黄酮类芳香化酶抑制剂及其制备方法与应用

摘要

本发明涉及一系列黄酮类芳香化酶抑制剂，通过氰甲基化反应和烷基化反应，改变了黄酮类化合物母环上的某些取代基团，合成出一系列黄酮类化合物及其衍生物。其结构通式可用权利要求书中通式表示。结构通式中，R1选自‑OH或H中的任意一种，R2选自‑H或‑OCH3或‑OH中的任意一种,R3选自‑H、‑OH或‑OCH2CN或‑OCH3中的任意一种；R4选自‑H或‑OH或‑OCH2Ph或‑2‑（2‑甲氧基‑2氧代乙基）苄氧基中的任意一种，R5选自‑H或‑OCH2Ph或‑OCH3中的任意一种，R6选自‑H或‑OH或‑OCH3中的任意一种。这些黄酮类化合物对芳香化酶有较好的抑制作用，经过活性测试，本抑制剂抑制芳香化酶的活性最高为IC50=0.251µmol/L。

权利要求

1.一种黄酮类芳香化酶抑制剂，其化合物结构为：；

；

；

；

；

。

2.权利要求1所述黄酮类芳香化酶抑制剂在制备治疗抑制芳香化酶药物中的应用。

3.权利要求1所述黄酮类芳香化酶抑制剂在制备治疗乳腺癌药物中的应用。

说明书

黄酮类芳香化酶抑制剂及其制备方法与应用

技术领域

[0001] 本发明属于药物合成技术领域，涉及酶抑制剂，尤其是一种黄酮类芳香化酶抑制剂及其制备方法与应用。

背景技术

[0002] 芳香化酶（Aromatase，CYP19）属于细胞色素P450家族，是一种由503个氨基酸组成的酶蛋白，由血红蛋白和黄体蛋白构成，广泛存在于卵巢、胎盘、睾丸、脑、脂肪、骨等正常组织器官中，表达于细胞内质网膜，并与膜紧密结合，在胎盘及卵巢滤泡粒层细胞高表达，在皮下脂肪、肌肉、肝、脑、正常乳腺间质和乳腺癌等非腺体组织中也有低水平表达。80%雌激素受体（ER）阳性的绝经后乳腺癌患者的肿瘤组织内有芳香化酶活性。芳香化酶的活性中心还有一个含铁的卟啉环（血红素辅基），它对酶的催化活性起着决定性作用，其中血红素辅基中心的铁原子与卟啉环上4个吡咯氮原子以配位键结合。

[0003] 芳香化酶 (Aromatase，CYP19), 是体内负责雌激素生物转化的限速酶, 它能将雄激素催化生成雌激素，又称雌激素合成酶，催化雄烯二酮和睾酮合成雌酮和雌二醇，可以使雄激素转变为雌激素。研究表明, 芳香化酶作用于雌激素生物合成的最后一步, 因此抑制芳香化酶的活性并不会干扰其他甾体的合成过程。在绝经前妇女中，雌激素主要经卵巢的芳香化酶产生，雄激素转变为雌激素的过程受垂体的卵泡刺激素和黄体生成激素的调控，在正常反馈环调控下，可由垂体分泌促性腺激素促进雌激素的分泌，以对抗雌激素的减少，因此，对绝经前的乳腺癌患者单独使用芳香化酶抑制剂（Aromatase inhibitors， AIs）不能有效抑制雄、雌激素的转变。绝经后妇女的卵巢不再产生雌激素，雌激素主要来源于脂肪、肌肉和肝脏等外周组织，此过程不受垂体调控，雄激素经由周围的芳香化酶变成雌激素，由于没有反馈环对抗芳香化酶抑制剂产生的效果，故绝经后的乳腺癌患者服用芳香化酶抑制剂后可大大降低雄、雌激素的转变速率。

[0004] 乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一, 其病死率位于各种癌症的前列，其中三分之一以上为雌激素依赖型。芳香化酶（Aromatase）是细胞色素P450酶家族中一个成员，在体内以睾酮、雄烯二酮和16-α-羟雄烯二酮为生理底物，经过芳香化作用转化成雌酮和雌二醇。临床研究发现，绝经后妇女外周循环中的雌激素水平明显下降，但在芳香化酶高表达的乳腺组织，雌激素的水平依旧很高，因此乳腺癌组织中具有高浓度的雌激素环境，促进乳腺癌的复发和转移。因此，故给绝经后的乳腺癌患者服用芳香化酶抑制剂是比较有效的治疗乳腺癌的的一种途径。

[0005] 芳香化酶抑制剂的作用机制是通过抑制肾上腺、肝、脂肪包括乳腺癌组织中的芳香化酶，阻止其利用雄烯二酮及睾酮产生雌激素，从而降低雌激素水平，抑制雌激素依赖性癌细胞生长。大多数乳腺癌组织中芳香化酶具有肿瘤内活性，这种活性与肿瘤内雌激素水平直接有关，芳香化酶抑制剂对其具有显著的抑制作用，而抑制肿瘤细胞内的芳香化酶活性有助于抑制肿瘤细胞的生长，由于肾上腺和脂肪组织也可产生雌激素，且为绝经后妇女外周血雌激素的主要来源，故可将芳香化酶抑制剂作为绝经后妇女，特别是雌激素依赖性乳腺癌患者的内分泌治疗的一个重要方向。

[0006] 从芳香化酶的生理功能及其结构特点来考虑，芳香化酶抑制剂的作用机制分为两种：一种是与酶的天然底物具有相似的结构，可以竞争芳香化酶的结合位点，此类抑制剂多为雄烯二酮的类似物；另外一种是结构中具有杂原子(如S，O，N等) ，这些杂原子可以和血红素中的铁原子结合。此外，还有一些抑制剂通过抑制相应基因的表达，间接地抑制芳香化酶的活性；一些天然产物也具有芳香化酶抑制作用，也可作为芳香化酶的竞争性抑制剂。

