葛根素在制备防治猪病毒感染的药物中的用途、防治猪病毒感染的药物及猪饲料添加剂

摘要

本发明公开了防治猪病毒感染的药物及猪饲料添加剂，其中，所述防治猪病毒感染的药物包括葛根素和药用辅料，所述葛根素的重量百分比为20％‑80％，或者所述葛根素的浓度范围为0.2mg/mL～2.0mg/mL。本发明技术方案通过将葛根素用于制备防治猪病毒感染的药物，该药物安全性高，无毒副作用，且能有效防治猪病毒感染，以及降低发病猪的死亡率。

权利要求

1.葛根素在制备防治猪圆环病毒感染的药物中的用途，所述防治猪圆环病毒感染的药物包括葛根素和药用辅料，其中，所述葛根素为所述药物中的唯一活性成分；所述葛根素的重量百分比为20％-80％，或者所述葛根素的浓度范围为0.2mg/mL～2.0mg/mL。

2.如权利要求1所述的葛根素在制备防治猪圆环病毒感染的药物中的用途，其特征在于，所述防治猪圆环病毒感染的药物为口服液，所述药物辅料为溶剂和助溶剂，每100mL口服液中包括：葛根素20-200mg，

溶剂10-50mL；

助溶剂20-50mL；

其余为注射用水。

3.如权利要求2所述的葛根素在制备防治猪圆环病毒感染的药物中的用途，其特征在于，所述溶剂为无水乙醇、丙二醇、异丙醇中的任意一种或其组合物；所述助溶剂为吐温-

20、吐温-40、吐温-60、吐温-80中的任意一种或其组合物。

4.如权利要求1所述的葛根素在制备防治猪圆环病毒感染的药物中的用途，其特征在于，所述防治猪圆环病毒感染的药物为颗粒剂或者片剂，所述药物辅料为乳糖和可溶性淀粉，按照重量份计，该药物包括：葛根素20-80份；

乳糖5-25份；

可溶性淀粉15-50份。

5.如权利要求1所述的葛根素在制备防治猪圆环病毒感染的药物中的用途，其特征在于，所述防治猪圆环病毒感染的药物为粉剂，所述药物辅料为可溶性淀粉或麸皮，按照重量份计，该药物包括：葛根素20-80份；

可溶性淀粉或麸皮20-80份。

6.葛根素在制备猪饲料添加剂中的用途，其特在于，所述猪饲料添加剂包括如权利要求1至5任意一项所述的防治猪圆环病毒感染的药物。

说明书

葛根素在制备防治猪病毒感染的药物中的用途、防治猪病毒

感染的药物及猪饲料添加剂

技术领域

[0001] 本发明涉及猪病毒防治技术领域，特别涉及葛根素在制备防治猪病毒感染的药物中的用途、防治猪病毒感染的药物及猪饲料添加剂。

背景技术

[0002] 由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的猪流行性腹泻(PED)是猪的一种的急性肠道传染病。其主要临床症状为采食量大幅度降低，腹泻呈水样并且伴随着呕吐，严重时甚至脱水，各个年龄和品种的猪只都有可能感染发病，受其危害最为严重的是哺乳期仔猪，发病率高达100％，是当前导致仔猪早期死亡的主要疫病之一。自然条件下，仔猪感染PEDV的潜伏期是1～2天，人工感染的潜伏期根据攻毒剂量不同在8～24小时之间，潜伏期内的仔猪体温会升高，随后出现呕吐或者腹泻的症状。目前为止，除了PEDV的灭活疫苗和弱毒疫苗，没有更为有效的防治措施。虽然大部分养猪户会通过接种疫苗来预防PED，但是由于疫苗质量参差不齐等原因，接种后的效果也不理想。

