一种基于氨基唾液酸糖的CD169亲和荧光探针TCC-FITC及其制备方法

摘要

本发明公开了一种基于氨基唾液酸糖的CD169亲和荧光探针TCC‑FITC及其制备方法，其结构式如下：本发明的基于氨基唾液酸糖的CD169亲和荧光探针TCC‑FITC针对CD169靶点具有高亲和力，能够良好的在体内和体外定位含有CD169+巨噬细胞的肿瘤组织。

权利要求

1.一种基于氨基唾液酸糖的CD169亲和荧光探针TCC-FITC，其特征在于：其结构式如下：

2.权利要求1所述的一种基于氨基唾液酸糖的CD169亲和荧光探针TCC-FITC的制备方法，其特征在于：其反应式如下：

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)将TCC-COOH、EDC·HCl、HOBT、三乙胺、N-叔丁氧羰基乙二胺与DMF混合均匀后避光搅拌45～50h，蒸发除去溶剂后通过CH2Cl2∶MeOH＝20∶1柱层析纯化，得到第一化合物，为浅黄色固体；

(2)将第一化合物、三氟乙酸与二氯甲烷混合均匀于常温常压下反应，通过TLC监测至反应完全后蒸发除去溶剂，再与K2CO3与DMF混合均匀；

(3)将FITC与DMF混合均匀并逐滴加入步骤(2)所得的物料中，避光搅拌10～14h，蒸发除去溶剂后通过CH2Cl2∶MeOH＝5∶1柱层析纯化，得到所述基于氨基唾液酸糖的CD169亲和荧光探针TCC-FITC，为黄色固体。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，TCC-COOH、EDC·HCl、HOBT、三乙胺、N-叔丁氧羰基乙二胺和DMF的比例为8.3～8.7mmol∶10～11mmol∶10～11mmol∶25～26mmol∶8.3～8.7mmol∶140～160mL。

5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，TCC-COOH、EDC·HCl、HOBT、三乙胺、N-叔丁氧羰基乙二胺和DMF的比例为8.6mmol∶10.3mmol∶10.3mmol∶25.8mmol∶8.6mmol∶150mL。

6.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中：第一化合物、三氟乙酸、二氯甲烷、K2CO3和DMF的比例为5.3～5.5mmol∶45～55mL：45～55mL∶20～22mmol∶90～

110mL。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中：第一化合物、三氟乙酸、二氯甲烷、K2CO3和DMF的比例为5.35mmol∶50mL∶50mL∶21.7mmol∶100mL。

8.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于：FTIC与第一化合物的摩尔比为0.8～1.2∶0.8～1.2。

9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于：FTIC与第一化合物的摩尔比为1∶1。

说明书

一种基于氨基唾液酸糖的CD169亲和荧光探针TCC-FITC及其

制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于氨基唾液酸糖的CD169亲和荧光探针TCC-FITC及其制备方法。

背景技术

[0002] CD169是在巨噬细胞表面发现的细胞粘附分子。在脾，肝，淋巴结，骨髓，结肠和肺的巨噬细胞中发现量特别高。它被定义为I型凝集素，因为它含有17免疫球蛋白(Ig)结构域(一个可变结构域和16个恒定结构域)，并且因此也属于免疫球蛋白超家族(IgSF)结构。CD169可与唾液酸类的分子结合，又称为Siglec-1或唾液酸黏附素。CD169+巨噬细胞通过CD169受体与其它细胞表面的配体识别并结合，完成细胞间的信息交流，在抗原呈递、调节淋巴细胞增殖、诱导炎症反应和免疫耐受中发挥重要作用。在疾病状态下，如肿瘤疾病及自身免疫性疾病中，可在病变组织、淋巴结及外周血中检测到其数量的明显变化。CD169+巨噬细胞不同于大家所熟知的M1及M2型巨噬细胞。相对于M1和M2的吞噬功能，该细胞可通过CD169与T细胞、B细胞、树突状细胞直接作用，参与免疫调控，并且可通过该受体与病毒表面的唾液酸结合而发挥抗病毒作用。

[0003] CD169+巨噬细胞在免疫调控中发挥着重要作用。有研究发现，CD169+巨噬细胞参与炎性反应。其可能的机制是，CD169+巨噬细胞通过分泌TNF-α，启动炎症的级联反应。CD169+巨噬细胞还可分泌CCL8趋化因子，招募炎性单核细胞的聚集，促进相关炎症发生。在受损组织中，CD169+巨噬细胞也会增多，其通过与调节性T细胞(Treg)表面的唾液酸残基识别并结合，抑制调节性T细胞的增殖，对调节性T细胞起到负调控作用，而使得效应T细胞增多，加剧受损部位的炎性反应。CD169+巨噬细胞也可参与凋亡细胞诱导的免疫耐受。凋亡细胞是自身抗原的重要来源，其正常清除可诱导免疫耐受，而异常积累可导致自身抗体的产生，造成自身免疫性疾病的发生。脾脏中的CD169+巨噬细胞可捕获血液来源的凋亡细胞并分泌CCL22趋化因子，招募调节性T细胞聚集，诱导免疫耐受。很多研究都表明，CD169+巨噬细胞在自身免疫疾病中的促炎及抑炎作用中发挥着重要作用，虽然具体机制尚未明晰。

