一种植入式传感器表面抗污涂层的制备及应用

摘要

本发明公开了一种植入式传感器表面抗污涂层的制备及应用，属于生物医学领域。本发明的抗污涂层材料为含铁蛋白纳米载药颗粒与PVA的水凝胶涂层材料，其制备包括如下步骤：铁蛋白溶解于尿素溶液中使其解折叠，将药物加入铁蛋白‑尿素混合液中，用梯度浓度的尿素缓冲液进行透析使铁蛋白重新折叠，得到铁蛋白纳米载药颗粒；将铁蛋白纳米载药颗粒加到PVA溶液中，充分混合，利用浸润涂覆、循环冷冻‑解冻的方法，在传感器表面得到铁蛋白纳米载药颗粒‑PVA水凝胶涂层。将本发明的涂层材料对植入式传感器进行改性，能够提高其生物相容性，抑制炎症细胞的粘附、抑制传感器表面的纤维囊包裹，提高传感器在体内的长期传感性能和使用寿命。

权利要求

1.一种植入式传感器表面抗污涂层材料，其特征在于：为含铁蛋白纳米载药颗粒与PVA的水凝胶涂层材料，其制备包括如下步骤：(1)铁蛋白溶解于尿素溶液中使其解折叠，将药物加入铁蛋白-尿素混合液中，用梯度浓度的尿素缓冲液进行透析使铁蛋白重新折叠，得到铁蛋白纳米载药颗粒；

(2)将铁蛋白纳米载药颗粒加到PVA溶液中，充分混合，利用浸润涂覆、循环冷冻-解冻的方法，在传感器表面得到铁蛋白纳米载药颗粒-PVA水凝胶涂层。

2.根据权利要求1所述的植入式传感器表面抗污涂层材料，其特征在于：所述传感器包括葡萄糖传感器。

3.根据权利要求1所述的植入式传感器表面抗污涂层材料，其特征在于：所述铁蛋白纳米载药颗粒所载药物为地塞米松。

4.权利要求1-3任一项所述的植入式传感器表面抗污涂层材料的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)铁蛋白溶解于尿素溶液中使其解折叠，将药物加入铁蛋白-尿素混合液中，用梯度浓度的尿素缓冲液进行透析使铁蛋白重新折叠，得到铁蛋白纳米载药颗粒；

(2)将铁蛋白纳米载药颗粒加到PVA溶液中，充分混合，利用浸润涂覆、循环冷冻-解冻的方法，在传感器表面得到铁蛋白纳米载药颗粒-PVA水凝胶涂层。

5.根据权利要求4所述的植入式传感器表面抗污涂层材料的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，用于使铁蛋白解折叠的尿素溶液的浓度为8M的尿素水溶液；用于透析的梯度浓度的尿素缓冲液分别为7M、5M、3M、2M、1M的尿素水溶液和0M的水溶液。

6.根据权利要求4所述的植入式传感器表面抗污涂层材料的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，铁蛋白纳米载药颗粒与PVA的混合溶液中PVA的终浓度为2.5-4％。

7.权利要求1-3任一项所述的植入式传感器表面抗污涂层材料在植入式传感器改性中的应用。

说明书

一种植入式传感器表面抗污涂层的制备及应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种植入式传感器表面抗污涂层的制备及应用。

背景技术

[0002] 糖尿病是目前世界范围内危害人类健康的第三大疾病，动态血糖监测系统(CGMS)能实时监测糖尿病人的血糖变化，可以提供连续、全面、可靠的全天血糖信息，了解血糖波动的趋势，协助患者进行即时的血糖调节，调整治疗方案，在临床中具有广阔的应用空间。

[0003] 然而，由于CGMS中的皮下植入部分(即植入式葡萄糖传感器)的生物相容性不佳，导致传感器在皮下植入后产生异物反应(foreign body response,FBR)，包括炎症反应、蛋白吸附、细胞粘附、凝血反应、形成纤维囊包裹传感器的电极等。传感器周围的生物污染(biofouling)导致电荷在电极和生物组织间的传递受到阻止，使电极的传感性能和使用精度下降，传感器的寿命减小或功能丧失。例如，德康G4Platinum代表目前CGMS业界最高水平，但其植入式传感器最多只能佩戴7天，之后必须更换新的传感器。