[0003] 猪圆环病毒病是由猪圆环病毒(PCV)引起的断奶仔猪进行性消瘦、淋巴组织等组织病变的一种多系统衰竭综合征。猪圆环病毒是一种小而无囊膜、二十面体对称、共价闭合、环状、单股DNA病毒，病毒粒子直径平均为17nm，是目前发现的最小动物病毒，可引发猪断奶后仔猪多系统衰竭综合征、猪皮炎肾病综合征、母猪繁殖障碍、先天性震颤、猪呼吸道综合征和PCV2相关性肠炎等多种疾病，给养猪业带来重大的经济损失。目前已有多种商品PCV2疫苗可用于PCV疾病防控。已有疫苗属于亚单位疫苗或全病毒灭活疫苗，能够产生较好的免疫保护，但也存在成本高、免疫抗体产生较慢、免疫保护效力还需进一步提高等不足，从而限制了其在中国大规模推广用途。因此对于猪圆环病毒病，至今仍没有理想的治疗药物和疫苗。

[0004] 目前，我国畜禽重要疾病的发生和流行的防控主要靠疫苗，但由于很多因素都会导致免疫失败，在我国高密度的养殖状况，大剂量的抗病毒药物滥用，导致病毒(菌)株的变异速度超过了疫苗研制的速度，大规模流行病时常爆发。这些都意味着我们也要清醒地认识到抗病毒药物和抗细菌药物的研发迫在眉睫。具有很好的抗病毒特性中草药是最佳抗病毒药物，而且中草药同时具有天然性,无抗药性、无药残、毒副作用小等优点,同时其功能多样化,具有免疫调节、抑菌抗病毒、增食欲促消化、抗应激、抗氧化等功能。在畜牧生产中用途中草药添加剂,能够提高畜禽生产性能、促进营养物质消化吸收、改善畜禽免疫功能等，常被认为是具有替代饲用抗生素潜力的绿色药物及饲料添加剂。

[0005] 葛根始载于《神农本草经》，历代本草均有记载，今为常用生药，其味甘辛，性凉，入脾、胃、肺经。葛根作为中国传统医学中最具代表性的药物之一，具有解酒防醉、改善心脑血管循环、降低心肌耗氧量、降低血糖、防止高血压及动脉硬化、抗肝脏毒、抗炎，祛痰，解热等多种作用。葛根素是从豆科植物野葛或甘葛根的干燥根中提取的单体，其化学名为4，7二羟基-8-β-D-葡萄糖基异黄酮，分子式C21H20O9，分子量为416。葛根素具有对脏器组织的保护、抗心律失常、抗心肌缺血、扩张血管、改善微循环、降血脂、降血糖、增加脑血流量、抗缺血再灌注损伤、保护脑神经细胞、抗氧化、抗酒精中毒、调控骨代谢、降低眼压作用、抑制钙超载、改善胰岛素抵抗作用等。

[0006] 尽管有报道认为葛根芩连汤抗病毒有效成分是黄芩苷、葛根素等。然而目前，尚未见到葛根素在猪流行性腹泻病毒或猪圆环病毒2型的感染的用途报道。鉴于猪流行性腹泻病毒或猪圆环病毒2型的感染严重危害着养猪生产，现有疫苗的预防效果不稳定，开发葛根素在制备治疗或预防猪病毒感染的药物中的用途具有重大意义。

发明内容

[0007] 本发明的主要目的是将葛根素应用在制备防治猪病毒感染的药物中，该防治猪病毒感染的药物安全性高，无毒副作用，且能有效防治猪病毒感染。

[0008] 为实现上述目的，本发明提出了葛根素在制备防治猪病毒感染的药物中的用途。

[0009] 优选地，所述防治猪病毒感染的药物为口服液、颗粒剂、粉剂或片剂。

[0010] 优选地，所述防治猪病毒感染的药物为颗粒剂、粉剂或者片剂时，所述葛根素的重量百分比为20％～80％。

[0011] 优选地，所述防治猪病毒感染的药物为口服液时，所述葛根素的浓度范围为0.2mg/mL～2.0mg/mL。

[0012] 本发明还提出一种防治猪病毒感染的药物，所述防治猪病毒感染的药物包括葛根素和药用辅料，其中，所述葛根素的重量百分比为20％-80％，或者所述葛根素的浓度范围为0.2mg/mL～2.0mg/mL。

[0013] 优选地，所述防治猪病毒感染的药物为口服液，所述药物辅料为溶剂和助溶剂，每100mL口服液中包括：葛根素20-200mg，溶剂10-50mL；助溶剂20-50mL；其余为注射用水。

