一种基于高梯度磁分离和量子点的荧光生物传感器及其应用

摘要

本发明提供一种基于高梯度磁分离和量子点的荧光生物传感器及其应用。本发明的荧光生物传感器含有高梯度磁分离装置和荧光检测系统，高梯度磁分离装置由环形磁铁阵列、磁铁支架、圆环通道和铁珠链组成；环形磁铁阵列和磁铁支架构成环形磁场生成器，每相邻两个磁铁相互排斥组装；圆环通道是由两个嵌套在一起的内毛细管和外毛细管组成，两个毛细管同轴固定后嵌套在环形磁铁阵列的同心圆内，内毛细管中填充有软磁材料的铁珠链，该铁珠链可被环形磁场磁化，使纳米磁珠均匀分布在圆环通道内，用于捕获目标物。本发明的荧光生物传感器可用于定量检测微生物，操作简单，分离效率高，灵敏度好，可在2小时内实现食品样本中少量目标细菌的定量检测。

权利要求

1.一种基于高梯度磁分离和量子点的荧光生物传感器，其特征在于，含有高梯度磁分离装置，该高梯度磁分离装置由环形磁铁阵列、磁铁支架、圆环通道和铁珠链组成；

其中，环形磁铁阵列和磁铁支架构成环形磁场生成器，所述环形磁铁阵列由多个规格相同的环形磁铁组成，并以圆心为中心轴相邻排列，每相邻两个环形磁铁是处于相互排斥状态；

所述圆环通道是由两个嵌套在一起的内毛细管和外毛细管组成，内毛细管中填充有直线排列的软磁材料铁珠链，两个毛细管同轴固定后嵌套在环形磁铁阵列的同心圆中。

2.如权利要求1所述的荧光生物传感器，其特征在于，所述环形磁铁的内径稍大于外毛细管的直径，确保外毛细管能够嵌入环形磁铁内径并保持与环形磁铁的紧密接触，环形磁铁的厚度为0.5-1.3mm；所述磁铁支架上均匀设置有用于固定环形磁铁的磁铁槽，每两个磁铁槽间隔为0.4-0.8mm。

3.如权利要求2所述的荧光生物传感器，其特征在于，所述环形磁铁的厚度为1.0mm。

4.如权利要求2所述的荧光生物传感器，其特征在于，所述磁铁支架上均匀设置有用于固定环形磁铁的磁铁槽，每两个磁铁槽间隔为0.5mm。

5.如权利要求1所述的荧光生物传感器，其特征在于，所述内毛细管的内径为0.9-

1.5mm，外径为1.2-1.8mm，外玻璃管的内径为1.5-2.1mm，外径为1.8-2.4mm；所述内毛细管、外毛细管的材质为石英玻璃、普通玻璃或有机玻璃。

6.如权利要求5所述的荧光生物传感器，其特征在于，所述内毛细管的内径为1.2mm。

7.如权利要求5所述的荧光生物传感器，其特征在于，所述内毛细管的外径为1.5mm。

8.如权利要求5所述的荧光生物传感器，其特征在于，所述外玻璃管的内径为1.8mm。

9.如权利要求5所述的荧光生物传感器，其特征在于，所述外玻璃管的外径为2.1mm。

10.如权利要求1-9任一所述的荧光生物传感器，其特征在于，所述软磁材料铁珠链使用的铁珠的直径小于内毛细管的内径，二者差距在0.1-0.5mm之间。

11.权利要求1-9任一所述的荧光生物传感器，其特征在于，当所述圆环通道置于所述环形磁场生成器中时，所述铁珠链将被磁化，并在所述铁珠链周围产生高梯度磁场，其应用如下：(1)将偶联蛋白G或蛋白A的磁珠注入所述圆环通道中，所述磁珠会被高梯度磁场捕获，均匀分布在圆环通道中，再注入目标物生物识别材料，生物识别材料与蛋白G或蛋白A孵育结合后，形成免疫磁珠，之后清洗除去多余抗体；

(2)向所述圆环通道中注入含有目标物的样本溶液，磁珠上的目标物生物识别材料捕获目标物，之后清洗除去样本背景，得到纯化和富集的磁珠-目标物复合体；目标物识别材料可以为目标物的单抗；