[0007] 按照化合物结构分类,，可以芳香化酶抑制剂分为两型：Ⅰ型是雄烯二酮的甾体类似物，甾体类芳香化酶抑制剂是一类含有雄烯二酮母环结构的化合物,属于类固醇类芳香化酶失活剂，不可逆地结合于芳香化酶的雄烯二酮位点，起到酶灭活效应，主要包括第2代的福美司坦和第3代的依西美坦；Ⅱ型是非甾体性抑制剂，属于非类固醇类的芳香化酶抑制剂，可通过一个基本氮原子可逆地与芳香化酶的亚铁血红素结合，阻碍NADPH 脱氢氧化过程，从而抑制芳香化酶的活性。另外，从天然产物中提取出的一些化合物及其衍生物也表现出了相当的芳香化酶的抑制活性。

[0008] 天然产物类非甾体类抑制剂—黄酮类化合物是一类天然植物雌激素，许多植物中都含有这类物质，前已有文献报道黄酮、异黄酮和二氢黄酮类化合物具有抑制芳香化酶的作用.按临床发展的时序，芳香化酶抑制剂可以分为3代: 包括第1代的氨鲁米特，第2代的法曲唑(Fadrozole) 罗谷亚胺(Rogletimide)和第3代的阿那曲唑(Anastrozole)、来曲唑(Letrozole)、伏氯唑(Vorozole)。

[0009] 第1代芳香化酶抑制剂的代表药物为氨鲁米特,该药能抑制肾上腺所有类固醇激素的合成,起到药物性肾上腺切除的作用,但发现此药的选择性太差，副作用较大,使用不方便而先后在国外和国内停用。

[0010] 第2代芳香化酶抑制剂第二代产品主要有非甾体类的法曲唑Fadrozole和甾体类的福美司坦(Formestane,商品名兰特隆,Lentaron),两者在选择性上有所改进,副作用明显减少。其中,在作用机制上,福美司坦还能以共价键形式与芳香化酶产生不可逆的自杀性结合。但是其疗效并不优于他莫昔芬，主要问题仍然是选择性不太高，其他第2代芳香化酶抑制剂未被批准临床应用。

[0011] 第3代芳香化酶抑制剂主要包括来曲唑(Letrozole)、阿那曲唑(Anastrozole)、依西美坦(Exemestane)。与第1、2代相比，第3代芳香化酶抑制剂其抑制全身芳香化酶活性和雌激素水平有很大幅度的提高，基本达到了理想化的要求，对其他类固醇激素的代谢不产生干扰，选择性更高、特异性更强、耐受性更好，且无交叉耐药性，对皮质醇或醛固酮的代谢几乎没有影响，高龄患者和一些脏器功能障碍患者的耐受性也很好。且均为口服制剂，服用方便，副作用少。

[0012] 黄酮类化合物是在植物中分布最广的一类物质，几乎存在于每种植物体内，它们常以游离态或与糖结合的形式存在。它对植物的生长、发育、开花、结果以及抵御异物的侵入起着重要作用。由于其分布广且部分化合物在植物中的含量较高，而且多数化合物容易以结晶形式获得，所以它是较早被人类发现的一类天然产物。

[0013] 黄酮类化合物具有抗脑缺血作用、抗心肌缺血作用、抗心律失常作用、抗自由基作用、镇痛作用、肝保护作用、对消化性溃疡的保护作用、抗病毒抗肿瘤作用。

[0014] 此外，还有大量研究表明黄酮类化合物有降压、降血脂、抑制血小板聚集等多种药理作用，说明黄酮类化合物确有多种生物学活性，并且该类化合物种类繁多，在植物中广泛存在，毒性较低，应是今后新药开发研究中一个值得重视的资源，有很大的开发利用前景。

发明内容

[0015] 本发明的目的在于，在目前关于黄酮类芳香化酶抑制剂的研究较少，并且已报道的黄酮类芳香化酶抑制剂的活性并不高的情况下，本发明试图设计与合成新的黄酮类芳香化酶抑制剂，以期能给乳腺癌的治疗带来新的希望。

[0016] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

[0017] 一种通过氰甲基化/烷基化反应的黄酮类芳香化酶抑制剂，其特征在于：其结构通式如下：

[0018]

[0019] R1选自-OH或H中的任意一种，R2选自-H或-OCH3中的任意一种,R3选自-H、-OH或-OCH2CN中的任意一种；R4选自-OH、-OCH2Ph或-2-（2-甲氧基-2氧代乙基）苄氧基中的任意一种，R5选自-OCH2Ph或-OCH3中的任意一种，R6选自-OCH3。

[0020] 本发明黄酮类芳香化酶抑制剂，其典型的化合物如下：

[0021]

[0022] 2-（4-（7-（氰甲基氧基）-4-氧代-4H-苯并吡喃酮-3-基）苯氧基）乙腈；

[0023]

[0024] 2- （5-羟基-2-苯基-4H-苯并吡喃酮-7-氧）乙腈；

[0025]

[0026] 2- （（2-（4-（氰甲基氧基）-3-羟基苯基）-5-羟基-4-氧代-4H-苯并吡喃酮-7-基）氧基）乙腈

[0027]

[0028] 2-（4-（7-（氰甲基氧基）-5-羟基-4-氧代-4H-苯并吡喃酮-2-基）苯氧基）乙腈；

[0029]

[0030] 2- （（5-羟基-2-（4-羟基苯基）-4-氧代-苯并吡喃酮-7-基）氧基）乙腈；

[0031]