[0014] 优选地，所述溶剂为无水乙醇、丙二醇、异丙醇中的任意一种或其组合物；所述助溶剂为吐温-20、吐温-40、吐温-60、吐温-80中的任意一种或其组合物。

[0015] 优选地，所述防治猪病毒感染的药物为颗粒剂或者片剂，所述药物辅料为乳糖和可溶性淀粉，按照重量份计，该药物包括：葛根素20-80份；乳糖5-25份；可溶性淀粉15-50份。

[0016] 优选地，所述防治猪病毒感染的药物为粉剂，所述药物辅料为可溶性淀粉或麸皮，按照重量份计，该药物包括：葛根素20-80份；可溶性淀粉或麸皮20-80份。

[0017] 本发明还提出一种猪饲料添加剂，该猪饲料添加剂包括上述防治猪病毒感染的药物。

[0018] 本发明的技术方案采用将葛根素用于制备防治猪病毒感染的药物，制得的药物安全性高，无毒副作用，且能有效防治猪病毒感染，以及降低发病猪的死亡率。

具体实施方式

[0019] 下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0020] 另外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。

[0021] 本发明提出了葛根素在制备防治猪病毒感染的药物中的用途。葛根素通过增强机体抗氧化防御机能，提高猪的天然免疫功能和抗病毒活性，能有效防治猪流行性腹泻病毒和猪圆环病毒2型的感染，从而降低发病猪的死亡率。葛根素作为治疗和预防猪病毒感染具有显著的功效。

[0022] 本发明还提出了一种防治猪病毒感染的药物，其中，该防治猪病毒性感染的药物可以为口服液、颗粒剂、粉剂或片剂。

[0023] 当所述防治猪病毒感染的药物为颗粒剂、粉剂或者片剂时，所述葛根素的重量百分比为20％～80％。当所述防治猪病毒感染的药物为口服液时，所述葛根素的浓度范围为0.2mg/mL～2.0mg/mL。

[0024] 具体地，所述防治猪病毒感染的药物包括葛根素和药用辅料。

[0025] 所述防治猪病毒感染的药物为口服液，所述药物辅料为溶剂和助溶剂，每100mL口服液中包括：葛根素20-200mg，溶剂10-50mL；助溶剂20-50mL；其余为注射用水。

[0026] 所述溶剂为无水乙醇、丙二醇、异丙醇中的任意一种或其组合物。所述助溶剂为吐温-20、吐温-40、吐温-60、吐温-80中的任意一种或其组合物。

[0027] 所述防治猪病毒感染的药物为颗粒剂或者片剂，所述药物辅料为乳糖和可溶性淀粉，按照重量份计，该药物包括：葛根素20-80份；乳糖5-25份；可溶性淀粉15-50份。

[0028] 所述防治猪病毒感染的药物为粉剂，所述药物辅料为可溶性淀粉或麸皮，按照重量份计，该药物包括：葛根素20-80份；可溶性淀粉或麸皮20-80份。

[0029] 所述猪病毒为猪圆环病毒2型或猪流行性腹泻病毒。所述猪流行性腹泻病毒为PED病毒YN株；所述猪圆环病毒2型为PCV2病毒WH株。

[0030] 本发明的葛根素颗粒剂、口服液、粉剂或者片剂，可以直接给药或制备成制剂给药，也可以单独或制成制剂后添加到饲料中或者饮水中给药。

[0031] 本发明的技术方案采用将葛根素用于制备防治猪病毒感染的药物，制得的药物安全性高，无毒副作用，且能有效防治猪病毒感染，以及降低发病猪的死亡率。

[0032] 本发明还提出一种猪饲料添加剂，所述猪饲料添加剂包括上述防治猪病毒感染的药物。

[0033] 下面将结合具体实施例进行详细说明，其中，将以12kg的仔猪作为试验对象。

[0034] 实施例1

[0035] 一种防治猪病毒性感染的药物，所述防治猪病毒感染的药物为口服液，所述药物辅料为无水乙醇和吐温-80，每100mL口服液中包括：葛根素20mg，无水乙醇10mL，吐温-80 20mL，其余为注射用水。

