一种医用氧化石墨烯抗菌剂的制备方法

摘要

本发明公开了一种医用氧化石墨烯抗菌剂的制备方法，包括：取羧基乙基硅烷三醇钠盐水溶液加入2‑吗啉乙磺酸缓冲溶液中；向溶液中加入1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺和1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺；将四肽加入到上述溶液中，进行反应；将卡纳霉素溶解于2‑吗啉乙磺酸缓冲溶液，然后加入反应液，继续反应；制备氧化石墨烯分散液，与反应液混合，在50‑80℃条件下反应后，进行透析7‑10天和冷冻干燥，得到医用氧化石墨烯抗菌剂。本发明制备方法简单易行，反应条件温和，绿色环保以及高效，所制备的医用氧化石墨烯抗菌剂，不仅具有良好的生物相容性，而且对大肠杆菌抑菌率可以达到100％，抑菌效果显著，在使用时不会释放卡那霉素，有效避免了抗生素滥。

权利要求

1.一种医用氧化石墨烯抗菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）取羧基乙基硅烷三醇钠盐的水溶液加入2-吗啉乙磺酸缓冲溶液中，使羧基乙基硅烷三醇钠盐浓度范围1-8%之间，搅拌10-30分钟；

2）向步骤1）的溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺的浓度为1-4mM，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺的浓度为4-10mM，搅拌30-120分钟；

3）将四肽加入到上述溶液中，使其浓度范围在0.05-0.6mg/mL之间，反应1-4小时；所述的四肽为精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-赖氨酸；

4）将卡那霉素溶解于2-吗啉乙磺酸缓冲溶液，使其浓度范围在0.05-0.6mg/mL之间；

5）在上述溶液中加入步骤3）的反应液，反应2-6小时；

6）将氧化石墨烯分散加入到无水乙醇中，超声处理，得到浓度为0.25-1.5mg/mL的氧化石墨烯分散液；

7）将步骤5）反应液与氧化石墨烯分散液混合，在50-80℃条件下搅拌12-24小时，透析

7-10天，冷冻干燥，得到医用氧化石墨烯抗菌剂；

所获得的医用氧化石墨烯抗菌剂的结构式如下：

。

2.根据权利要求1所述医用氧化石墨烯抗菌剂的制备方法，其特征在于：步骤1）中，所述的2-吗啉乙磺酸缓冲溶液的pH范围在5.5-6.5之间。

3.根据权利要求1所述医用氧化石墨烯抗菌剂的制备方法，其特征在于：步骤1）中，所述的羧基乙基硅烷三醇钠盐的水浓度的浓度为25%。

4.根据权利要求1所述医用氧化石墨烯抗菌剂的制备方法，其特征在于：所述的卡那霉素为硫酸卡那霉素。

5.根据权利要求1所述医用氧化石墨烯抗菌剂的制备方法，其特征在于：步骤6）中，所述的超声处理为超声300-1000W处理5-30分钟。

6.一种由权利要求1-4任意一项所述的医用氧化石墨烯抗菌剂的制备方法所得到的医用氧化石墨烯抗菌剂。

7.根据权利要求6所述的医用氧化石墨烯抗菌剂，其特征在于，结构式如下：。

8.权利要求6所述的医用氧化石墨烯抗菌剂在制备抑菌剂中的应用。

说明书

一种医用氧化石墨烯抗菌剂的制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物医用抗菌材料领域，特别涉及一种医用氧化石墨烯抗菌剂的制备方法。

背景技术

[0002] 随着人们生活水平的提高，人们对健康的意识在不断增强。但是，各种各样的致病微生物在自然界分布非常广泛，它们的生长和繁殖严重威胁着人类的健康。因而，安全，高效而且低成本的抗菌剂的研究和发展越来越受到人们的关注。现有大多数抗菌剂属于释放型，通常被负载在载体中，通过不断释放进入细菌体内进而发挥其抗菌作用。这会导致抗菌性能不断降低，直至消失，因此开发非释放型抗菌剂显得十分重要。非释放型抗菌剂不需要通过释放药物，只需要通过与细菌的直接接触而达到将细菌杀死的目的。在满足抗菌需求的同时尽量延长使用时间；此外还可以避免药物毒性残留的问题。因此，改抗菌剂的抗菌性能持久而稳定，低毒或无毒，对人类的安全性和健康明显提高。