(3)向所述圆环通道中注入免疫量子点，所述磁珠-目标物复合体与免疫量子点发生免疫结合，形成磁珠-目标物-量子点复合物，之后清洗除去多余免疫量子点；

(4)将圆环通道从环形磁场发生器中取出，并将磁珠-目标物-量子点复合物从圆环通道中冲洗出来并回收，之后利用荧光检测系统进行检测，得到荧光强度值，最后利用标定曲线计算目标物的浓度。

12.权利要求1-9任一所述的荧光生物传感器在检测目标物中的应用。

13.如权利要求12所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将偶联蛋白G或蛋白A的磁珠注入圆环通道中，所述磁珠会被高梯度磁场捕获，均匀分布在圆环通道中，再注入目标物生物识别材料，生物识别材料与蛋白G或蛋白A孵育结合后，形成免疫磁珠，之后清洗除去多余抗体；

(2)向圆环通道中注入含有目标物的样本溶液，磁珠上的目标物生物识别材料捕获目标物，之后清洗除去样本背景，得到纯化和富集的磁珠-目标物复合体；

(3)向所述圆环通道中注入免疫量子点，所述磁珠-目标物复合体与免疫量子点发生免疫结合，形成磁珠-目标物-量子点复合物，之后清洗除去多余免疫量子点；

(4)将圆环通道从环形磁场发生器中取出，并将磁珠-目标物-量子点复合物从圆环通道中冲洗出来并回收，之后利用荧光检测系统进行检测，得到荧光强度值，最后利用标定曲线计算目标物的浓度。

14.如权利要求13所述的应用，其特征在于，步骤(1)的偶联蛋白G或蛋白A的磁珠溶于磷酸盐缓冲液中，用精密蠕动泵将其以1.1-1.3mL/min的高流速注入圆环通道中。

15.如权利要求13或14所述的应用，其特征在于，步骤(2)向圆环通道中注入含有目标物的样品溶液，循环3-4遍。

16.如权利要求15所述的应用，其特征在于，步骤(2)向圆环通道中注入含有目标物的样品溶液，循环3遍。

17.如权利要求13或14所述的应用，其特征在于，步骤(3)所述免疫量子点是将链霉亲和素化的量子点和生物素化的抗体混合孵育形成；所述目标物生物识别材料和所述生物素化的抗体与目标物的结合位点不同。

说明书

一种基于高梯度磁分离和量子点的荧光生物传感器及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物检测技术领域，更具体地，涉及一种基于高梯度磁分离和量子点的微生物检测方法。

背景技术

[0002] 近年来食品安全问题受到国际社会的广泛关注，在我国病原微生物是造成食品中毒的最主要因素，已严重威胁到了人民健康，并造成了巨大的经济损失。预防和控制食源性疾病爆发的一个关键是微生物污染食品的快速筛查。现有的细菌检测方法主要有培养法(对细菌而言)或分离法(对病毒而言)、免疫学方法(如ELISA)、分子生物学方法(如PCR)。传统的培养或分离法是金标准方法，准确性及灵敏度高，但耗时长；ELISA检测时间较短，特异性较好，易实现高通量，但灵敏度较低和假阳性率偏高；PCR检测时间也较短，灵敏度较高，但核酸提取操作复杂，且需要昂贵的仪器设备和专业的技术人员。

[0003] 荧光生物传感器是一种新型生物检测技术，具有灵敏度高、操作简单和非接触检测等优点，已被广泛报道用于病原微生物检测。量子点是一种常用的荧光材料，具有激发光谱宽、发射光谱窄、斯托克斯位移较大、光化学稳定性高和荧光寿命长等特点，常用于灵敏的生物检测分析。由于很多实际样本，如食品、粪便等，具有很复杂的背景，易造成假信号，因此将目标物从复杂样品溶液中分离出来是非常有必要的，也是目前亟需解决的一个关键问题。传统的过滤法和离心法是基于目标物的尺寸和质量进行分离，没有特异性，而近年来发展起来的免疫磁分离法是基于抗原抗体免疫反应，利用免疫磁珠和外加磁场将目标物从样本背景中分离出来并富集，虽然具有特异性，但这种方法通常只能处理小体积样本，且基本上都是手动操作，对操作人员要求较高。因此，开发一种分离效率较高、特异性较好的大体积样本微生物分离方法并与无接触检测、灵敏性较高的荧光生物传感器相结合应用于微生物检测具有重要意义。