[0036] 制备方法：先将葛根素溶于无水乙醇中，接着加入吐温-80，最后缓慢加入注射用水，补足至100mL，制备一种葛根素口服液(0.2mg/mL)。

[0037] 若作为预防猪病毒感染的药物使用，可以将2.4mL的口服液添加于饲料中，在整个饲养周期使用。

[0038] 若作为临床治疗猪病毒感染的药物使用，可以将6mL的口服液经口腔灌服；或者将6mL的口服液直接饲喂；或者将6mL的口服液添加于饲料中使用，每天早中晚添加三次，连续使用一周。

[0039] 实施例2

[0040] 一种防治猪病毒性感染的药物，所述防治猪病毒感染的药物为口服液，所述药物辅料为无水乙醇和吐温-80，每100mL口服液中包括：葛根素50mg，无水乙醇20mL，吐温-80 30mL，其余为注射用水。

[0041] 制备方法：先将葛根素溶于无水乙醇中，接着加入吐温-80，最后缓慢加入注射用水，补足至100mL，制备一种葛根素口服液(0.5mg/mL)。

[0042] 若作为预防猪病毒感染的药物使用，可以将2.4mL的口服液添加于饲料中，在整个饲养周期使用。

[0043] 若作为临床治疗猪病毒感染的药物使用，可以将6mL的口服液经口腔灌服；或者将6mL的口服液直接饲喂；或者将6mL的口服液添加于饲料中使用，每天早中晚添加三次，连续使用一周。

[0044] 实施例3

[0045] 一种防治猪病毒性感染的药物，所述防治猪病毒感染的药物为口服液，所述药物辅料为无水乙醇和吐温-80，每100mL口服液中包括：葛根素100mg，无水乙醇40mL，吐温-80 50mL，其余为注射用水。

[0046] 制备方法：先将葛根素溶于无水乙醇中，接着加入吐温-80，最后缓慢加入注射用水，补足至100mL，制备一种葛根素口服液(1.0mg/mL)。

[0047] 若作为预防猪病毒感染的药物使用，可以将2.4mL的口服液添加于饲料中，在整个饲养周期使用。

[0048] 若作为临床治疗猪病毒感染的药物使用，可以将6mL的口服液经口腔灌服；或者将6mL的口服液直接饲喂；或者将6mL的口服液添加于饲料中使用，每天早中晚添加三次，连续使用一周。

[0049] 实施例4

[0050] 一种防治猪病毒性感染的药物，所述防治猪病毒感染的药物为口服液，所述药物辅料为无水乙醇和吐温-80，每100mL口服液中包括：葛根素200mg，无水乙醇50mL，吐温-80 40mL，其余为注射用水。

[0051] 制备方法：先将葛根素溶于无水乙醇中，接着加入吐温-80，最后缓慢加入注射用水，补足至100mL，制备一种葛根素口服液(2.0mg/mL)。

[0052] 若作为预防猪病毒感染的药物使用，可以将2.4mL的口服液添加于饲料中，在整个饲养周期使用。

[0053] 若作为临床治疗猪病毒感染的药物使用，可以将6mL的口服液经口腔灌服；或者将6mL的口服液直接饲喂；或者将6mL的口服液添加于饲料中使用，每天早中晚添加三次，连续使用一周。

[0054] 实施例5

[0055] 一种防治猪病毒性感染的药物，所述防治猪病毒感染的药物为口服液，所述药物辅料为吐温-80，每100mL口服液中包括：葛根素200mg，吐温-8040mL，其余为注射用水。

[0056] 制备方法：先将葛根素溶于吐温-80，最后缓慢加入注射用水，补足至100mL，制备一种葛根素口服液(2.0mg/mL)。

[0057] 若作为预防猪病毒感染的药物使用，可以将2.4mL的口服液添加于饲料中，在整个饲养周期使用。

[0058] 若作为临床治疗猪病毒感染的药物使用，可以将6mL的口服液经口腔灌服；或者将6mL的口服液直接饲喂；或者将6mL的口服液添加于饲料中使用，每天早中晚添加三次，连续使用一周。

[0059] 实施例6

[0060] 一种防治猪病毒性感染的药物，所述防治猪病毒感染的药物为片剂，所述药物辅料为乳糖和可溶性淀粉，按照重量份计，该片剂包括：葛根素20份；乳糖30份；可溶性淀粉50份。