[0032] 2-（3,4-二甲氧基苯基）-3-羟基-5,7-二甲氧基-4H-苯并吡喃-4-酮；

[0033]

[0034]  2-（3,4-二甲氧基苯基）-3,5,7-三甲氧基-4H-苯并吡喃-4-酮；

[0035]

[0036] 3-（苄氧基）-2-（3,4-二甲氧基苯基）-5-羟基-7-甲氧基-4H-苯并吡喃-4-酮；

[0037]

[0038] 2-（2 - （（2-（3,4-二甲氧基苯基）-5,7-二甲氧基-4-氧代-4H-苯并吡喃-3-基）氧基）甲基）苯基）乙酸甲酯；

[0039]

[0040] 2-（2 - （（2-（3,4-二甲氧基苯基）-5-羟基-7-甲氧基-4-氧代-4H-苯并吡喃-3-基）氧基）甲基）苯基）乙酸甲酯

[0041] 本发明更进一步公开了芳香化酶抑制剂在抑制芳香化酶药物中的应用。实验结果显示：黄酮类芳香化酶抑制剂可以用于治疗乳腺癌药物中。本发明通过氰甲基化反应和烷基化反应设计并合成了10个黄酮类化合物，所有化合物结构均经过了分析验证及活性测试，本黄酮类抑制剂抑制芳香化酶的活性最高为IC50=0.251µmol/L。这预示本发明的芳香化酶抑制剂在低浓度下即可产生非常优秀的芳香化酶抑制作用。

附图说明

[0042] 图1为黄酮类芳香化酶抑制剂结构通式图。

具体实施方式

[0043] 下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。其中的大豆素、木犀草素、芹菜素、柚皮素、芦丁、甲基化槲皮素、异色酮等原料均有市售。

[0044] 实施例1

[0045] 1.2-（4-（7-（氰甲基氧基）-4-氧代-4H-苯并吡喃酮-3-基）苯氧基）乙腈的合成及芳香化酶抑制活性

[0046] 2.2-（4-（7-（氰甲基氧基）-4-氧代-4H-苯并吡喃酮-3-基）苯氧基）乙腈制备[0047] 取干燥的50mL圆底烧瓶，称取7-羟基-3-（4-羟基苯基）-4H-苯并吡喃-4-酮（大豆素，0.2543g，1mmol）放入其中，再滴加N，N'-二甲基甲酰胺（DMF，3mL）于瓶中，在室温状态下搅拌5min，再称取氢化钠（0.0480g，2mmol）加入到反应液中，继续搅拌至不再冒出气饱，然后在室温下向其中滴加氯乙腈（503µL，4mmol），反应30min后补加氯乙腈（76µL,1mmol），将反应瓶放入61℃的油浴中继续搅拌，随后反应13小时，TLC监测，直至原料反应完全。将反应溶液转移至500mL烧杯中，加入蒸馏水300mL并用玻璃棒搅拌，随后加入乙酸乙酯萃取，有机物分层，分液漏斗分液得到有机层，并用水和盐水多次洗涤至盐水澄清，再加入无水Mg2SO4干燥，然后减压旋蒸得到粗产物，粗产物用硅胶柱层析色谱进行分离提纯(200目硅胶)，洗脱剂为（石油醚/乙酸乙酯），得到所要产品(0.0763g，30％)，产品为淡黄色固体。反应式如下：

[0048]

[0049] H NMR见图1，其中：1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)) δ 9.75 (s, 1H), 8.43 (s, 1H), 8.10 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 7.39 (t, J = 5.9 Hz, 3H), 7.20 (dd, J = 8.9, 
2.5 Hz, 1H), 6.85 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 5.39 (s, 2H)。

[0050] 2-（4-（7-（氰甲基氧基）-4-氧代-4H-苯并吡喃酮-3-基）苯氧基）乙腈的芳香化酶抑制活性测定：

[0051] ⑴ 测定原理

[0052] 在NADPH循环再生条件下，芳香化酶可催化7-甲氧基-4-三氟甲基香豆素(7-Methoxy-4- trifluoromethylcoumarin,MFC)转化成为7-羟基-4-三氟甲基香豆素(7-Hydroxytrifluorom -ethylcoum arin  ,HFC)，催化机理与芳香化酶催化雄性激素转变为雌性激素相同，根据产物7-羟基-4-三氟甲基香豆素的荧光峰值变化(激发波波长为409nm，吸收波波长为530nm)可以用来测定芳香化酶的活性，在芳香化酶抑制剂的存在条件下，可通过对照实验来评价化合物作为芳香化酶抑制剂的生物活性。7-甲氧基-4-三氟氧基香豆素脱烷基反应系统如下：

[0053]

[0054] ⑵ 芳香化酶活性测定试剂盒成分及储存条件

[0055]

[0056] 一个96孔板可以测定5个待测化合物，一个阳性对照（来曲唑），一个控制组（无芳香化酶抑制剂），一个空白对照组（无芳香化酶抑制剂和CYP19），每个待测化合物都是平行测定2次，以保证测定结果的准确性。

[0057] ⑶实验步骤

[0058] <1> 溶液的配制

[0059] 向终止液中加入72 mL乙腈并混匀，在室温下储存备用；将7-甲氧基-4-三氟甲基香豆素（MFC）溶解于200uL乙腈（终浓度为25mM）中，储存于-20°C冰箱中备用。将KTZ溶解于30uL乙腈（终浓度2mM）中，储存于-20°C冰箱中备用。将来曲唑溶解于1mL乙腈（终浓度34.35 mM）中，储存于-20°C冰箱中备用。称取化合物5-10 mg，根据不同化合物的不同的相对分子质量，加入不同体积的乙腈，使其充分混匀溶解，配制浓度为0.5mM的溶液。