发明内容

[0004] (一)要解决的技术问题

[0005] 本发明要解决的技术问题是研究一种大体积样本目标物特异分离和富集方法，并与荧光检测相结合，提高微生物或其他目标物的检测灵敏度和自动化操作水平，且缩短检测时间。

[0006] (二)技术方案

[0007] 为了解决上述问题，本方法设计的高梯度磁场，可进行大体积样本免疫磁分离，操作步骤较简单；本发明提供了一种基于高梯度磁分离的荧光生物传感器，用来快速检测微生物，该荧光生物传感器含有高梯度磁分离装置，该高梯度磁场分离装置由环形磁铁阵列、磁铁支架、圆环通道和铁珠链组成；

[0008] 其中，环形磁铁阵列和磁铁支架构成环形磁场生成器，所述环形磁铁阵列由多个规格相同的环形磁铁组成，并以圆心为中心轴相邻排列，每相邻两个环形磁铁是处于相互排斥状态；

[0009] 所述圆环通道是由两个嵌套在一起的内毛细管和外毛细管组成，内毛细管中填充有直线排列的软磁材料铁珠链，两个毛细管同轴固定后嵌套在环形磁铁阵列的同心圆中。

[0010] 在本申请的实施例中，环形磁场生成器包括96个环形磁铁和与之相对应以固定环形磁铁的磁铁支架，本领域技术人员应当理解，环形磁铁数目可多可少，不局限于本申请实施例所述的数量。

[0011] 所述环形磁铁的内径稍大于外毛细管的直径，确保外毛细管能够嵌入环形磁铁内径并保持与环形磁铁的紧密接触，环形磁铁的厚度为0.5-1.3mm，优选1.0mm；所述磁铁支架上均匀设置有用于固定环形磁铁的磁铁槽，每两个磁铁槽间隔为0.4-0.8mm，优选0.5mm。

[0012] 本发明的实施例中，环形磁铁的外径为5.5mm，内径为2.8mm，环形磁铁的厚度为1.0mm；所述磁铁支架长130mm，宽9.5mm，每个磁铁槽厚度为1.1mm，每两个磁铁槽间隔为
0.5mm。

[0013] 所述内毛细管的内径为0.9-1.5mm，优选1.2mm，外径为1.2-1.8mm，优选1.5mm，外玻璃管的内径为1.5-2.1mm，优选1.8mm，外径为1.8-2.4mm，优选2.1mm；所述内毛细管、外毛细管的材质为石英玻璃、普通玻璃或有机玻璃。

[0014] 所述软磁材料铁珠链使用的铁珠的直径小于内毛细管的内径，二者差距在0.1-0.5mm之间，优选地，软磁材料铁珠链的直径为1.0mm。

[0015] 所述软磁材料铁珠链可被环形磁场磁化，产生独特的环形高梯度磁场，避免磁珠聚团，均匀地分散在圆环通道内。

[0016] 本发明还提供了上述荧光生物传感器在微生物检测中的应用。

[0017] 所述的应用，包括以下步骤：

[0018] (1)将偶联蛋白G或蛋白A的磁珠注入圆环通道中，所述磁珠会被高梯度磁场捕获，均匀分布在圆环通道中，再注入目标物生物识别材料，生物识别材料与蛋白G或蛋白A孵育结合后，形成免疫磁珠，之后清洗除去多余抗体；

[0019] (2)向圆环通道中注入含有目标物的样本溶液，磁珠上的目标物生物识别材料捕获目标物，之后清洗除去样本背景，得到纯化和富集的磁珠-目标物复合体；

[0020] (3)向所述圆环通道中注入免疫量子点，所述磁珠-目标物复合体与免疫量子点发生免疫结合，形成磁珠-目标物-量子点复合物，之后清洗除去多余免疫量子点；

[0021] (4)将圆环通道从环形磁场发生器中取出，并将磁珠-目标物-量子点复合物从圆环通道中冲洗出来并回收，之后利用荧光检测系统进行检测，得到荧光强度值，最后利用标定曲线计算目标物的浓度。