[0004] 肿瘤组织作为一种特殊的炎症性病变部位，其中有近一半重量的细胞是巨噬细胞，但是在肿瘤微环境中，巨噬细胞并没有起到积极的清除肿瘤细胞的功能，反而更多时候在充当肿瘤的帮凶，通过分泌各种抑制因子来为肿瘤细胞的生长保驾护航。其中CD169+巨噬细胞作为其中一类很重要的细胞，在肿瘤的发生和发展中也发挥着重要作用。

[0005] 但是目前对CD169+巨噬细胞的相关作用机制并不清楚，为了更好的研究CD169+巨噬细胞的作用，对其发挥功能的过程进行可视化研究，因此研发巨噬细胞荧光探针具有重要意义

发明内容

[0006] 本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种基于氨基唾液酸糖的CD169亲和荧光探针TCC-FITC。

[0007] 本发明的另一目的在于提供上述基于氨基唾液酸糖的CD169亲和荧光探针TCC-FITC的制备方法。

[0008] 本发明的技术方案如下：

[0009] 一种基于氨基唾液酸糖的CD169亲和荧光探针TCC-FITC，其结构式如下：

[0010]

[0011] 上述基于氨基唾液酸糖的CD169亲和荧光探针TCC-FITC的制备方法，其反应式如下：

[0012]

[0013] 在本发明的一个优选实施方案中，包括如下步骤：

[0014] (1)将TCC-COOH、EDC·HCl、HOBT、三乙胺、N-叔丁氧羰基乙二胺与DMF混合均匀后避光搅拌45～50h，蒸发除去溶剂后通过CH2Cl2∶∶MeOH＝20∶1柱层析纯化，得到第一化合物，为浅黄色固体；

[0015] (2)将第一化合物、三氟乙酸与二氯甲烷混合均匀于常温常压下反应，通过TLC监测至反应完全后蒸发除去溶剂，再与K2CO3与DMF混合均匀；

[0016] (3)将FITC与DMF混合均匀并逐滴加入步骤(1)所得的物料中，避光搅拌10～14，蒸发除去溶剂后通过CH2Cl2∶∶MeOH＝5∶1柱层析纯化，得到所述基于氨基唾液酸糖的CD169亲和荧光探针TCC-FITC，为黄色固体。

[0017] 进一步优选内的，所述步骤(1)中，TCC-COOH、EDC·HCl、HOBT、三乙胺、N-叔丁氧羰基乙二胺和DMF的比例为8.3～8.7mmol∶10～11mmol∶10～11mmol∶25～26mmol∶8.3～8.7mmol∶140～160mL。更进一步优选的，所述步骤(1)中，TCC-COOH、EDC·HCl、HOBT、三乙胺、N-叔丁氧羰基乙二胺和DMF的比例为8.6mmol∶10.3mmol∶10.3mmol∶25.8mmol∶8.6mmol∶
150mL。

[0018] 进一步优选内的，所述步骤(2)中：第一化合物、三氟乙酸、二氯甲烷、K2CO3和DMF的比例为5.3～5.5mmol∶45～55mL∶45～55mL∶20～22mmol∶90～110mL。更进一步优选的，所述步骤(2)中：第一化合物、三氟乙酸、二氯甲烷、K2CO3和DMF的比例为5.35mmol∶50mL∶50mL∶21.7mmol∶100mL。

[0019] 进一步优选内的，所述步骤(3)中：FTIC与第一化合物的摩尔比为0.8～1.2∶0.8～1.2。更进一步优选的，所述步骤(3)中：FTIC与第一化合物的摩尔比为1∶1。

[0020] 本发明的有益效果是：

[0021] 本发明的基于氨基唾液酸糖的CD169亲和荧光探针TCC-FITC针对CD169靶点具有高亲和力，能够良好的在体内和体外定位含有CD169+巨噬细胞的肿瘤组织。

附图说明

[0022] 图1为本发明实施例1中的TCC-FITC的细胞毒性结果图。

[0023] 图2为本发明实施例1中的TCC-FITC体外标记巨噬细胞照片。

[0024] 图3为本发明实施例1中的TCC-FITC体内标记巨噬细胞照片，其中，1-肝脏；2-肿瘤；3-肺脏；4-心脏；5-肾脏；6-脑；7-脾脏。

具体实施方式

[0025] 以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。

[0026] 实施例1

[0027] 1、荧光探针TCC-FITC的合成

[0028] N-boc-ethylenediamine-TCC(1)：将TCC-COOH(1.7g，8.6mmol)、EDC·HCl(2.0g，10.3mmol)、HOBT(1.4g，10.3mmol)、三乙胺(3.6mL，25.8mmol)、N-叔丁氧羰基乙二胺(1.38g，8.6mmol)与DMF(150mL)混合均匀。避光搅拌48h。蒸发除去溶剂后通过CH2Cl2∶∶MeOH＝20∶1柱层析纯化，得到第一化合物，为浅黄色固体(2.54g，7.48mmol，87％)。