[0060] <2> 制标准曲线

[0061] 解冻0.25mM HFC（7-羟基-4-三氟甲基香豆素）标准溶液。将138uL  NADPH-Confactors混合液（无乙腈）加入到96孔板中标准曲线组的两行中每一行的孔1中。向两行中的每一行的1个孔中加入12uL HFC（7-羟基-4-三氟甲基香豆素）标准品。在每个孔中通过吸移混合3至5次。向孔2至12中加入100uL NADPH-Confactors混合液（无乙腈）。从孔1到孔8连续稀释50 uL，混合均匀。从孔8中弃去额外的50uL混合液。向所有孔1至12中加入75 uL终止液，混合均匀。向所有孔1至12中加入100uLEnzyme/Substrate（酶/底物）混合液。在每个孔中通过吸移混合3至5次。（注意：使用此步骤，孔1将含有2000 pmol的标准品。剩余的孔2至8是三分之一系列稀释液（即 666.6,222.2,74,24.7,8.22,2.74和0.91pmol）。孔9至12是空白。

[0062] <3> 待测化合物和阳性对照（来曲唑）的系列稀释

[0063] 将约100mL去离子水和缓冲液放置在恒温培养箱中预温至37℃。将试剂盒从-80℃冰箱中取出并放置在冰上，随后将其放置在通风厨中解冻。

[0064] 取10mLEP管，制备NADPH-Confactors混合液：加入118µLConfactors，94µLG6PDH和63µL Control Protein至9127µL 37℃去离子水中，均匀混合；对于每行测试化合物和来曲唑（阳性对照试剂），加入119uL NADPH-Confactors混合液到列1或7的每个孔中。

[0065] 取10mLEP管，制备Cofactor-Acetonitrile 混合液：取77mLNADPH-Confactors混合液于10mLEP管，再加入3.2mL乙腈并混合均匀。对于剩余的列2至6或8至12，向每个孔中加入100uL的Cofactor-Acetonitrile 混合液。

[0066] 将6uL待测化合物和阳性对照（来曲唑）加入到96孔板中每行IC50的第1列或第7列。通过吸移3至5次混合均匀。对于每一行，从列1至列6或从列7至列12连续稀释25uL，通过吸移3至5次混合均匀。从第6列或第12列舍弃额外的25uL。将96孔板加盖放在37℃预温孵10分钟。

[0067] <4> 酶底物混合物的制备/反应起始和终止

[0068] 制备Enzyme/Substrate（酶/底物）混合液：取10mLEP管，加入104uL预热的缓冲液，408uL的37℃去离子水，7.8uL HTS-760（CYP19）和1.1uLMFC（7-甲氧基-4-三氟甲基香豆素），混合均匀。在96孔板预温孵10分钟后，从37℃恒温培养箱中取出并移开96孔板盖，加入Enzyme/Substrate（酶/底物）混合液到所有测试行的第1-6行或7-12行化合物和阳性对照,混合均匀。将96孔板加盖并放在37℃温孵30min（或45min）。30min(45min)后，从培养箱中取出96孔板，并向所有孔中加入75uL终止液。将100μLEnzyme/Substrate（酶/底物）混合液加入到空白对照组。

[0069] <5> 读取测定结果

[0070] 使用公共实验室酶标仪测定上述混合液的荧光值，在激发波长为409nm和发射波长为530nm的条件下读取数值。

[0071] <6> 分析测定结果及计算待测化合物的IC50值

[0072] 酶标仪可以测定待测化合物的荧光峰值，减去空白值以获得净荧光信号。可以通过与标准曲线比较来计算每孔形成的pmol产物的数目。或者，可以直接从净荧光信号确定相同的IC50值，而不使用标准曲线。计算每种抑制剂浓度相对于没有抑制剂的孔的抑制百分比（控制组数值的平均值）。确定包含抑制率为50％（高浓度和低浓度）的测试化合物的浓度。

[0073] 按实施例1中步骤3中所述芳香化酶抑制剂活性测定方法测定，得该化合物抑制芳香化酶的IC50为0.36±0.09µM

[0074] 实施例2

[0075] 2-( 5-羟基-2-苯基-4H-苯并吡喃酮-7-氧) 乙腈的合成及芳香化酶抑制活性[0076] 2-( 5-羟基-2-苯基-4H-苯并吡喃酮-7-氧) 乙腈制备

[0077] 取干燥的50mL圆底烧瓶，称取5,7-二羟基-2-苯基-4H-苯并吡喃酮-4-酮（白杨素，0.2543g，1 mmol）放入其中，再滴加N，N'-二甲基甲酰胺（DMF，3mL）于瓶中，在室温状态下搅拌5min，再称取氢化钠（0.0480g，2mmol）加入到反应液中，继续搅拌至不再冒出气饱，然后在室温下向其中滴加氯乙腈（503µL，4mmol），反应30min后补加氯乙腈（76µL,1 mmol），将反应瓶放入61℃的油浴中继续搅拌，随后反应 13小时，TLC监测，直至原料反应完全。将反应溶液转移至500mL烧杯中，加入蒸馏水300mL并用玻璃棒搅拌，随后加入乙酸乙酯萃取，有机物分层，分液漏斗分液得到有机层，并用水和盐水多次洗涤至盐水澄清，再加入无水Mg2SO4干燥，然后减压旋蒸，得到粗产物，粗产物用硅胶柱层析色谱进行分离提纯(200目硅胶)，洗脱剂为（石油醚/乙酸乙酯），得到所要产品(0.0712g，28％)，产品为淡黄色针状固体。反应式如下：

[0078]