[0061] 制备方法：将葛根素、乳糖、可溶性淀粉混合后，用压片机压片烘干，即可获得葛根素片剂(葛根素的重量百分比为20％)。

[0062] 若作为预防猪病毒感染的药物使用，可以将2.4mg的片剂添加于饲料中，在整个饲养周期使用。

[0063] 若作为临床治疗猪病毒感染的药物使用，可以将6mg的片剂直接饲喂；或者将6mg的片剂与日粮混合，添加于饲料中使用，每天早中晚添加三次，连续使用一周。

[0064] 实施例7

[0065] 一种防治猪病毒性感染的药物，所述防治猪病毒感染的药物为片剂，所述药物辅料为乳糖和可溶性淀粉，按照重量份计，该片剂包括：葛根素50份；乳糖15份；可溶性淀粉35份。

[0066] 制备方法：将葛根素、乳糖、可溶性淀粉混合后，用压片机压片烘干，即可获得葛根素片剂(葛根素的重量百分比为50％)。

[0067] 若作为预防猪病毒感染的药物使用，可以将2.4mg的颗粒剂添加于饲料中，在整个饲养周期使用。

[0068] 若作为临床治疗猪病毒感染的药物使用，可以将6mg的颗粒剂直接饲喂；或者将6mg的颗粒剂与日粮混合，添加于饲料中使用，每天早中晚添加三次，连续使用一周。

[0069] 实施例8

[0070] 一种防治猪病毒性感染的药物，所述防治猪病毒感染的药物为片剂，所述药物辅料为乳糖和可溶性淀粉，按照重量份计，该片剂包括：葛根素80份；乳糖5份；可溶性淀粉15份。

[0071] 制备方法：将葛根素、乳糖、可溶性淀粉混合后，用压片机压片烘干，即可获得葛根素片剂(葛根素的重量百分比为80％)。

[0072] 若作为预防猪病毒感染的药物使用，可以将2.4mg的片剂添加于饲料中，在整个饲养周期使用。

[0073] 若作为临床治疗猪病毒感染的药物使用，可以将6mg的片剂直接饲喂；或者将6mg的片剂与日粮混合，添加于饲料中使用，每天早中晚添加三次，连续使用一周。

[0074] 为了对上述实施例制备的葛根素制剂进行测试，下面将以12kg的仔猪作为试验对象，进行了如下试验：

[0075] 试验一：葛根素对猪天然免疫功能的影响

[0076] 材料与方法：

[0077] (1)试验动物：35±2日龄健康仔猪(杜洛克×长白×大白，体重12kg)，购自武汉中粮肉食品有限公司。

[0078] (2)试验药物：葛根素：市售医药级产品，纯度≥98％。

[0079] (3)试验分组：将实验仔猪随机分为三个试验组和一个空白对照组，三个试验组分别为葛根素低剂量组(2.4mg葛根素)、葛根素中剂量组(4.2mg葛根素)和葛根素高剂量组(6mg葛根素)，每组10头猪。

[0080] (4)给药方式：试验猪预饲期3d后，药物以粉剂的形式添加于饲料中，猪自由采食，空白对照组饲料中不添加葛根素。分别于用药后的第10d、20d、30d后，每组随机选4头仔猪前腔静脉采血5mL，用于细胞因子的测定。

[0081] (5)试验指标：血清中IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-α和IFN-γ的水平，在武汉轻工大学动物营养学重点实验室采用放射免疫法按试剂盒说明书进行测定。

[0082] (6)数据分析：试验数据采用SPSS 13.0统计软件中的单因素方差分析(One-way ANOVA)和Duncan氏法多重比较，以P<0.05为差异显著性标准，以P<0.01为差异极显著标准。结果用平均值±标准差表示。

[0083] (7)实验结果：

[0084] 饲料中添加不同剂量的葛根素后，对仔猪血清中的IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ的水平影响不明显，但是仔猪血清中的IFN-α差异显著。对仔猪血清中IFN-α的影响见表1。

[0085] 表1血清免疫因子含量的变化(pg/mL)

