本发明提供一种羊乳蛋白免疫调节肽，其包含Thr‑Gly‑Pro‑Ile‑Pro‑Asn‑Ser‑Leu、Arg‑Phe‑Phe‑Asp‑Asp‑Lys‑Ile‑Ala以及Ala‑Pro‑Glu‑Pro‑Glu‑Val‑Phe中的至少一条肽序列。此种羊乳蛋白免疫调节肽从羊乳清蛋白中的获得，原料易得；此种羊乳蛋白免疫调节肽对脾淋巴细胞增殖活性具有非常明显的促进作用，且呈现出一定的剂量依赖效应，具有免疫调节作用。本发明还公开一种上述羊乳蛋白免疫调节肽的制备方法，步骤精简；采用两种蛋白酶(胃蛋白酶和胰蛋白酶)的结合对羊乳清蛋白进行水解，有利于活性肽段更好地释放；采用凝胶色谱柱和高效液相色谱对羊乳蛋白水解物进行分离纯化，产品纯度更高。本发明还提高一种上述羊乳蛋白免疫调节肽的应用，用于制备具有免疫调节活性的食品或保健食品，应用前景广。
1.一种羊乳清蛋白免疫调节肽，其特征在于：包括Thr-Gly-Pro-Ile-Pro-Asn-Ser-Leu和Ala-Pro-Glu-Pro-Glu-Val-Phe两条肽。
2.根据权利要求1所述的羊乳清蛋白免疫调节肽，其特征在于：还包括一条肽：Arg-Phe-Phe-Asp-Asp-Lys-Ile-Ala。
3.一种如权利要求1所述的羊乳清蛋白免疫调节肽的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：第一步、将羊乳清蛋白加水溶解后，调节pH值至1.5-4.0，加入胃蛋白酶进行水解反应，得到水解反应体系；
第二步、保持水解反应体系的温度不变，调整水解反应体系的pH值至6.0-8.0，加入胰蛋白酶，继续水解1-2h；升高温度继续水解得到羊乳蛋白水解液；
第三步、将羊乳蛋白水解液冷却后离心取上清，收集滤过液，冻干，得到羊乳蛋白水解物粉末；
第四步、采用凝胶色谱柱和高效液相色谱对羊乳蛋白水解物进行分离纯化，得到羊乳蛋白免疫调节肽；
其中：胃蛋白酶按照每100g羊乳清蛋白添加400KU蛋白酶的比例加入；胰蛋白酶按照每
4.一种如权利要求2所述的羊乳清蛋白免疫调节肽的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：第一步、将羊乳清蛋白加水溶解后，调节pH值至1.5-4.0，加入胃蛋白酶进行水解反应，得到水解反应体系；
第二步、保持水解反应体系的温度不变，调整水解反应体系的pH值至6.0-8.0，加入胰蛋白酶，继续水解1-2h；升高温度继续水解得到羊乳蛋白水解液；
第三步、将羊乳蛋白水解液冷却后离心取上清，收集滤过液，冻干，得到羊乳蛋白水解物粉末；
第四步、采用凝胶色谱柱和高效液相色谱对羊乳蛋白水解物进行分离纯化，得到羊乳蛋白免疫调节肽；
其中：胃蛋白酶按照每150g羊乳清蛋白添加500KU蛋白酶的比例加入；胰蛋白酶按照每
5.根据权利要求3或4所述的羊乳清蛋白免疫调节肽的制备方法，其特征在于：所述第一步中：所述羊乳清蛋白的质量与水的体积的配比为1：10-1：30；
水解反应的温度为30℃-60℃，水解反应的时间为1-2小时；
调节pH值采用酸液，所述酸液为食品级乳酸以及柠檬酸溶液中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的羊乳清蛋白免疫调节肽的制备方法，其特征在于：所述第二步中：升高温度至80℃-90℃，在80℃-90℃条件下保温10-30min；
调节pH值采用碱液，所述碱液为食品级碳酸钠以及碳酸氢钠溶液中的至少一种。
7.根据权利要求6所述的羊乳清蛋白免疫调节肽的制备方法，其特征在于：所述第三步中：通过超滤膜收集滤液，所述超滤膜采用截留分子量为3000-10000Da的超滤膜。
8.根据权利要求7所述的羊乳清蛋白免疫调节肽的制备方法，其特征在于：所述第四步中采用凝胶色谱柱和高效液相色谱对羊乳蛋白水解物进行分离纯化具体包括以下步骤：步骤4.1、采用凝胶色谱对羊乳蛋白水解物进行浓缩得到精制羊乳蛋白免疫调节肽，其中：所述凝胶色谱柱为SephadexG-25，流动相为超纯水，流速为0.7-1.0mL/min，进样量为
10-30mg，收集左数第二个峰后进行浓缩得到精制羊乳蛋白免疫调节肽；
步骤4.2、采用高效液相色谱仪对精制羊乳蛋白免疫调节肽进行纯化，收集其中的三个主峰，冷冻干燥即得羊乳蛋白免疫调节肽。
9.一种如权利要求1-2任意一项所述的羊乳清蛋白免疫调节肽的应用，其特征在于：用于制备具有免疫调节活性的食品或保健食品。