[0022] 其中，步骤(1)的偶联蛋白G或蛋白A的磁珠溶于磷酸盐缓冲液中，用精密蠕动泵将其以1.1-1.3mL/min的高流速注入圆环通道中。本申请实施例所用的蠕动泵型号是T60-S2&WX10-14-A。

[0023] 步骤(1)中，蛋白G或蛋白A可与目标物抗体的Fc段特异性结合，形成免疫磁珠；注入超纯水冲洗除去多余的抗体。

[0024] 步骤(1)所述的目标物生物识别材料为目标物的单克隆抗体、核酸适配体、噬菌体或凝集素。本申请的实施例中，选用目标物的单克隆抗体作为目标物生物识别材料。

[0025] 步骤(2)向圆环通道中注入含有目标物的样本溶液，循环3遍。利用免疫磁珠上的所述抗体对目标物进行捕获，形成磁珠-目标物复合体；注入超纯水冲清洗除去其它微生物和杂质。

[0026] 所述步骤(3)包括以下步骤：

[0027] 1)所述免疫量子点的制备是先将链霉亲和素化的量子点和生物素化的抗体进行混合孵育，再离心除去多余抗体；

[0028] 2)将免疫量子点注入圆环通道，与磁珠-目标物复合体孵育后，形成磁珠-目标物-量子点复合物；注入超纯水冲清洗除去多余的免疫量子点。

[0029] 所述目标物识别材料和所述生物素化的抗体与目标物的结合位点不同，也即：免疫磁珠上修饰的抗体和所述免疫量子点上修饰的抗体与目标物的结合位点不同，是两个配对的抗体。

[0030] (三)有益效果

[0031] 实现了大体积样本中目标物的特异分离，具有较高的分离效率和检测灵敏度以及较简单的操作步骤，可在2小时内实现待测样品中少量微生物的定量检测。

[0032] 1、本发明提供了一种基于高梯度磁场分离的荧光生物传感器，具有较高的目标物分离效率，检测灵敏度高，方法简单易操作。

[0033] 2、本发明的高梯度磁分离装置能够使磁珠均匀分布在环形通道内，避免了免疫磁珠聚团，大幅度提高了目标物分离效率，其目标物的分离效率高于传统的磁分离器的分离效率，更重要的是可以用于大体积样本分离；

[0034] 3、利用本发明的荧光生物传感器可以提高检测速度，可在2小时内实现大体积样本中少量微生物的定量检测；

[0035] 4、利用本发明荧光生物传感器检测牛奶真实样品中的目标物，得到的回收率为95.92％～108.15％。

附图说明

[0036] 图1为本发明基于高梯度磁分离和量子点的荧光生物传感器快速检测微生物方法的流程图。

[0037] 图2a为本发明荧光生物传感器的高梯度磁分离装置中的圆环通道示意图。

[0038] 图2b为本发明荧光生物传感器移去磁铁支架的高梯度磁场分离装置纵截面图。

[0039] 图2c为本发明荧光生物传感器移去磁铁支架的高梯度磁分离装置横截面图。

[0040] 图2d为本发明中高梯度磁分离装置用COMSOL软件对磁场仿真图。

[0041] 图2e为本发明中高梯度磁分离装置样品通过通道中磁场梯度变化图。

[0042] 图2f为本发明荧光生物传感器高梯度磁分离装置实物图。

[0043] 图3为本发明中基于高梯度磁分离和量子点的荧光生物传感器的工作原理示意图。

[0044] 图4a为本发明生物传感器对磁珠用量优化结果图。

[0045] 图4b为本发明生物传感器对样品进入通道流速优化结果图。

[0046] 图4c为本发明中高梯度磁分离装置对不同浓度(102-104CFU/mL)样本溶液中大肠杆菌O157：H7的捕获结果。

[0047] 图5a为利用本发明荧光生物传感器捕获分别在不同体积(1mL、10mL)PBS中相同数量(104CFU)的大肠杆菌O157：H7的检测结果。

[0048] 图5b为本发明荧光生物传感器用于相同浓度(104CFU/mL)的大肠杆菌O157：H7(作为目标细菌)及鼠伤寒沙门氏菌和单增李斯特菌(作为干扰细菌)的检测结果。