[0004] 因此，提高植入式葡糖糖传感器表面的生物相容性，减少传感器/生物组织界面反应，对于提高传感器的使用寿命，实现长期动态血糖监测至关重要。

[0005] 本发明利用铁蛋白制备包载地塞米松的纳米载药颗粒，并将该纳米颗粒与聚乙二醇的复合材料涂覆在葡萄糖传感器表面。通过铁蛋白纳米药物的控释和缓释，该涂层具有减少传感器表面的异物反应、提高传感器生物相容性和长期传感性能的作用。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点与不足，提供一种植入式传感器表面抗污涂层材料的制备方法，以及所述材料在植入式传感器的改性中的应用，通过本发明能够提高植入式传感器的长期生物相容性、长期传感性能和使用寿命。该涂层除了应用在植入式葡萄糖传感器表面之外，也可以推广到其他植入材料表面的生物抗污涂层的应用。

[0007] 本发明的目的通过下述技术方案实现：

[0008] 一种植入式传感器表面抗污涂层材料，为含铁蛋白纳米载药颗粒与PVA的水凝胶涂层材料，其中铁蛋白纳米载药颗粒所载药物优选为地塞米松。所述传感器包括葡萄糖传感器。

[0009] 一种植入式传感器表面抗污涂层材料的制备方法，包括如下步骤：

[0010] (1)铁蛋白溶解于尿素溶液中使其解折叠，将药物加入铁蛋白-尿素混合液中，用梯度浓度的尿素缓冲液进行透析使铁蛋白重新折叠，得到铁蛋白纳米载药颗粒。所述的药物优选为地塞米松。

[0011] (2)将铁蛋白纳米载药颗粒加到PVA溶液中，充分混合，利用浸润涂覆、循环冷冻-解冻的方法，在传感器表面得到铁蛋白纳米载药颗粒-PVA水凝胶涂层。

[0012] 优选的，步骤(1)中，用于使铁蛋白解折叠的尿素溶液的浓度为8M的尿素水溶液；用于透析的梯度浓度的尿素缓冲液分别为7M、5M、3M、2M、1M的尿素水溶液和0M的水溶液。步骤(2)中，铁蛋白纳米载药颗粒与PVA的混合溶液中PVA的终浓度为2.5-4％(优选为3％)。

[0013] 上述涂层材料可用于对植入式传感器进行改性，通过形成的生物抗污涂层以提高植入式传感器的生物相容性、传感性能和使用寿命，其应用示意图如图1所示。

[0014] 一种植入式传感器表面的生物抗污改性方法，包括如下步骤：利用浸润、涂覆将含铁蛋白纳米载药颗粒的PVA溶液涂覆在传感器表面，再通过循环冷冻-解冻，在传感器表面形成一层水凝胶涂层。重复上述步骤多次可形成多层水凝胶涂层。

[0015] 本发明具有如下优点和有益效果：采用纳米载药技术与生物相容性涂层相结合，提高了植入式传感器的生物相容性，延长了传感器的使用寿命。利用简单、温和的水相反应制备铁蛋白纳米载药颗粒，反应简单、高效；利用循环冷冻复融的方法交联水凝胶，反应简单、无毒。利用铁蛋白纳米颗粒在酸性微环境中(模拟炎症环境)释放药物，抑制炎症细胞的粘附，提高了长期传感性能，解决了植入式传感器植入后的长期传感性能下降的问题。

附图说明

[0016] 图1是聚乙烯醇(PVA)-铁蛋白纳米载药颗粒复合涂层材料用于生物抗污涂层的示意图。

[0017] 图2是铁蛋白纳米载药颗粒的制备示意图；a：制备过程示意图；b-d：制备过程中TEM图，b：原始铁蛋白纳米笼，c：经尿素作用后的变性铁蛋白，d：蛋白复性形成铁蛋白纳米载药颗粒。