[0079] H NMR：1H NMR (400 MHz, Acetone-d6) δ 12.94 (s, 1H), 8.08 (d, J = 7.1 Hz, 2H), 7.61 (d, J = 7.6 Hz, 3H), 7.08 – 6.73 (m, 2H), 6.50 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 5.28 (s, 2H)。

[0080] 2-( 5-羟基-2-苯基-4H-苯并吡喃酮-7-氧) 乙腈的芳香化酶抑制活性测定[0081] 按实施例1中步骤3中所述芳香化酶抑制剂活性测定方法测定，得该化合物抑制芳香化酶的IC50为0.46±0.14µM。

[0082] 实施例3

[0083] 2 - （（2-（4-（氰甲基氧基）-3-羟基苯基）-5-羟基-4-氧代-4H-苯并吡喃酮-7-基）氧基）乙腈合成及芳香化酶抑制活性

[0084] 2 - （（2-（4-（氰甲基氧基）-3-羟基苯基）-5-羟基-4-氧代-4H-苯并吡喃酮-7-基）氧基）乙腈制备

[0085] 取干燥的50mL圆底烧瓶，称取2-（3,4-二羟基苯基）-5,7-二羟基-4H-苯并吡喃酮-4-酮（木犀草素，0.2862g，1 mmol）放入其中，再滴加N，N'-二甲基甲酰胺（DMF，3mL）于瓶中，在室温状态下搅拌5min，再称取氢化钠（0.0480g，2mmol）加入到反应液中，继续搅拌至不再冒出气饱，然后在室温下向其中滴加氯乙腈（503µL，4mmol），反应30min后补加氯乙腈（76µL,1 mmol），将反应瓶放入61℃的油浴中继续搅拌，随后反应 13小时，TLC监测，直至原料反应完全。将反应溶液转移至500mL烧杯中，加入蒸馏水300mL并用玻璃棒搅拌，随后加入乙酸乙酯萃取，有机物分层，分液漏斗分液得到有机层，并用水和盐水多次洗涤至盐水澄清，再加入无水Mg2SO4干燥，然后减压旋蒸，得到粗产物，粗产物用硅胶柱层析色谱进行分离提纯(200目硅胶)，洗脱剂为（石油醚/乙酸乙酯），得到所要产品(0.0887g，31％)，产品为淡黄色固体。反应式如下：

[0086]

[0087] HNMR分析：1H NMR (400 MHz, Acetone-d6) δ 12.38 (s, 1H), 10.46 (s, 1H), 7.43 (d, J = 1.7 Hz, 2H), 6.95 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.62 (s, 1H), 6.12 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 5.79 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 4.90 (d, J = 10.3 Hz, 4H)。

[0088] 2 - （（2-（4-（氰甲基氧基）-3-羟基苯基）-5-羟基-4-氧代-4H-苯并吡喃酮-7-基）氧基）乙腈芳香化酶抑制活性测定

[0089] 按实施例1中步骤3中所述芳香化酶抑制剂活性测定方法测定，得该化合物抑制芳香化酶的IC50为0.76±0.17µM。

[0090] 实施例4

[0091] 2-（4-（7-（氰甲基氧基）-5-羟基-4-氧代-4H-苯并吡喃酮-2-基）苯氧基）乙腈合成及芳香化酶抑制活性

[0092] 2-（4-（7-（氰甲基氧基）-5-羟基-4-氧代-4H-苯并吡喃酮-2-基）苯氧基）乙腈的制备

[0093] 取干燥的50mL圆底烧瓶，称取5,7-二羟基-2-（4-羟基苯基）-4H-苯并吡喃-4-酮（芹菜素，0.2702g，1 mmol）放入其中，再滴加N，N'-二甲基甲酰胺（DMF，3mL）于瓶中，在室温状态下搅拌5min，再称取氢化钠（0.0480g，2mmol）加入到反应液中，继续搅拌至不再冒出气饱，然后在室温下向其中滴加氯乙腈（503µL，4mmol），反应30min后补加氯乙腈（76µL,1 mmol），将反应瓶放入61℃的油浴中继续搅拌，随后反应 13小时，TLC监测，直至原料反应完全。将反应溶液转移至500mL烧杯中，加入蒸馏水300mL并用玻璃棒搅拌，随后加入乙酸乙酯萃取，有机物分层，分液漏斗分液得到有机层，并用水和盐水多次洗涤至盐水澄清，再加入无水Mg2SO4干燥，然后减压旋蒸，得到粗产物，粗产物用硅胶柱层析色谱进行分离提纯(200目硅胶)，洗脱剂为（石油醚/乙酸乙酯），得到所要产品(0.0880g，32.6％)，产品为淡黄色固体。反应式如下：

[0094]

[0095] HNMR分析：1H NMR(400 MHz, DMSO-d6) δ 12.94 (s, 1H), 8.16 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 7.30 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.06 (s, 1H), 7.00 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.57 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 5.35 (d, J = 1.5 Hz, 4H)。