[0003] 氧化石墨烯是一种石墨烯衍生物，它的基面上连接丰富的含氧基团，平面上含有羟基和环氧基，边缘含有羧基，这些官能团赋予了氧化石墨烯一定的化学活性，使其易于修饰。通过大量研究发现，氧化石墨烯的抗菌性能不明显。因此，利用小肽和抗生素对氧化石墨烯进行修饰，使其性能显著提高，如降低其毒性、提高生物活性、避免抗生素滥用等。同时，此研究开发所需投入少，且制备方法简单，绿色无污染，在生物医用抗菌材料有较高的应用价值。

发明内容

[0004] 发明目的：为了解决上述问题，本发明提供一种医用氧化石墨烯抗菌剂的制备方法，该方法简单易行，反应条件温和，绿色环保以及高效，在生物医用抗菌材料领域有较高的应用价值。

[0005] 技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

[0006] 一种医用氧化石墨烯抗菌剂的制备方法，包括如下步骤：

[0007] 1)取羧基乙基硅烷三醇钠盐的水溶液加入2-吗啉乙磺酸缓冲溶液中，使羧基乙基硅烷三醇钠盐浓度范围1-8％之间，搅拌10-30分钟；

[0008] 2)向步骤1)的溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺的浓度为1-4mM，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺的浓度为4-10mM，搅拌30-120分钟；

[0009] 3)将四肽加入到上述溶液中，使其浓度范围在0.05-0.6mg/mL之间，反应1-4小时；

[0010] 4)将卡纳霉素溶解于2-吗啉乙磺酸缓冲溶液，使其浓度范围在0.05-0.6mg/mL之间；

[0011] 5)在上述溶液中加入步骤3)的反应液，反应2-6小时；

[0012] 6)将氧化石墨烯分散加入到无水乙醇中，超声处理，得到浓度为0.25-1.5mg/mL的氧化石墨烯分散液；

[0013] 7)将步骤5)反应液与氧化石墨烯分散液混合，在50-80℃条件下搅拌12-24小时，透析7-10天，冷冻干燥，得到医用氧化石墨烯抗菌剂。

[0014] 步骤1)中，所述的2-吗啉乙磺酸缓冲溶液的pH范围在5.5-6.5之间。

[0015] 步骤1)中，所述的羧基乙基硅烷三醇钠盐的水浓度的浓度为25％。

[0016] 步骤3)中，所述的四肽为精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-赖氨酸(市售)。

[0017] 所述的卡那霉素为硫酸卡那霉素。

[0018] 步骤6)中，所述的超声处理为超声300-1000W处理5-30分钟。

[0019] 所述的医用氧化石墨烯抗菌剂的制备方法所得到的医用氧化石墨烯抗菌剂。

[0020] 所述的医用氧化石墨烯抗菌剂，结构式如下：

[0021]

[0022] 所述的医用氧化石墨烯抗菌剂在抑菌中的应用。

[0023] 有益效果：与现有技术相比，本发明的医用氧化石墨烯抗菌剂的制备方法，溶剂为2-吗啉乙磺酸缓冲溶液，不需要避光，是一种绿色、环保、便捷和高效的制备方法。该方法可以将卡那霉素和四肽接枝到氧化石墨烯上，有效地对卡那霉素、四肽和氧化石墨烯进行合理的联合应用。所制备的医用氧化石墨烯抗菌剂，不仅具有良好的生物相容性，而且对大肠杆菌抑菌率可以达到100％，抑菌效果显著，在同等抑菌率的情况下，有效减少了卡纳霉素的用量。在使用中，医用氧化石墨烯抗菌剂不会释放卡那霉素，有效避免了抗生素滥用造成的耐药性和超级细菌产生等问题，具有很好的实用性。

附图说明

[0024] 图1是医用氧化石墨烯抗菌剂的原子力显微镜图；

[0025] 图2是医用氧化石墨烯抗菌剂的透射电镜图；

[0026] 图3是医用氧化石墨烯抗菌剂对大肠杆菌的抑菌圈图片。

具体实施方式

[0027] 下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

[0028] 实施例1

[0029] 一种医用氧化石墨烯抗菌剂的制备方法，步骤如下：

[0030] 1)取羧基乙基硅烷三醇钠盐25％的水溶液加入2-吗啉乙磺酸缓冲溶液(pH＝5.5)中，使羧基乙基硅烷三醇钠盐浓度为2％，搅拌10分钟；

[0031] 2)向1)溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，使其浓度分别为1.5mM和5mM，搅拌60分钟；