[0049] 图6a为本发明荧光生物传感器用于不同浓度(8.9×100-8.9×105CFU/mL)的大肠杆菌O157：H7的光谱检测结果。

[0050] 图6b为本发明荧光生物传感器的校正曲线。

[0051] 图6c为本发明荧光生物传感器用于不同浓度(1.1×101-1.1×105CFU/mL)的大肠杆菌O157：H7人工添加牛奶样本的检测结果。

具体实施方式

[0052] 下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式做进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。本发明的生化试剂、软磁材料铁珠链，内/外毛细管、环形磁铁均为市售可得。

[0053] 本发明所述的蛋白G(G型链球菌分离而得的一种细胞壁蛋白)或蛋白A(从A型金黄色葡萄球菌分离而得的一种细胞壁蛋白)均为本领域公知共用的生物材料，市售可得。本发明实施例的蛋白G和蛋白A均购自上海雅心生物技术有限公司。

[0054] 实施例1 基于高梯度磁分离和量子点的荧光生物传感器的构建

[0055] 本发明的基于高梯度磁分离和量子点的荧光生物传感器，包括高梯度磁分离装置、荧光检测系统、蠕动泵、导流连接管等。

[0056] 该高梯度磁分离装置由磁铁支架、环形磁铁阵列、圆环通道和铁珠链构成；

[0057] 其中，环形磁铁阵列和磁铁支架构成环形磁场生成器，所有环形磁铁是相同的，并以圆心为中心轴相邻排列，每相邻两个磁铁是处于相互排斥状态的；

[0058] 圆环通道是由两个嵌套在一起的内毛细管和外毛细管组成，内毛细管中填充有直线排列的软磁材料铁珠链，两个毛细管同轴固定后嵌套在环形磁铁阵列的同心圆中。

[0059] 所述环形磁场生成器包括96个(可多可少，不局限于数量)环形磁铁和磁铁支架。

[0060] 所述环形磁铁的外径为5.5mm，内径为2.8mm，环形磁铁的厚度为1.0mm；所述磁铁支架长130mm，宽9.5mm，每个磁铁槽厚度为1.1mm，每两个磁铁槽间隔为0.5mm。

[0061] 其中，内毛细管的内径为1.2mm，外径为1.5mm，外毛细管的内径为1.8mm，外径为2.1mm。

[0062] 所述软磁材料铁珠链的直径为1.0mm。

[0063] 所述软磁材料铁珠链可被环形磁场磁化，产生独特的环形高梯度磁场，避免磁珠聚团，均匀地分散在圆环通道内。

[0064] 该荧光检测系统由光谱仪、光源、光纤和检测池组成。光谱仪采用Ocean Optics公司的USB4000-UV-VIS光谱仪，光源采用USB-LS-450蓝光光源，光纤采用QR400-7-UV，检测池是自制透明石英小容器。

[0065] 图1为本发明中一种基于高梯度磁分离的荧光生物传感器快速检测微生物方法的流程图，图2为本发明中提供的高梯度磁分离装置，通过COMSOL软件对磁场仿真，在圆环通道中的每个环形高梯度磁场的平均强度为0.46T，平均梯度为590T/m，能够高效地捕获磁珠，从而提高目标物捕获效率。图3为本发明中一种基于高梯度磁场分离和量子点的荧光生物传感器的工作原理示意图，方法包括以下步骤：

[0066] (1)将偶联蛋白G的磁珠被注入所述圆环通道中，所述磁珠会被所述高梯度磁场捕获，均匀分布在圆环通道中，再注入抗目标物的抗体(或其它生物识别材料)与蛋白G进行孵育结合后，形成免疫磁珠，之后清洗除去多余抗体；此步骤通过高梯度磁场使免疫磁珠均匀分散，增大了与目标物接触的面积，从而提高捕获效率；

[0067] (2)向所述圆环通道中注入含有目标物的样本溶液，所述磁珠上的所述抗体将捕获目标物，之后清洗除去样本背景，得到纯化和富集的磁珠-目标物复合体；此步骤窄小的圆环通道提高了目标物与抗体的碰撞机率，提高了免疫捕获效率，实现了目标物的富集，从而提高了检测的灵敏度；

[0068] (3)向所述圆环通道中注入免疫量子点，所述磁珠-目标物复合体将与免疫量子点发生免疫结合，形成磁珠-目标物-量子点复合物，之后清洗除去多余免疫量子点；