[0096] N-(3-溴-4-硝基苯基)-N-（2-氰基苄基）-4-胺基-1,2,4-三氮唑芳香化酶抑制活性测定

[0097] 按实施例1中步骤3中所述芳香化酶抑制剂活性测定方法测定，得该化合物抑制芳香化酶的IC50为0.86±0.08µM。

[0098] 实施例5

[0099] 2 - （（5-羟基-2-（4-羟基苯基）-4-氧代-苯并吡喃酮-7-基）氧基）乙腈合成及芳香化酶抑制活性

[0100] 2 - （（5-羟基-2-（4-羟基苯基）-4-氧代-苯并吡喃酮-7-基）氧基）乙腈的制备[0101] 取干燥的50mL圆底烧瓶，称取5,7-二羟基-2-（4-羟基苯基）苯并二氢吡喃-4-酮（柚皮素，0.2723g，1 mmol）放入其中，再滴加N，N'-二甲基甲酰胺（DMF，3mL）于瓶中，在室温状态下搅拌5min，再称取氢化钠（0.0480g，2mmol）加入到反应液中，继续搅拌至不再冒出气饱，然后在室温下向其中滴加氯乙腈（503µL，4mmol），反应30min后补加氯乙腈（76µL,1 mmol），将反应瓶放入61℃的油浴中继续搅拌，随后反应 13小时，TLC监测，直至原料反应完全。将反应溶液转移至500mL烧杯中，加入蒸馏水300mL并用玻璃棒搅拌，随后加入乙酸乙酯萃取，有机物分层，分液漏斗分液得到有机层，并用水和盐水多次洗涤至盐水澄清，再加入无水Mg2SO4干燥，然后减压旋蒸，得到粗产物，粗产物用硅胶柱层析色谱进行分离提纯(200目硅胶)，洗脱剂为（石油醚/乙酸乙酯），得到所要产品(0.0880g，32.60％)，产品为淡黄色固体。反应式如下：

[0102]

[0103] HNMR分析：1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.09 (s, 1H), 9.61 (s, 1H), 7.33 (s, 2H), 6.80 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 6.25 (d, J = 11.2 Hz, 2H), 5.54 (dd, J = 13.0, 2.8 Hz, 1H), 5.24 (s, 2H), 3.50 – 3.28 (dd, 1H), 2.75 (dd, J = 
17.2, 3.0 Hz, 1H)。

[0104] 2 - （（5-羟基-2-（4-羟基苯基）-4-氧代-苯并吡喃酮-7-基）氧基）乙腈芳香化酶抑制活性测定：

[0105] 按实施例1中步骤3中所述芳香化酶抑制剂活性测定方法测定，得该化合物抑制芳香化酶的IC50为0.56±0.07µM。

[0106] 实施例6

[0107] 2-（3,4-二甲氧基苯基）-3-羟基-5,7-二甲氧基-4H-苯并吡喃-4-酮合成及芳香化酶抑制活性

[0108] 1.2-（3,4-二甲氧基苯基）-3-羟基-5,7-二甲氧基-4H-苯并吡喃-4-酮的制备[0109] 取一个干净且干燥的500mL圆底烧瓶，用分析天平称取芦丁（6g，9.828mmoL）和K2CO3(20g,144.7mmoL)先后放置其中，加入15mL丙酮使上述混合物溶解，加入30管硫酸二甲酯，60℃搅拌回流。每隔一段时间，向反应液中补加硫酸二甲酯5-10管，共补加两次。反应进行到12h时，再加入10管硫酸二甲酯，继续反应12h。反应结束后，滴加氨水（从冷凝管上方滴加），直至不再沸腾为止（碱性，这一步主要为除去硫酸二甲酯）。将上述反应混合液旋干，加水，再加入二氯甲烷（ρ=1.325g/mL）萃取，用分液漏斗分液得到二氯甲烷萃取液，将萃取液旋干，加入10%HCl溶液至溶解，然后在烧瓶的内壁四周滴加少量乙醇，溶解内壁上的固体。处理完以后，加热，70℃回流3h，水解，得到絮状固体，抽滤，得粗品，粗产物用硅胶柱层析色谱进行分离提纯(200目硅胶)，洗脱剂为（石油醚/乙酸乙酯），得到所要产品(2.16g，
36.0％)，产品为淡黄色固体收率为36%。反应式如下：

[0110]

[0111] HNMR分析：1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 7.81 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.77 (s, 1H), 7.13 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 6.86 (s, 1H), 6.48 (s, 1H), 3.91 (s, 3H), 3.85 (d, J = 9.1 Hz, 9H).

[0112] 2.N-(3-溴-4-硝基苯基)-N-（3-三氟甲基苄基）-4-胺基-1,2,4-三氮唑芳香化酶抑制活性测定

[0113] 按实施例1中步骤3中所述芳香化酶抑制剂活性测定方法测定，得该化合物抑制芳香化酶的IC50为0.251±0.02µM。

[0114] 实施例7

[0115] 2-（3,4-二甲氧基苯基）-3,5,7-三甲氧基-4H-苯并吡喃-4-酮的合成及芳香化酶抑制活性

[0116] 2-（3,4-二甲氧基苯基）-3,5,7-三甲氧基-4H-苯并吡喃-4-酮的制备

[0117] 取干净且干燥的500mL圆底烧瓶，分析天平称取芦丁（6g，9.828mmoL）和K2CO3（20g，144.8mmoL）置于瓶中。加入10%HCl溶液至溶解，然后可以在烧瓶的内壁四周滴加少量乙醇，溶解内壁上的固体。处理完以后，加热至70℃回流3h，水解，得到絮状固体，抽滤，得粗品。

[0118] 加入15mL丙酮（能使上述粉末溶解为宜），加入30管硫酸二甲酯（59.95g，475.3mmoL），在60℃条件下搅拌回流。每隔一段时间，补加硫酸二甲酯5-10管，加两次。反应进行到12h时，停止加热，使温度降至室温，加入适量NaH粉末（少量为宜，不可多加，注意要少量加入，防止暴沸），加完NaH后，再加入10管硫酸二甲酯，开始加热至60℃，继续反应12h。
反应结束后，滴加氨水（从冷凝管上方滴加），直至不再沸腾为止（碱性，这一步主要为除去硫酸二甲酯）。将上述反应液旋干，加水，二氯甲烷萃取分层，用250mL分液漏斗分液得到有机层，减压旋干，粗产物用硅胶柱层析色谱进行分离提纯(200目硅胶)，洗脱剂为（石油醚/乙酸乙酯），得到所要产品(1.827g，30.60％)。反应式如下：