[0032] 3)将四肽加入到上述溶液中，使其浓度为0.2mg/mL，反应1小时；

[0033] 4)将卡纳霉素溶解于2-吗啉乙磺酸缓冲溶液，使其浓度为0.2mg/mL；

[0034] 5)在上述溶液中加入步骤3)的反应液中，反应4小时；

[0035] 6)将氧化石墨烯分散加入到无水乙醇中，超声1000W处理5分钟，得到浓度为0.5mg/mL的氧化石墨烯分散液；

[0036] 7)将步骤5)反应液与氧化石墨烯分散液混合，在70℃条件下搅拌12小时，透析7天，冷冻干燥，得到医用氧化石墨烯抗菌剂。所获得的医用氧化石墨烯抗菌剂的结构式，如下所示：

[0037]

[0038] 对制备的医用氧化石墨烯抗菌剂进行性能测试，具体如下：

[0039] 1)原子力显微镜测试

[0040] 医用氧化石墨烯抗菌剂的原子力显微镜图，如图1所示。单层氧化石墨烯的厚度为1纳米左右，而从图中可以看出医用氧化石墨烯抗菌剂的厚度明显变厚，增加到3.5纳米。

[0041] 2)透射电镜测试

[0042] 医用氧化石墨烯抗菌剂的透射电镜照片，如图2所示。单层氧化石墨烯为半透明的片状结构，而从图2中可以看出医用氧化石墨烯抗菌剂的半透明性明显降低，转为不透明的片状，与原子力显微镜结果一致，表明医用氧化石墨烯抗菌剂的成功制备。

[0043] 3)抑菌圈测试

[0044] 将医用氧化石墨烯抗菌剂分散液滴在圆形滤纸上，进行干燥和紫外杀菌处理。将含有一定量大肠杆菌的菌液均匀涂于固体培养基上，再把无菌的样品放置到培养基上，在恒温培养箱中37℃过夜培养。

[0045] 医用氧化石墨烯抗菌剂对大肠杆菌的抑菌圈照片，如图3所示。从图中可以清楚地看到在医用氧化石墨烯抗菌剂的周围没有出现抑菌圈，说明该方法制备的医用氧化石墨烯抗菌剂不会释放卡那霉素，有效避免了抗生素滥用造成的耐药性和超级细菌产生等问题。

[0046] 实施例2

[0047] 一种医用氧化石墨烯抗菌剂的制备方法，步骤如下：

[0048] 1)取羧基乙基硅烷三醇钠盐25％的水溶液加入2-吗啉乙磺酸缓冲溶液(pH＝6.5)中，使羧基乙基硅烷三醇钠盐浓度为6％，搅拌20分钟；

[0049] 2)向1)溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，使其浓度分别为4mM和8mM，搅拌100分钟；

[0050] 3)将四肽加入到上述溶液中，使其浓度为0.3mg/mL，反应3小时；

[0051] 4)将卡纳霉素溶解于2-吗啉乙磺酸缓冲溶液，使其浓度为0.3mg/mL；

[0052] 5)在上述溶液中加入步骤3)的反应液中，反应2小时；

[0053] 6)将氧化石墨烯分散加入到无水乙醇中，超声600W处理15分钟，得到浓度为1mg/mL的氧化石墨烯分散液；

[0054] 7)将步骤5)反应液与氧化石墨烯分散液混合，在60℃条件下搅拌24小时，透析10天，冷冻干燥，得到医用氧化石墨烯抗菌剂。

[0055] 实施例3

[0056] 一种医用氧化石墨烯抗菌剂的制备方法，步骤如下：

[0057] 1)取羧基乙基硅烷三醇钠盐25％的水溶液加入2-吗啉乙磺酸缓冲溶液(pH＝6)中，使羧基乙基硅烷三醇钠盐浓度为10％，搅拌15分钟；

[0058] 2)向1)溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，使其浓度分别为3mM和10mM，搅拌40分钟；

[0059] 3)将四肽加入到上述溶液中，使其浓度为0.25mg/mL，反应4小时；

[0060] 4)将卡纳霉素溶解于2-吗啉乙磺酸缓冲溶液，使其浓度为0.25mg/mL；

[0061] 5)在上述溶液中加入步骤3)的反应液中，反应2小时；

[0062] 6)将氧化石墨烯分散加入到无水乙醇中，超声500W处理15分钟，得到浓度为0.75mg/mL的氧化石墨烯分散液；

[0063] 7)将步骤5)反应液与氧化石墨烯分散液混合，在80℃条件下搅拌18小时，透析10天，冷冻干燥，得到医用氧化石墨烯抗菌剂。

[0064] 实施例4

[0065] 一种医用氧化石墨烯抗菌剂的制备方法，步骤如下：

[0066] 1)取羧基乙基硅烷三醇钠盐25％的水溶液加入2-吗啉乙磺酸缓冲溶液(pH＝5.5)中，使羧基乙基硅烷三醇钠盐浓度为5％，搅拌20分钟；

[0067] 2)向1)溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，使其浓度分别为5mM和9mM，搅拌50分钟；