[0018] 图3是三维表面轮廓仪测试在传感器表面涂覆不同层数涂层的厚度数据图。

[0019] 图4是不同类型的涂层涂覆在传感器表面的SEM表征图；a：传感器表面，b：传感器表面涂覆PVA水凝胶涂层，c：传感器表面涂覆PVA-铁蛋白纳米载药颗粒(Ft-Dex NPs)复合水凝胶涂层。

[0020] 图5是不同类型的涂层涂覆在传感器表面的AFM表征图；a：传感器表面，b：传感器表面涂覆PVA水凝胶涂层，c：传感器表面涂覆PVA-铁蛋白纳米载药颗粒(Ft-Dex NPs)复合水凝胶涂层。

[0021] 图6是不同层数的PVA+Ft-Dex NPs复合涂层对葡萄糖传感器的体外传感性能的影响结果图。

[0022] 图7是铁蛋白纳米载药颗粒在不同pH溶液中的药物释放情况图；a-c：铁蛋白纳米载药颗粒在不同pH溶液中37℃培养6小时后的TEM图，d：在不同pH溶液中PVA-铁蛋白纳米载药颗粒复合涂层的药物释放曲线图。

[0023] 图8是植入大鼠体内14天后从皮肤取出的传感器的形貌图。

[0024] 图9是植入大鼠体内14天后取出样本的H&E组织染色图。

[0025] 图10是植入大鼠体内14天后取出样本的Masson染色图。

[0026] 图11是植入大鼠体内14天后取出样本的CD68染色图。

[0027] 图12是植入大鼠体内14天传感器在大鼠体内的血糖监测结果图。

具体实施方式

[0028] 以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

[0029] 下述实施例采用雅培公司FreeStyle Libre型号的传感器作为研究对象，在传感器表面进行不同涂层的涂覆，并进行体外和体内的血糖监测实验。

[0030] 实施例1铁蛋白纳米载药颗粒的制备

[0031] 本实施例中，利用铁蛋白的变性-复性过程，将地塞米松(简称为Dex)药物分子包载在铁蛋白纳米笼中，形成铁蛋白纳米载药颗粒(标记为Ft-Dex NPs)，其制备过程见图2a。

[0032] 将终浓度为1mg/mL的铁蛋白溶解在10mL 8M尿素中，并在室温25℃下搅拌混合30分钟，以确保铁蛋白完全解折叠。将地塞米松(简称为Dex)加入其中，药物的终浓度为0.2mg/mL，混合15分钟后，将混合物转移到分子截留量为3000的透析袋中，在4℃冰箱进行透析。透析液为含0.2mg/mL药物的梯度浓度的尿素缓冲液(7M、5M、3M、2M、1M和去离子水)，每个梯度浓度透析4-6小时，经过透析，重新组装成含有药物分子的铁蛋白纳米笼。然后，在生理盐水中过夜透析。之后，取铁蛋白纳米载药颗粒在4℃进行离心，5000rpm离心15min；去上清液，并加生理盐水重新悬浮(清洗)；最后采用超滤离心管进行超滤离心(MWCO 3000)，浓缩纳米颗粒溶液至0.1mL。铁蛋白纳米载药颗粒的制备过程中的TEM表征见图2b-d。TEM结果证明在尿素的作用，铁蛋白解折叠；经过透析之后，恢复形成铁蛋白纳米颗粒(标记为Ft-Dex NPs)。得到的0.1mL铁蛋白纳米载药颗粒的浓缩溶液中，用蛋白测试法测得铁蛋白的浓度为80mg/mL，用HPLC方法测得Dex药物的浓度为4.4mg/mL。

[0033] 实施例2铁蛋白纳米载药颗粒与PVA水凝胶复合材料涂层制备

[0034] 将实施例1制备的铁蛋白纳米载药颗粒溶液0.1mL加入到1mL质量百分比为3.33％PVA溶液中(PVA终浓度为3％(质量百分比))，混合溶液中Dex药物终浓度为0.4mg/mL，充分混合后，利用浸润、涂覆将PVA与铁蛋白纳米载药颗粒的混合溶液涂覆在传感器表面。将传感器放入-20℃冰箱冷冻1h，常温25℃解冻0.5h，如此循环5次，在传感器的表面形成PVA与铁蛋白纳米载药颗粒的复合水凝胶涂层(标记为PVA+Ft-Dex NPs)。