[0086]组别 IL-2 IL-6 TNF-α IFN-α IFN-γ
空白组 22.35±4.62a 61.85±6.79a 113.49±14.56a 201.42±24.68a 99.34±11.58a低剂量组 31.88±2.76b 75.52±8.16b 139.66±12.95b 234.65±22.35b 113.76±12.59b中剂量组 29.73±3.15b 82.91±7.39b 158.79±16.21c 296.87±30.28c 131.91±12.15c高剂量组 33.61±4.39b 85.12±8.64b 156.21±15.66c 302.34±19.76c 135.27±11.96c[0087] 表1结果显示：相较空白组，三个试验组中仔猪血清的IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-α和IFN-γ的水平显著升高，但是中剂量组和高剂量组之间差异不显著。这说明葛根素可以提高猪的天然免疫功能。

[0088] 试验二：葛根素对猪圆环病毒2型(PCV2)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)体外增殖的抑制作用

[0089] 材料与方法：

[0090] (1)细胞：猪肾上皮细胞PK15(PK15细胞)用于猪圆环病毒2型的培养；非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)用于猪流行性腹泻病毒的培养，这两种细胞均由国家农业微生物重点实验室保管和馈赠。

[0091] (2)病毒：PED病毒(YN株)和PCV2病毒(WH株)均有华中农业大学国家农业微生物重点实验室分离、保存并馈赠。

[0092] (3)试验药物：葛根素：市售医药级产品，纯度≥98％；

[0093] (4)试剂：DMEM培养基、EDTA、胰酶、胎牛血清和双抗(青链霉素)均购自GIBCO公司；

[0094] (5)试验分组：将试验分为三个试验组和一个空白组，三个试验组分别在培养基中加入不同剂量的葛根素，其中，葛根素低剂量组(按照5nmol/L培养基添加)、葛根素中剂量组(按照50nmol/L培养基添加)、葛根素高剂量组(按照0.5μmmol/L培养基添加)，空白对照组的培养基中不添加葛根素)。

[0095] (6)体外增殖抑制作用：PCV2体外增殖的抑制试验：首先将PCV2病毒液用DMEM维持液做10倍系列稀释，取10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6六个稀释度，分别接种于已培养好的PK15细胞单层的96孔板，100μL/孔，每个组分别加入含有不同浓度葛根素的DMEM维持液，置37℃含5％CO2培养箱中继续培养48h，经间接免疫荧光试验，观察特异性绿色荧光作为病毒感染阳性。统计每个稀释度的细胞孔中病毒感染阳性孔数，利用Reed-Muench法计算出每个葛根素组的半数组织培养感染剂量(TCID50)，比较不同组TCID50的值判断葛根素对PCV2病毒体外增殖的抑制作用，每个组做三个重复。

[0096] PEDV体外增殖的抑制试验：首先将PEDV病毒液用DMEM维持液做10倍系列稀释，取-2 -3 -4 -5 -6 -710 、10 、10 、10 、10 、10 六个稀释度，分别接种于已培养好的Vero细胞单层的96孔板，
100μL/孔，每个组分别加入含有不同浓度葛根素的DMEM维持液，置37℃含5％CO2培养箱中继续培养48h，观察细胞病变。统计每个稀释度的细胞孔中病变阳性孔数，利用Reed-Muench法计算出每个葛根素组的TCID50，比较不同组TCID50的值判断葛根素对PEDV病毒体外增殖的抑制作用，每个组做三个重复。

[0097] (7)数据分析：试验数据采用SPSS 13.0统计软件中的单因素方差分析(One-way ANOVA)和Duncan氏法多重比较，以P<0.05为差异显著性标准，以P<0.01为差异极显著标准。结果用平均值表示。

[0098] (8)实验结果：

[0099] 表2葛根素对不同病毒的TCID50影响

[0100]组别 PCV2 PEDV
空白组 108.25±0.21a 107.91±0.38a
低剂量组 105.15±0.12b 106.69±0.41b
中剂量组 103.19±0.37c 104.05±0.25c
高剂量组 101.38±0.19c 102.18±0.27c