一种羊乳清蛋白免疫调节肽、其制备方法及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及食品技术领域，特别地，涉及一种羊乳清蛋白免疫调节肽、其制备方法及其应用。
背景技术
[0002] 目前，随着社会的发展，环境污染、社会压力、人口老龄化等问题日益严重。在这些因素的影响下，机体就会不可避免地出现免疫力下降的现象，从而引发一系列的健康问题。近年来，乳源免疫活性肽备受关注。乳源免疫活性肽是利用蛋白酶水解乳蛋白分离得到的短肽，是继吗啡肽之后在乳蛋白中发现的第二类生物活性肽。在之前的报道中，已从牛乳中分离得到多条免疫调节肽序列，如来源于牛乳αs1-酪蛋白的TTMPLY，RYLGYLE，RYLGYL，FFVAPFPEVFGK；来源于牛乳β-酪蛋白的YQQPVLGPVRGPFPIIV，PGPIPN，YPFPGPIPNSL，APYPQR；
来源于牛乳κ-酪蛋白的FFSDK，YG。
[0003] 羊乳蛋白富含多种生物活性序列，研究表明，从羊乳蛋白中分离得到的肽段具有抑菌降血压、抗氧化、抑制DPP-4等多种生物活性。目前，羊乳蛋白肽的制备及应用得到了广泛的研究。如李志成等在中国专利201410247225.7中公布了一种山羊乳酪蛋白源抗菌肽的制备方法，并测定了所得抗菌肽的一级结构和二级结构；陈合等在中国专利201511024060.8中公布了一种抗氧化肽羊乳饮料的制备方法；陈合等在中国专利
201310132351.3中采用不同种类的蛋白酶水解羊乳酪蛋白，得到了ACE抑制肽。但是关于羊乳源的免疫调节肽序列却少有报道。
[0004] 因此，开发一种免疫调节肽、其制备方法以及其应用具有重要意义。
发明内容
[0005] 本发明的第一目的在于提供一种羊乳蛋白免疫调节肽，其包含Thr-Gly-Pro-Ile-Pro-Asn-Ser-Leu(TGPIPNSL，详序列表SEQ ID NO.1)、Arg-Phe-Phe-Asp-Asp-Lys-Ile-Ala(RFFDDKIA，详序列表SEQ ID NO.2)以及Ala-Pro-Glu-Pro-Glu-Val-Phe(APEPEVF，详序列表SEQ ID NO.3)中的至少一条肽序列。此种羊乳蛋白免疫调节肽从羊乳清蛋白中的获得，原料易得；此种羊乳蛋白免疫调节肽对脾淋巴细胞增殖活性具有非常明显的促进作用，且呈现出一定的剂量依赖效应，具有免疫调节作用。
[0006] 本发明还提供一种上述羊乳蛋白免疫调节肽的制备方法，包括以下步骤：
[0007] 第一步、将羊乳清蛋白加水溶解后，调节pH值至1.5-4.0，加入胃蛋白酶进行水解反应，得到水解反应体系；
[0008] 第二步、保持水解反应体系的温度不变，调整水解反应体系的pH值至6.0-8.0，加入胰蛋白酶，继续水解1-2h；升高温度继续水解得到羊乳蛋白水解液；
[0009] 第三步、将羊乳蛋白水解液冷却后离心取上清，收集滤过液，冻干，得到羊乳蛋白水解物粉末；
[0010] 第四步、采用凝胶色谱柱和高效液相色谱对羊乳蛋白水解物进行分离纯化，得到羊乳蛋白免疫调节肽。
[0011] 以上技术方案中优选的，所述第一步中：所述羊乳清蛋白的质量与水的体积的配比为1：10-1：30；所述胃蛋白酶按照每100g羊乳清蛋白添加300-800KU蛋白酶的比例加入；水解反应的温度为30℃-60℃，水解反应的时间为1-2h；调节pH值采用酸液，所述酸液为食品级乳酸以及柠檬酸溶液中的至少一种。
[0012] 以上技术方案中优选的，所述第二步中：所述胰蛋白酶按照每100g羊乳蛋白添加300-800KU蛋白酶的比例加入；升高温度至80℃-90℃，在80℃-90℃条件下保温10-30min；
调节pH值采用碱液，所述碱液为食品级碳酸钠以及碳酸氢钠溶液中的至少一种。
[0013] 以上技术方案中优选的，所述第三步中：通过超滤膜收集滤液，所述超滤膜采用截留分子量为3000-10000Da的超滤膜。
[0014] 以上技术方案中优选的，所述第四步中采用凝胶色谱柱和高效液相色谱对羊乳蛋白水解物进行分离纯化具体包括以下步骤：
[0015] 步骤4.1、采用凝胶色谱对羊乳蛋白水解物进行浓缩得到精制羊乳蛋白免疫调节肽，其中：所述凝胶色谱柱为SephadexG-25，流动相为超纯水，流速为0.7-1.0mL/min，进样量为10-30mg，收集左数第二个峰后进行浓缩得到精制羊乳蛋白免疫调节肽；