[0029] FITC-ethylenediamine-TCC(2)：将第一化合物(1.8g，5.35mmol)、三氟乙酸(50mL)与二氯甲烷(50mL)混合均匀；通过TLC监测至反应完全时(≈1h)。蒸发除去溶剂，将残余物、K2CO3(3.0g，21.7mmol)与DMF(100mL)混合均匀；将FITC(2.0g，5.35mmol)与DMF(10mL)混合均匀并逐滴加入上述混合物。将混合物避光搅拌12h。蒸发除去溶剂后通过CH2Cl2∶∶MeOH＝5∶1柱层析纯化，得到所述基于氨基唾液酸糖的CD169亲和荧光探针TCC-FITC，为黄色固体(2.42g，3.85mmol，72％)。

[0030] 上述反应路线如下：

[0031]

[0032] 2、TCC-FITC的细胞毒性

[0033] 将小鼠单核巨噬细胞(Raw264.7)在含有5％二氧化碳的37℃无菌恒温培养箱中培养，所用培养基为含有10％胎牛血清的DMEM。将细胞传代48孔板上，待细胞贴壁后将原有培养基移除，加入含不同浓度TCC-FITC的DMEM培养基，继续培养24小时。然后用台盼蓝拒染法计数活细胞。结果如图1所示，可以看出TCC-FITC对小鼠单核巨噬细胞(Raw264.7)基本无毒性，因此将其用于荧光标记巨噬细胞具有可行性。

[0034] 3、TCC-FITC的体外标记巨噬细胞效果

[0035] 将Raw264.7细胞传代到共聚焦专用细胞培养皿上，在含10％FBS的DMEM培养基中培养至50％密度。将原有培养基移除，加入含100微摩尔TCC-FITC的DMEM培养基，分别培养1，4，24小时。将原有培养基移除，加入1毫升PBS润洗三次，加入10微摩尔的Di1，继续培养10分钟。最后用新鲜培养基替换后置于共聚焦下观察，对TCC-FITC和Di1的细胞定位进行分析。结果如图2所示，Di1可以有效的对细胞膜进行标记，Di1是一类亲脂性的荧光染料，在未结合细胞膜之前荧光非常弱，在结合细胞膜之后其荧光大大增强，并且可在细胞膜上有效扩散，是整个细胞染色，清晰的对细胞膜轮廓进行标记。TCC-FITC针对CD169+巨噬细胞上的CD169受体，可通过受体-配体间的高亲和力相互作用对CD169阳性细胞进行特异性标记。从图中可以明显的看出，随着标记时间的延长，细胞膜上的荧光亮点逐渐增多，而且分布在细胞膜上。因此TCC-FITC可以有效的对巨噬细胞膜进行荧光标记，这对于定位CD169+巨噬细胞及对其功能进行可视化研究具有重要意义。

[0036] 4、TCC-FITC的体内标记巨噬细胞效果

[0037] 将B16F10细胞正常培养在10厘米细胞培养皿中，培养至80％密度。用2毫升胰酶消化90秒，加入2毫升培养基终止消化并吹打成单细胞悬液，1000rpm离心3分钟，用PBS重复润洗离心一次，去除残留的培养基，加入PBS重悬，计数。将100万个制备好的细胞注入B6品系小鼠(C57BL/6)皮下，进行肿瘤种植。待肿瘤体积长到约200mm3左右之后通过尾静脉注射100微升浓度为50mg/kg的TCC-FITC的PBS溶液，空白对照尾静脉注射100微升PBS溶液。然后在注射后1小时、4小时和24小时后牺牲小鼠，取出各脏器切片后进行荧光拍照。

[0038] 从图3可以看出，尾静脉注射TCC-FITC之后可以快速的对CD169+巨噬细胞进行荧光标记，在各器官中均有不同程度的分布，尤其在肿瘤组织中荧光较亮，而且在脾脏中可有较强的荧光。这显示肿瘤组织中的确存在大量CD169+巨噬细胞。由于脾脏是次级淋巴器官，其中也含有大量的巨噬细胞，所以也可见较强的荧光。随着时间的延长，各器官中荧光均逐渐减弱，这显示荧光探针会经过代谢途径分解或排出。但是在肿瘤组织中仍存在较强的荧光，这显示TCC-FITC可稳定标记肿瘤组织中的CD169+巨噬细胞，这对于肿瘤组织的定位和研究CD169+巨噬细胞在肿瘤组织中的功能非常重要。

[0039] 以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。