[0101] 表2结果显示：在细胞培养液中添加不同浓度的葛根素显著影响PCV2病毒在PK15细胞上的TCID50值，随着葛根素添加量的增加，PCV2在PK15细胞上的TCID50显著下降，说明葛根素对PCV2病毒在体外培养的PK15细胞中的增殖具有一定的抑制作用。在细胞培养液中添加不同浓度的葛根素显著影响PEDV病毒在Vero细胞上的TCID50值，随着葛根素添加量的增加，PEDV在Vero细胞上的TCID50显著下降，说明葛根素对PEDV病毒在体外培养的Vero细胞中的增殖具有一定的抑制作用。

[0102] 试验三：葛根素对猪圆环病毒2型感染仔猪的保护作用

[0103] 材料与方法：

[0104] (1)试验病毒：PCV2病毒(WH株)由华中农业大学国家农业微生物学重点实验室馈赠；

[0105] (2)葛根素：市售医药级产品，纯度≥98％；

[0106] (3)试验动物：挑选品种、来源相同，体重约12kg的仔猪32头，经PCR、ELISA检测PCV2抗体为阴性的7周龄仔猪进行攻毒试验，试验仔猪分为三个试验组和一个空白对照组，三个试验组分别以口服液的形式给予不同剂量的葛根素：葛根素低剂量组(2.4mg葛根素)、葛根素中剂量组(4.2mg葛根素)和葛根素高剂量组(6mg葛根素)，空白对照组为口服等体积的生理盐水，每组8头猪。

[0107] (4)攻毒试验：各个组仔猪在饲喂2两周后，以107TCID50/mL的PCV2WH株攻毒，每头颈部肌肉注射2.0mL，同时滴鼻2.0mL，然后隔离饲养，连续观察至攻毒后5周。

[0108] (5)观察指标：于攻毒前和试验结束时称量仔猪体重，计算相对日增重(日增重/原体重，RDGW)。攻毒后每天观察仔猪临床症状，并测直肠温度；通过临床症状的观察，以及各试验猪在攻毒后21d剖检作大体和组织病理学观察，包括各脏器的病变、淋巴结肿大程度；采集肺、淋巴结、扁桃体、心脏、胸腺、肝、脾、肾等脏器固定后按常规方法制备石蜡切片，HE染色后显微镜观察组织病理学变化；评价肺、淋巴结、肝等组织病变的严重程度。同时统计死亡猪数，计算发病率与死亡率。

[0109] (6)数据分析：试验数据采用SPSS 13.0统计软件中的单因素方差分析(One-way ANOVA)和Duncan氏法多重比较，以P<0.05为差异显著性标准，以P<0.01为差异极显著标准。结果用平均值表示。

[0110] (7)实验结果：饲料中添加不同剂量的葛根素后，各组仔猪发病率与死亡率见表3。

[0111] 表3葛根素对PCV2病毒感染仔猪的免疫保护

[0112]组别 发病率(％) 死亡率(％) 保护率(％)
空白组 100.0a 50.0a 0a
低剂量组 75.0a 12.5b 25.0b
中剂量组 37.5b 12.5b 62.5c
高剂量组 25.0b 0c 75.0c

[0113] 表3结果显示：仔猪口服不同剂量的葛根素能够显著降低PCV2感染仔猪的发病率与死亡率，与空白组相比，随着剂量的增加，感染PCV2仔猪的发病率下降25％～75％；而发病猪的死亡率下降37.5％～50％；试验结果充分表明：葛根素添加后能显著提高仔猪对PCV2感染的保护率。

[0114] 试验四：葛根素对猪流行性腹泻病毒感染仔猪的保护作用

[0115] 材料与方法：

[0116] (1)试验病毒：PED病毒(云南株)由华中农业大学国家农业微生物学重点实验室馈赠；

[0117] (2)葛根素：市售医药级产品，纯度≥98％；

[0118] (3)试验动物：挑选品种、来源相同，体重相近，没有母源抗体的3日龄健康仔猪，进行攻毒试验，试验仔猪分为三个试验组和一个空白对照组，葛根素以颗粒剂的形式添加于试验组饲料中，其中，三个试验组分别为葛根素低剂量组(2.4mg葛根素)、葛根素中剂量组(4.2mg葛根素)和葛根素高剂量组(6mg葛根素)，空白对照组为饲料中不添加葛根素。