[0119]

[0120] HNMR分析：1HNMR (400 MHz, DMSO-d6) 7.81 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.77 (s, 1H), 7.13 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 6.86 (s, 1H), 6.48 (s, 1H), 3.91 (s, 3H), 3.85 (d, J = 9.1 Hz, 12H)。

[0121] 2-（3,4-二甲氧基苯基）-3,5,7-三甲氧基-4H-苯并吡喃-4-酮芳香化酶抑制活性测定

[0122] 按实施例1中步骤3中所述芳香化酶抑制剂活性测定方法测定，得该化合物抑制芳香化酶的IC50为18.60±0.13µM。

[0123] 实施例8

[0124] 3-（苄氧基）-2-（3,4-二甲氧基苯基）-5-羟基-7-甲氧基-4H-苯并吡喃-4-酮的合成及芳香化酶抑制活性

[0125] 3-（苄氧基）-2-（3,4-二甲氧基苯基）-5-羟基-7-甲氧基-4H-苯并吡喃-4-酮的制备

[0126] 取干净且干燥的50mL圆底烧瓶，分析天平称量完全甲基化槲皮素的粗品（0.5000g），K2CO3（1.000g，7.235mmoL），加入少量KI作催化剂，加入3mLDMF，滴加3管氯苄，70℃加热回流3h。反应结束后，将反应混合液转至250mL分液漏斗中，加水100mL，加入适量二氯甲烷萃取，静置一段时间，分层，得有机层。粗产物用硅胶柱层析色谱进行分离提纯(200目硅胶)，洗脱剂为（石油醚/乙酸乙酯），得到所要产品(0.163g，32.60％)。反应式如下：

[0127]

[0128] HNMR分析：1H-NMR(DMSO-d6) 7.624 7.610（2H, d,J = 8.6 Hz）,7.420 (1H, s), ~7.404 (1H, s), 7.344 7.326 (3H, m), 7.086 7.064(1H, d, J = 8.6 Hz), 6.797~ ~ ~
6.792(1H, d, J = 8.2 Hz), 6.458 6.481(1H, d, J = 8.2 Hz), 5.001(2H, s), 3.897~
(3H, s), 3.846(3H, s), 3.832(3H, s), 3.623(3H, s)。

[0129] N-(3-苄基-4-硝基苯基)-N-苄基-4-胺基-1,2,4-三氮唑芳香化酶抑制活性测定[0130] 按实施例1中步骤3中所述芳香化酶抑制剂活性测定方法测定，得该化合物抑制芳香化酶的IC50为2.73±0.17µM。

[0131] 实施例9

[0132] 2-（2 - （（2-（3,4-二甲氧基苯基）-5,7-二甲氧基-4-氧代-4H-苯并吡喃-3-基）氧基）甲基）苯基）乙酸甲酯的合成及芳香化酶抑制活性

[0133] 2-（2 - （（2-（3,4-二甲氧基苯基）-5,7-二甲氧基-4-氧代-4H-苯并吡喃-3-基）氧基）甲基）苯基）乙酸甲酯的制备

[0134] 2-氯甲基苯乙酸甲酯的制备：取干净且干燥的250mL圆底烧瓶，分析天平称取异色酮（5g，33.75mmoL）置于瓶中，再加入13mL甲醇，随后将圆底烧瓶放在冰水浴中，缓慢地逐滴滴加二氯亚砜(小心SOCl2放热迸溅），共加入15mL，继续反应2h。称取K2CO3（15g，108.5mmoL），加蒸馏水配制成10%K2CO3溶液，滴加到反应液中调节pH>6，用乙酸乙酯萃取有机层，加入无水硫酸镁过夜，抽滤，旋转蒸发浓缩得无色油状液体。

[0135]

[0136] 取干净且干燥的250mL圆底烧瓶，分析天平称量完全甲基化槲皮素的粗品（0.500g），2-氯甲基苯乙酸乙酯（0.6800g，4.246mmoL），加入K2CO（3 1.000g，7.235mmoL），再加入少量KI（0.05g，3.012mmoL）（作催化剂），加入3mLDMF，使其固体粉末溶解，在70℃条件下搅拌回流3h，用TLC跟踪检测至反应完全。反应结束后，将反应液转至250mL分液漏斗中，加入100mL水，加入适量二氯甲烷萃取，静置一段时间，分层，得有机层。粗产物用硅胶柱层析色谱进行分离提纯(200目硅胶)，洗脱剂为（石油醚/乙酸乙酯），得到所要产品(0.1480g，
29.60％);

[0137]

[0138] HNMR分析：1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 7.55(d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.24(d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.20(s, 1H), 7.07(s, 1H), 7.03(s, 1H), 6.81 (d, J =7.8 Hz, 1H), 6.52(s, 1H), 6.29(d, J = 6.8 Hz, 1H), 5.90(s, 2H), 4.35(s, 2H), 4.08(m, J = 8.2 Hz, 2H), 3.91(d, J = 5.4 Hz, 1H), 3.83(s, 1H), 3.79(d, J = 7.8 Hz, 
6H), 3.68(d, J = 4.6 Hz, 1H), 3.17(d, J = 4.8 Hz, 3H)。

[0139] 2-（2 - （（2-（3,4-二甲氧基苯基）-5,7-二甲氧基-4-氧代-4H-苯并吡喃-3-基）氧基）甲基）苯基）乙酸甲酯芳香化酶抑制活性测定

[0140] 按实施例1中步骤3中所述芳香化酶抑制剂活性测定方法测定，得该化合物抑制芳香化酶的IC50为0.75±0.11µM。

[0141] 实施例10

[0142] 2-（2 - （（2-（3,4-二甲氧基苯基）-5-羟基-7-甲氧基-4-氧代-4H-苯并吡喃-3-基）氧基）甲基）苯基）乙酸甲酯的合成及芳香化酶抑制活性