[0069] (4)将所述圆环通道从所述环形磁场发生器中取出，并将所述磁珠-目标物-量子点复合物从所述圆环通道中冲洗出来并回收，之后利用所述荧光检测系统进行检测，得到荧光强度值，最后利用标定曲线计算目标物的浓度。

[0070] 所述步骤(1)具体包括以下步骤：

[0071] 利用EDC方法将蛋白G和羧基磁珠进行偶联，制备所述蛋白G修饰的磁珠，并将所述蛋白G修饰的磁珠溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中，利用蠕动泵以1.2mL/min的流速注入圆环通道中；然后向圆环通道中注入目标物抗体，利用蛋白G和抗体的免疫球蛋白的Fc段特异性结合，形成免疫磁珠；

[0072] 此步骤中形成的免疫磁珠是通过蛋白G进行介导，使磁珠和抗体偶联，形成免疫磁珠。另外，由于高梯度磁场的存在，抗体的Fc段与磁珠相连，抗体的Fab段会朝向通道中心，增加了目标物与抗体结合的机率，进而提高免疫反应效率；

[0073] 注入超纯水清洗除去多余的抗体。

[0074] 进一步地，所述步骤(2)具体包括以下步骤：向圆环通道中注入含有目标物的样本溶液，循环3遍。利用免疫磁珠上的所述抗体对目标物进行捕获，形成所述磁珠-目标物复合体；注入超纯水冲清洗除去其它微生物和杂质。

[0075] 所述步骤(3)具体包括以下步骤：1)所述免疫量子点的制备是先将链霉亲和素化的量子点和生物素化的抗体进行混合孵育，再离心除去多余抗体；

[0076] 2)将免疫量子点注入圆环通道，与磁珠-目标物复合体孵育后，形成磁珠-目标物-量子点复合物；注入超纯水清洗除去多余的免疫量子点。

[0077] 所述步骤(4)具体包括以下步骤：

[0078] 移除环形磁场生成器，用磷酸盐缓冲液将磁珠-目标物-量子点复合体从圆环通道中冲出；然后将磁珠-目标物-量子点复合体溶液用所述荧光检测系统进行检测，得到荧光强度值；根据荧光强度值和目标物浓度的校正曲线，计算得到样本溶液中目标物的浓度。

[0079] 进一步地，所述免疫磁珠上修饰的抗体和所述免疫量子点上修饰的抗体是配对的，与目标物的结合位点不同，因此不影响免疫磁珠和免疫量子点与目标物的结合。上述抗体也可用核酸适配体、噬菌体、凝集素等其它生物识别元件进行代替。

[0080] 实施例2 利用本发明的荧光生物传感器定量检测大肠杆菌O157：H7[0081] 本实施例以大肠杆菌O157：H7作为目标物模型，大肠杆菌O157：H7是常见的食源性病原体，已经在牛肉、鸡肉、牛奶、蔬菜和水果等中发现，甚至可以在温度低至4℃、pH低至2.5的条件下生存。它具有很强的毒性，它的感染剂量低至10CFU/mL。大肠杆菌O157：H7感染者可能患有水样腹泻和溶血性尿毒综合征等，甚至死亡。因此，为了预防和控制大肠杆菌O157：H7引发的食源性疾病，迫切需要建立一种快速、灵敏的大肠杆菌O157：H7检测方法，下面实施例提供了解决问题的方法。

[0082] 本实施例中所用的材料主要有：

[0083] 磷酸盐缓冲液(PBS，10mM,pH 7.4)；180nm羧基磁珠；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)；羟基硫代琥珀酰亚胺(NHSS)；Luria-Bertani培养基(LB)；牛血清蛋白(BSA)；链霉亲和素化的量子点(QDs)；蛋白G(PG)等。

[0084] PG-磁珠制备：

[0085] (a)活化磁珠：加9mL PBS(0.01M，pH 7.4)于玻璃离心管后，再加入1mL磁珠(10mg/mL)，洗涤3次，然后重悬于10mL PBS中。加入2.88mg EDC和3.26mg NHSS，混合均匀，置于混匀仪上转动(15rpm)，室温活化1h。

[0086] (b)磁珠和PG偶联：利用10mL PBS洗涤上述磁珠3次后，将磁珠重悬于10mL PBS中，加入0.8mg PG(溶解于PBS，5mg/mL)，置于摇床上，保持37℃，偶联2h。