[0119] (4)攻毒试验：各个组仔猪在饲喂一周后，以107TCID50/mL的PEDV(NY株)攻毒，每头口服灌注5.0mL，然后隔离饲养，连续观察7天至试验结束。

[0120] (5)观察指标：每天观察试验仔猪的腹泻情况，试验期满屠宰试验仔猪观察肠道病变，同时统计死亡猪数，计算腹泻率、死亡率及保护率。葛根素(PR)对PEDV病毒的抑制作用，通过实时定量PCR检测仔猪肠道黏膜中PEDV结构基因N或M的表达量来确定。

[0121] (6)数据分析：试验数据采用SPSS 13.0统计软件中的单因素方差分析(One-way ANOVA)和Duncan氏法多重比较，以P<0.05为差异显著性标准，以P<0.01为差异极显著标准。结果用平均值表示。

[0122] (7)实验结果：

[0123] 饲料中添加不同剂量的葛根素后，各组仔猪发病率与死亡率见表4。

[0124] 表4葛根素对PEDV病毒感染仔猪的免疫保护

[0125]组别 腹泻率(％) 死亡率(％) 保护率(％)
空白组 100.0a 100.0a 0a
低剂量组 62.5b 50.0b 25.0b
中剂量组 37.5c 25.0c 62.5c
c c c
高剂量组 25.0 25.0 75.0

[0126] 表4结果显示：在仔猪饲料中添加不同浓度的葛根素能够显著降低PEDV感染仔猪的腹泻率与死亡率，与空白组相比，感染PEDV仔猪的腹泻率下降37.5％～75％；而发病猪的死亡率下降50％～75％；试验结果充分表明：葛根素添加后能显著提高仔猪对PEDV感染的保护率。表5葛根素在猪体内对PEDV的抑制效果。

[0127] 表5葛根素在猪体内对PEDV的抑制效果

[0128]

[0129] 表5结果显示：添加葛根素可以显著降低PEDV的N和M基因表达量，结果充分表明：葛根素添加后能显著降低PEDV毒力，抑制PEDV复制。

[0130] 另外，还对上述实施例的防治猪病毒感染的药物中葛根素的含量(重量百分比或者浓度)进行了研究，具体结果如下表6、表7。需要说明的是，对比例为不添加葛根素的饲料。

[0131] 表6葛根素的含量对PCV2病毒感染仔猪的免疫保护

[0132]实施例 发病率(％) 死亡率(％) 保护率(％)
对比例 100.0a 100.0a 0a
实施例1 75.0a 32.5b 25.0b
实施例2 57.5b 22.5b 42.5c
b b c
实施例3 37.5 12.5 60.5
实施例4 35.0b 10.5c 65.0c
实施例5 95.0a 72.5b 12.0b
实施例6 75.0a 32.5b 25.0b
b b c
实施例7 40.5 20.5 55.5
实施例8 35.0b 12.5c 65.0c

[0133] 表7葛根素的含量对PEDV病毒感染仔猪的免疫保护

[0134]实施例 腹泻率(％) 死亡率(％) 保护率(％)
对比例 100.0a 100.0a 0a
b b b
实施例1 62.5 50.0 25.0
实施例2 52.5b 40.0b 45.0b
实施例3 30.5c 20.0c 60.5c
实施例4 37.0c 25.0c 65.0c
实施例5 92.5b 80.0b 10.0b
实施例6 60.5b 55.0b 10.0b
实施例7 35.5c 25.0c 55.5c
实施例8 27.0c 20.0c 60.0c

[0135] 由表6可以看出：随着葛根素的含量增加，感染PCV2仔猪的发病率不断下降，发病猪的死亡率也不断下降。由表7可以看出：随着葛根素的含量增加，感染PEDV仔猪的腹泻率不断下降；而发病猪的死亡率也不断下降。

[0136] 此外，对比实施例4与实施例5，可以发现，将葛根素溶于无水乙醇与吐温-80中制备的口服液，能够减小感染PCV2仔猪的发病率和发病猪的死亡率，也能够减小感染PEDV仔猪的腹泻率和发病猪的死亡率，因而，葛根素与乙醇表现出了明显的协同作用。

[0137] 以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。