[0143] 2-（2 - （（2-（3,4-二甲氧基苯基）-5-羟基-7-甲氧基-4-氧代-4H-苯并吡喃-3-基）氧基）甲基）苯基）乙酸甲酯的制备

[0144] 取干燥且干净的250mL圆底烧瓶，分析天平称量非完全甲基化槲皮素的粗品（0.500g），2-氯甲基苯乙酸乙酯（0.6800g，4.246mmoL）和K2CO（3 1.000g，7.238mmoL），再加入少量KI（0.05g，3.012mmoL，作催化剂），加入3mLDMF，使其固体粉末溶解。将烧瓶置于70℃条件下回流3h，用TLC跟踪检测至反应完全。反应结束后，转移至250mL分液漏斗中，加入100mL水，加入适量二氯甲烷萃取，静置一段时间，分层，得有机层。粗产物用硅胶柱层析色谱进行分离提纯(200目硅胶)，洗脱剂为（石油醚/乙酸乙酯），得到所要产品(0.1580g，31.60％)。

[0145]

[0146] HNMR分析：1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 7.55(d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.24(d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.20(s, 1H), 7.07(s, 1H), 7.03(s, 1H), 6.81 (d, J =7.8 Hz, 1H), 6.52(s, 1H), 6.29(d, J = 6.8 Hz, 1H), 5.90(s, 2H), 5.05(s,1H), 4.35(s, 
2H), 4.08(m, J = 8.2 Hz, 2H), 3.91(d, J = 5.4 Hz, 1H), 3.83(s, 1H), 3.79(d, J = 6.8 Hz, 3H), 3.68(d, J = 5.6 Hz, 1H), 3.17(d, J = 4.8 Hz, 3H)。

[0147] 2. 2-（2 - （（2-（3,4-二甲氧基苯基）-5-羟基-7-甲氧基-4-氧代-4H-苯并吡喃-3-基）氧基）甲基）苯基）乙酸甲酯芳香化酶抑制活性测定

[0148] 按实施例1中步骤3中所述芳香化酶抑制剂活性测定方法测定，得该化合物抑制芳香化酶的IC50为1.651±0.09µM。

[0149] 实施例1（IC50=0.36±0.09µM）、实施例5（IC50=0.56±0.07µM）、实施例3（IC50=0.76±0.17µM）和实施例4（IC50=0.86±0.08µM）的基本骨架相同而活性不同。其中，实施例1的2位苯环上无取代基，活性最强；当2位苯环上的4’位为羟基取代时（实施例3），活性降低；当4’位羟基上的氢被-CH2CN取代时（实施例5），活性稍有升高；4’位羟基上的氢被-CH2CN取代的基础上，3’位羟基取代（实施例4），活性较实施例3高，但仍低于2位苯环无取代的活性。说明3’位和4’位的取代，会对化合物芳香化酶活性产生一定的影响。

[0150] 实施例6（IC50=0.251±0.02µm）、实施例8（IC50=2.73±0.17µm）、实施例9（IC50=0.75±0.11µm）和实施例10（IC50=1.651±0.09µm）基本骨架相同，比较后发现，实施例6与其他化合物不同之处在于它3位羟基上无取代基，使其芳香化酶活性最佳，其余化合物3位羟基上均连接给电子基团，使它们的芳香化酶活性较差。

[0151] 实施例11

[0152] 根据上文对10个化合物测定的结果，发现实施例6的芳香化酶抑制活性最好，因此用实施例6对人乳腺癌MCF-7/AR0裸小鼠皮下移植瘤疗效的比较研究。

[0153] 1受试药物

[0154] 药物名称: 2-（3,4-二甲氧基苯基）-3-羟基-5,7-二甲氧基-4H-苯并吡喃-4-酮，配置方法由实施例6制得。

[0155] 2实验动物

[0156] BALB/cA-nude裸小鼠,6-7周,♀,购自上海灵畅生物科技有限公司。生产许可证号: SCXK(沪) 2013-0018,动物合格证号2013001811147。饲养环境: SPF级。

[0157] 3实验步骤

[0158] 裸小鼠皮下接种人乳腺癌MCF-7/AR0细胞,待肿瘤生长至100-250mm3后,将动物随机分组(D0) 。给药剂量和给药方案见表1。溶剂组灌胃50mM柠檬酸+0.5%CMC+0.5%Tween80溶液;每周测2-3次瘤体积,称鼠重,记录数据。肿瘤体积(V)计算公式为:

[0159] V=1/2XaXb2其中a、b分别表示长、宽。

[0160] T/c(%) = (T-T0)/(c-c0) 100其中T、c为实验结東时的肿瘤体积;T0、c0为实验开始时的肿瘤体积。

[0161] 4试验结果

[0162] 乳腺癌MCF-7细胞表达雌激素受体,但不表达芳香化酶,MCF-7细胞稳定转染人芳香化酶后命名为MCF-7/AR0细胞。实施例6对MCF-7/AR0 裸小鼠皮下移植瘤的生长有一定抑制作用,抑瘤率为25 % 。荷瘤小鼠对实施例6能很好耐受,没有体重下降等症状发生。结果说明,实施例6对于治疗雌激素受体阳性、且表达芳香化酶的MCF-7/AR0皮下移植瘤有增效作用。

[0163] 表1.实施例6与来曲唑对人乳腺癌MCF-7/ARO裸小鼠皮下移植瘤的疗效

[0164]

[0165] D0:第一次给药时间；P值指与溶剂相比，采用Students’t检验。实验开始时小鼠数目：溶剂组n=12,治疗组n=6。