[0035] 如果需要制备两层的复合水凝胶涂层，在经历一次PVA冷冻解冻循环后，再次涂覆PVA与铁蛋白纳米载药颗粒的溶液，并再经历5次冷冻解冻循环。

[0036] 如过需要制备三层复合水凝胶涂层，在经历前两次PVA冷冻解冻循环后，第三次涂覆PVA与铁蛋白纳米载药颗粒的溶液，并再经历5次冷冻解冻循环。

[0037] 如需制备多层复合水凝胶涂层，如此类推。

[0038] 不加药物的PVA水凝胶涂层(标记为PVA)的制备同上，利用浸润、涂覆将3％(质量百分比)PVA溶液涂覆在传感器表面，再经过冷冻解冻循环后在传感器的表面形成PVA水凝胶涂层。

[0039] 包含游离Dex药物分子的PVA水凝胶涂层(标记为PVA+游离Dex)的制备同上，利用浸润、涂覆将含终浓度为0.4mg/mL的Dex药物的3％(质量百分比)PVA溶液涂覆在传感器表面，再经过冷冻解冻循环后在传感器的表面形成包含游离Dex的PVA水凝胶涂层。

[0040] 实施例3涂层的理化性能评价

[0041] 利用三维表面轮廓仪(德国NanoFocus)表征不同层数的PVA+Ft-DeX NPs复合涂层或不加药物的PVA水凝胶涂层(标记为PVA)的厚度，结果见图3。随着涂层层数的增加，涂层的厚度增加；PVA涂层与PVA+Ft-DeX NPs复合涂层的厚度无显著差异。

[0042] 利用扫描电子显微镜(德国Zeiss Sigma)观察涂层为6层的PVA+Ft-DeX NPs复合涂层或PVA涂层在传感器上的涂覆情况，结果见图4，表明不同类型的涂层均能涂覆在传感器的表面。

[0043] 利用原子力显微镜(德国JPK NanoWizard4)观察PVA+Ft-DeX NPs复合涂层或PVA涂层的表面形貌，结果见图5。传感器表面光滑，粗糙度小；涂覆PVA涂层之后表面粗糙度增大至8.68nm；涂覆PVA+Ft-DeX NPs复合涂层之后的表面粗糙度更大，增大到19.85nm。

[0044] 实施例4涂层的体外传感性能

[0045] 在传感器表面涂覆不同层数(0层、3层、6层、9层)的PVA+Ft-Dex NPs复合涂层。在体外配制不同浓度的葡萄糖水溶液(0mM、3mM、6mM、9mM、12mM)。将涂覆有不同层数的复合涂层(0层、3层、6层、9层)的传感器依次放入葡萄糖水溶液中，并用雅培公司FreeStyle Libre传感器配套的扫描仪进行数据读数和记录，评价葡萄糖传感器的体外传感性能，结果见图6。相对于没有添加涂层的传感器(0层)，当传感器表面的涂层为3层或6层时，传感器能正常工作；当涂层为9层时，传感器的传感性能降低。因此后续选择6层PVA+Ft-Dex NPs复合涂层来改性传感器表面、并作为体内实验的样品。

[0046] 实施例5药物释放曲线

[0047] 在不同pH溶液中(醋酸盐缓冲液(0.1M，pH 5.0)，磷酸钠缓冲液(0.1M，pH 6.5)，PBS缓冲液(0.1M，pH 7.4))浸泡铁蛋白纳米载药颗粒(Ft-Dex NPs)，在37℃培养6h。利用透色电子显微镜(美国FEI Tecnai G2 20S-TWIN)观察纳米颗粒的形貌变化，结果见图7a-c。Ft-Dex NPs在中性pH 7.4条件下，纳米颗粒结构相对稳定；在弱酸性pH 6.5条件下(模拟慢性炎症环境)，纳米颗粒结构被破坏；在酸性pH 5.0条件下(模拟急性炎症环境)，纳米颗粒结构进一步解折叠，几乎看不到纳米笼的轮廓。