[0068] 3)将四肽加入到上述溶液中，使其浓度为0.35mg/mL，反应4小时；

[0069] 4)将卡纳霉素溶解于2-吗啉乙磺酸缓冲溶液，使其浓度为0.35mg/mL；

[0070] 5)在上述溶液中加入步骤3)的反应液中，反应4小时；

[0071] 6)将氧化石墨烯分散加入到无水乙醇中，超声300W处理20分钟，得到浓度为1.2mg/mL的氧化石墨烯分散液；

[0072] 7)将步骤5)反应液与氧化石墨烯分散液混合，在75℃条件下搅拌20小时，透析8天，冷冻干燥，得到医用氧化石墨烯抗菌剂。

[0073] 实施例5

[0074] 一种医用氧化石墨烯抗菌剂的制备方法，步骤如下：

[0075] 1)取羧基乙基硅烷三醇钠盐25％的水溶液加入2-吗啉乙磺酸缓冲溶液(pH＝6.2)中，使羧基乙基硅烷三醇钠盐浓度为5％，搅拌30分钟；

[0076] 2)向1)溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，使其浓度分别为2.5mM和6mM，搅拌80分钟；

[0077] 3)将四肽加入到上述溶液中，使其浓度为0.5mg/mL，反应3.5小时；

[0078] 4)将卡纳霉素溶解于2-吗啉乙磺酸缓冲溶液，使其浓度为0.5mg/mL；

[0079] 5)在上述溶液中加入步骤3)的反应液中，反应3.5小时；

[0080] 6)将氧化石墨烯分散加入到无水乙醇中，超声400W处理30分钟，得到浓度为1.5mg/mL的氧化石墨烯分散液；

[0081] 7)将步骤5)反应液与氧化石墨烯分散液混合，在65℃条件下搅拌16小时，透析7天，冷冻干燥，得到医用氧化石墨烯抗菌剂。

[0082] 实施例6

[0083] 一种医用氧化石墨烯抗菌剂的制备方法，步骤如下：

[0084] 1)取羧基乙基硅烷三醇钠盐25％的水溶液加入2-吗啉乙磺酸缓冲溶液(pH＝5.8)中，使羧基乙基硅烷三醇钠盐浓度为8％，搅拌25分钟；

[0085] 2)向1)溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，使其浓度分别为4.5mM和9mM，搅拌120分钟；

[0086] 3)将四肽加入到上述溶液中，使其浓度为0.45mg/mL，反应3.5小时；

[0087] 4)将卡纳霉素溶解于2-吗啉乙磺酸缓冲溶液，使其浓度为0.45mg/mL；

[0088] 5)在上述溶液中加入步骤3)的反应液中，反应3.5小时；

[0089] 6)将氧化石墨烯分散加入到无水乙醇中，超声700W处理25分钟，得到浓度为1.25mg/mL的氧化石墨烯分散液；

[0090] 7)将步骤5)反应液与氧化石墨烯分散液混合，在70℃条件下搅拌14小时，透析10天，冷冻干燥，得到医用氧化石墨烯抗菌剂。

[0091] 实施例7抑菌性能测试

[0092] 采用液态培养体系，在10mL胰蛋白胨大豆肉汤培养基中加入预先培养的大肠杆菌菌液，使其浓度为1×108CFU/mL，以不加样品为空白对照组，分别加入10mg医用氧化石墨烯抗菌剂，10mg氧化石墨烯、10mg卡纳霉素、10mg四肽，在37℃的摇床中培养5小时后，采用稀释涂平板的方法，对存活细菌进行计数，抑菌率由下列公式计算：

[0093] R(％)＝(N空白-N试样)/N试样×100％

[0094] 其中，N空白和N试样分别为空白对照锥形瓶和添加医用氧化石墨烯抗菌剂锥形瓶内的菌落数。经过计算，抑菌率结果如表1所示。

[0095] 表1是所制备医用氧化石墨烯抗菌剂的抑菌率

[0096]

[0097] 由表1可以得知，实施例中制备的医用氧化石墨烯抗菌剂对大肠杆菌的抑菌率均可以达到100％。在同等抑菌率的情况下，有效减少了卡纳霉素的用量。