方法纯化(GE Life Sciences)，经过纯化的两种单克隆抗体(PrAb2和PrAb1)纯度高于95％，抗体的重链约为45kDa，轻链约为25kDa。

[0062] (II)抗LunX单克隆抗体的可变区序列

[0063] 将候选杂交瘤细胞总数量培养到106，800rpm离心10分钟收集细胞，并以Trizol试剂盒(Invitrogen)提取总RNA；以总RNA为模板，逆转录合成cDNA文库(Invitrogen)，又以cDNA为模板PCR扩增杂交瘤细胞的所对应的可变区核酸序列。PCR扩增反应中所使用的引物序列与抗体可变区第一框架区或信号肽区和恒定区互补(Larrick，J.W.，et al.，(1990)Scand.J.Immunol.，32，121-128和Coloma，J.J.et al.，(1991)BioTechniques，11，152-156)。在50μl反应体系中，分别加入cDNA 2μl，10×PCR缓冲液5μl，上游及下游引物2μl(5μmol)，dNTP 2μl，Taq酶1μl(Takara，Ex Taq)，H2O 38μl；95℃预变性5min，进入温度循环，进行PCR扩增。反应条件为：94℃变性30S，58℃退火45S，72℃延伸50S，共32个循环，然后72℃延长7min。将扩增产物测序后，得到杂交瘤细胞Ab2和Ab1的重链和轻链可变区序列(包括氨基酸序列和核酸序列)如下表1所示，表1记载的序列中加粗并用下划线标注的为CDR氨基酸序列：

[0064] 表1

[0065]

[0066] (III)嵌和抗体和scFv-Fc表达载体的构建

[0067] 从人血细胞(安徽血液中心)中克隆重链恒定区Fc片段恒定区(核酸序列如SEQ ID NO：21所示)，通过DNA重组技术和锚定PCR技术，依次将轻链、连接序列((GGCGGCGGCGGCAGC)3，SEQ ID NO：22)、重链、Fc片段连接形成scFv-Fc片段，并在scFv-Fc两端引入双酶切位点，从而克隆匹配的双酶切质粒，即获得scFv-Fc表达载体。并经测序确定克隆DNA序列。后续的实验材料均由此系列质粒转染细胞后，提纯获得嵌合抗体ChAb2和ChAb1。

[0068] 测试例1

[0069] (I)嵌和抗体的LunX结合活性(ELISA)

[0070] 实施例1构建的嵌和抗体以高特异性及强度结合人LunX蛋白，此LunX蛋白为实施例1所述的重组LunX蛋白。对实施例1构建的嵌和抗体进行ELISA分析：用包被液(0.1M碳酸盐缓冲液pH9.6)稀释重组LunX蛋白至10μg/ml，100μl/孔，包被96孔ELISA板，4℃过夜，用PBST(0.05％的Tween20-PBS pH7.4)清洗3遍，1％的BSA封闭，37℃孵育2小时。PBST清洗3遍，分别加入经过倍比稀释的嵌和抗体，设置4个梯度，用IgG作为阴性对照，设PBS为调零孔，100μl/孔，37℃孵育1小时。PBST清洗3遍，每孔加入100μl辣根过氧化物酶(HRP)标记的鼠抗人IgG抗体(购自博士德生物，1∶10000稀释)，37℃孵育1小时。清洗后每孔加入100μl的TMB底物液，避光显色10-15分钟，加入终止液(1M的HCl)100μl/孔，终止后立即用酶标仪进行检测，读取波长450nm的吸光值(OD450)及630nm的吸光值(OD630)，计算ΔOD450＝OD450-OD630，结果见图1。

[0071] 如图1的ELISA结果所示，嵌和抗体ChAb2和ChAb1能够特异性结合人LunX蛋白。

[0072] (II)嵌合抗体结合肺癌细胞表面LunX蛋白的活性(流式细胞术)

[0073] 取新鲜的肺癌NCI-H292细胞(购自上海中科院细胞库)，分为两组，一组标记嵌和抗体，另一组标记人IgG(对照)，再分别进一步标记抗人IgG的FITC标记的鼠抗人IgG抗体，每次抗体标记条件为4℃孵育30分钟，细胞收集通过350g离心5分钟，还需1×PBS洗涤3遍，流式细胞仪(BD FACS Calibur)检测的结果如图2所示。可以看出嵌合抗体ChAb1能够结合活的肺癌细胞表面的LunX蛋白。相似地，流式细胞术测试结果显示嵌合抗体ChAb2也能够结合活的肺癌细胞表面的LunX蛋白。

[0074] (III)抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)

[0075] 应用Ficoll(外周血淋巴细胞分离液，Solarbio公司)离心分离法，380g，30min，从正常人外周血分离淋巴细胞，用1×PBS重悬；随后应用NK细胞分选试剂盒(美天妮，Human NK Cell Isolation Kit)纯化出NK细胞。以NK作为效应细胞，NCI-H292(上海中国科学院细胞库)肺癌细胞作为靶细胞，按照20:1的效靶比进行共孵育杀伤实验，37℃，4h。在其共培养体系中，分别加入IgG(10μg)、PrAb1(10μg)、ChAb1(1μg)、ChAb1(10μg)探讨本发明的嵌合抗体是否介导NK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。如图3所示，采用7AAD检测被杀伤的肿瘤细胞，结果显示嵌合抗体ChAb1能够介导ADCC效应，并具有剂量依赖性。相似地，细胞介导的细胞毒作用分析结果显示嵌合抗体ChAb2也能够介导ADCC效应，并具有剂量依赖性。

[0076] (IV)嵌合抗体抑制肿瘤体内生长的活性

[0077] 体外扩增培养NCI-H292和A549细胞(上海中国科学院细胞库)，收集细胞并用1×PBS洗涤一次，800rpm，10分钟离心收集细胞，用生理盐水重悬，浓度为2×107个/ml，接种200μl细胞于6-7周龄裸鼠腋窝皮下，总共接种24只。将接种NCI-H292和A549细胞的小鼠，在一周后分别分为两组，抗体组和IgG组，每组6只，隔日尾静脉注射20mg/kg(每千克小鼠注射
20毫克抗体)，共治疗10次，再测量皮下肿瘤的长边和短边，并称重。按经验公式(肿瘤大小＝长边×短边×短边/2)可以检测得到肿瘤大小，结果见图4(其中，图4A为接种A549细胞的小鼠的肿瘤大小测量结果，图4B为接种NCI-H292细胞的小鼠的肿瘤重量测量结果)，结果说明嵌合抗体ChAb1能够在体内抑制肿瘤的生长，而且相比于原始得到的鼠源抗体PrAb1具有更强的抑制活性。相似地，体内活性实验结果显示嵌合抗体ChAb2也具有抑制肿瘤体内生长的活性。

[0078] 从测试例的结果可以看出，本发明得到的嵌合抗体的特异性和抗肿瘤活性较佳。

[0079] 以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

[0080] 另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

[0081] 此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。