[0048] 在不同pH溶液中(pH 5.0，pH 6.5，pH 7.4，溶液同上)，浸泡涂层为6层的PVA+Ft-Dex NPs复合涂层。在不同时间点，取上清液，用HPLC测量释放在上清液中的地塞米松Dex的药物含量，表征不同时间下PVA+Ft-Dex NPs复合涂层的药物释放曲线，结果见图7d。复合涂层在中性pH 7.4条件下，由于纳米颗粒结构相对稳定，释放的药物量较少，60小时后释药量仅为原始载药量的10％；在弱酸性pH 6.5条件下(模拟慢性炎症环境)，由于纳米颗粒结构被破坏，释药率增加，60小时后的释药量为55％；在酸性pH 5.0条件下(模拟急性炎症环境)，由于纳米颗粒结构解折叠，释药率进一步增加，60小时后的释药量达到85％。

[0049] 实施例6涂层的体内相容性评价

[0050] 表面改性后的传感器有：传感器表面涂覆6层PVA涂层(传感器+PVA)，传感器表面涂覆6层包含游离Dex药物分子的PVA涂层(传感器+PVA+游离Dex)，传感器表面涂覆6层PVA+Ft-Dex NPs复合涂层(传感器+PVA+Ft-Dex NPs)。将改性前和改性后的传感器植入大鼠皮肤下，并在植入后1和2周取出植入物，利用组织切片、免疫组化(H&E染色、Masson染色)、免疫荧光(CD68染色)分析评价传感器与植入组织之间的反应,这里仅展现植入14天的结果。

[0051] 植入大鼠皮肤14天后，取出带传感器的皮肤组织，结果见图8。植入14天后，对照传感器表面被纤维囊包裹；传感器+PVA表面的纤维囊包裹程度加剧；传感器+PVA+游离Dex和传感器+PVA+Ft-Dex NPs表面的纤维囊减少，而且传感器+PVA+Ft-Dex NPs表面光滑，纤维囊最少。

[0052] 将取出的皮肤进行H&E染色，结果见图9。从H&E染色的结果也可以看出，植入14天后，对照传感器表面被纤维囊包裹；传感器+PVA的表面纤维囊包裹程度加剧；传感器+PVA+游离Dex和传感器+PVA+Ft-Dex NPs的表面纤维囊减少，而且传感器+PVA+Ft-Dex NPs的表面光滑，纤维囊最少。

[0053] 将取出的皮肤进行Masson染色，表征传感器表面的胶原密度，结果见图10。从Masson染色结果看出，植入14天后，对照传感器表面被胶原纤维包裹；传感器+PVA表面的胶原纤维密度加大；传感器+PVA+游离Dex和传感器+PVA+Ft-Dex NPs表面的胶原纤维减少，而且传感器+PVA+Ft-Dex NPs表面的胶原纤维密度最低。

[0054] 将取出的皮肤进行CD68染色，CD68+表征传感器表面的炎症反应，结果见图11。从CD68染色结果看出，植入14天后，对照传感器表面有一定炎症反应；传感器+PVA表面的炎症因子表达加剧；传感器+PVA+游离Dex和传感器+PVA+Ft-Dex NPs的表面炎症因子表达降低。

[0055] 上述结果的具体数据见表1。

[0056] 表1.植入老鼠体内14天后，传感器材料周围皮肤组织的免疫组化分析[0057]

[0058] 实施例7涂层的体内传感性能评价

[0059] 以未修饰的雅培公司FreeStyle Libre传感器作为对照，以表面涂覆6层PVA+Ft-Dex NPs复合涂层的传感器作为实验组，将表面改性之前和表面改性之后的传感器植入大鼠体内，并在植入后2周内，记录传感器检测的体内信号。以植入时(第0天)传感器记录的数据值为参考标准(100％)，植入后不同天数的读数与第0天的数据相比较，并转换为相对百分比，结果见图12。随着植入天数的增加，未修饰的传感器的传感性能逐渐下降，植入第8天时传感器灵敏度下降到植入时的50％；而表面修饰后的传感器在2周内能较好地保持传感性能，在植入后14天传感器的灵敏度维持在植入时的80％左右。

[0060] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。