[0087] (c)封闭：加入浓度为1％的BSA溶液，室温封闭45min(15rpm)。磁捕获磁珠，利用10mL PBS洗涤3次，再利用5mL PBS重悬PG-磁珠，得到浓度为2mg/ml的PG-磁珠，置于4℃保存。

[0088] 免疫量子点的制备：

[0089] 20μL生物素化的多抗(0.4-0.5mg/ml，购自Biodesign公司，Saco,ME,US)和20μL QDs(1μM，购自Ocean Nanotech公司，San Diego，CA，US)混合，加入160μL PBS，室温孵育30min(15rpm)，得到免疫量子点，离心(速度70000rpm)除去多余的抗体，置于4℃保存。

[0090] 以下说明本发明实施例1制得的荧光生物传感器对大肠杆菌O157：H7的具体检测步骤如下：

[0091] (a)清洗圆环通道：将圆环通道置于环形磁场生成器中，然后与蠕动泵连接，先后注入超纯水、75％酒精和PBS进行清洗。

[0092] (b)形成免疫磁珠：取35μL PG磁珠(180nm，2mg/ml)，加入165μL PBS，利用蠕动泵以1.2mL/min流速注入圆环通道中，循环3次，磁珠被均匀捕获在圆环通道内；然后以0.36mL/min的流速注入5mL PBS清洗磁珠背景，再将30μL大肠杆菌O157：H7的抗体(0.73mg/mL)以0.36mL/min流速注入圆环通道中，静置孵育30min，形成免疫磁珠，并利用5mL PBS清洗除去多余的抗体。

[0093] (c)捕获目标细菌：以0.36mL/min的流速注入1mL不同浓度(101-105CFU/mL)的大肠杆菌O157：H7，循环3次，目标细菌将被捕获在圆环通道内，并利用5mL PBS清洗除去样本背景。

[0094] 图4a和图4b为本发明对磁珠用量、样品进入通道流速参数优化的结果，在优化后选择最佳条件下，4c为本发明高梯度磁分离装置对不同浓度(102-104CFU/mL)样本溶液中大肠杆菌O157：H7的捕获结果，可以看出：利用本发明的高梯度磁分离装置能够高效捕获大肠杆菌O157：H7。

[0095] (d)结合量子点：以0.12mL/min的流速注入200μL免疫量子点，静置孵育30min，并利用5mL PBS清洗除去多余的免疫量子点。

[0096] (e)荧光检测：移除环形磁场生成器，以0.60mL/min的流速注入100μL PBS(10mM)将磁珠-细菌-量子点复合体冲出圆环通道，并回收于石英小容器中进行荧光强度检测，通过荧光强度值与大肠杆菌O157：H7浓度的校正曲线，计算大肠杆菌O157：H7的浓度。

[0097] 图5a为本发明方法利用本发明荧光生物传感器捕获分别在不同体积(1mL、10mL)PBS中相同数量(104CFU)的大肠杆菌O157：H7的检测结果；图5b为本发明方法用于相同浓度(104CFU/mL)的大肠杆菌O157：H7(作为目标细菌)及鼠伤寒沙门氏菌和单增李斯特菌(作为干扰细菌)的检测结果，可以看出：利用本发明的荧光生物传感器，能够有效捕获大肠杆菌O157：H7，但对鼠伤寒沙门氏菌和单增李斯特菌仅有微弱的非特异性结合。

[0098] 图6a本发明荧光生物传感器用于不同浓度(8.9-8.9×105CFU/mL)的大肠杆菌O157：H7的光谱检测结果；图6b为本发明荧光生物传感器的校正曲线；图6c为本发明荧光生1 5
物传感器用于不同浓度(1.1×10-1.1×10CFU/mL)的大肠杆菌O157∶H7人工添加牛奶样本的检测结果，可以看出：在圆环通道内，免疫磁珠、大肠杆菌O157∶H7和免疫量子点可以结合为磁珠-细菌-量子点复合体，当大肠杆菌O157：H7浓度增加时，荧光强度值也相应增加，且呈现较好的线性关系。

[0099] 以上实施方式仅用于说明本发明，而非对本发明的限制。尽管参照实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，对本发明的技术方案进行各种组合、修改或者等同替换，都不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。