[0016] 步骤4.2、采用高效液相色谱仪对精制羊乳蛋白免疫调节肽进行纯化，收集其中的三个主峰，冷冻干燥即得羊乳蛋白免疫调节肽。
[0017] 采用本发明的制备方法，效果是：
[0018] 1、本发明采用两种蛋白酶(胃蛋白酶和胰蛋白酶)的结合对羊乳清蛋白进行水解，有利于活性肽段更好地释放。
[0019] 2.本发明利用凝胶色谱柱和高效液相色谱对羊乳蛋白酶解物进行分离纯化，并鉴定得到氨基酸序列，最终产品纯度较高。
[0020] 3.采用本发明制备得到的羊乳蛋白免疫调节肽食用安全性高、无副作用、吸收效果好，具有非常好的免疫调节活性。
[0021] 本发明还公开一种上述羊乳蛋白免疫调节肽的应用，主要用于制备具有免疫调节活性的食品或保健食品，应用前景广。
[0022] 除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照实施例，对本发明作进一步详细的说明。
具体实施方式
[0023] 以下结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明，但是本发明可以根据权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。
[0024] 实施例1：
[0025] 一种羊乳蛋白免疫调节肽，其包括两条肽序列：Thr-Gly-Pro-Ile-Pro-Asn-Ser-Leu(TGPIPNSL)和Ala-Pro-Glu-Pro-Glu-Val-Phe(APEPEVF)。
[0026] 上述羊乳蛋白免疫调节肽的制备方法如下：
[0027] 第一步、称取10g羊乳清蛋白，溶于200mL水中，在50℃水浴下调节pH至2.0，加入胃蛋白酶40KU，之后在保持温度、pH值不变的条件下水解1h，得到水解反应体系；
[0028] 第二步、保持水解反应体系的温度不变，调整水解反应体系pH值至8.0，加入胰蛋白酶50KU，继续水解2h；将反应体系升温至85℃，保持15min，得到羊乳蛋白水解液；
[0029] 第三步、将羊乳蛋白水解液冷却至室温离心30min(离心时的转速为4500r/min)，取上清液，调节上清液pH值至7.0，通过截留分子量为10kDa的超滤膜，收集滤过液，冷冻干燥，得到羊乳蛋白水解物粉末；
[0030] 第四步、将所得羊乳蛋白水解物粉末在流动相为超纯水，流速为1.0mL/min，进样量为10mg的条件下采用SephadexG-25凝胶色谱柱进行分离，收集左数第二个峰，浓缩后即为精制羊乳蛋白免疫调节肽；精制羊乳蛋白免疫调节肽用高效液相色谱仪进一步纯化，收集其中的三个主峰，冷冻干燥即得羊乳蛋白免疫调节肽。
[0031] 实施例2：
[0032] 一种羊乳蛋白免疫调节肽，其包括三条肽序列：Thr-Gly-Pro-Ile-Pro-Asn-Ser-Leu(TGPIPNSL)、Arg-Phe-Phe-Asp-Asp-Lys-Ile-Ala(RFFDDKIA)和Ala-Pro-Glu-Pro-Glu-Val-Phe(APEPEVF)。
[0033] 上述羊乳蛋白免疫调节肽的制备方法如下：
[0034] 第一步、称取15g羊乳清蛋白，溶于300mL水中，在55℃水浴下调节pH至3.0，加入胃蛋白酶50KU，之后在保持温度、pH值不变的条件下水解2h，得到水解反应体系；
[0035] 第二步、保持水解反应体系的温度不变，调整水解反应体系pH值至8.0，加入胰蛋白酶40KU，继续水解2h；将反应体系升温至85℃，保持20min，得到羊乳蛋白水解液；
[0036] 第三步、将羊乳蛋白水解液冷却至室温离心20min(离心时的转速为4500r/min)，取上清液，调节上清液pH值至7.0，通过截留分子量为5000Da的超滤膜，收集滤过液，冷冻干燥，得到羊乳蛋白水解物粉末；
[0037] 第四步、将所得羊乳蛋白水解物粉末在流动相为超纯水，流速为0.7mL/min，进样量为10mg的条件下采用SephadexG-25凝胶色谱柱进行分离，收集左数第二个峰，浓缩后即为精制羊乳蛋白免疫调节肽；精制羊乳蛋白免疫调节肽用高效液相色谱仪进一步纯化，收集其中的三个主峰，冷冻干燥即得羊乳蛋白免疫调节肽。
[0038] 采用实施例1和实施例2所得羊乳蛋白免疫调节肽进行动物试验，详情如下：
[0039] 1、试验对象：将5周龄雄性C57BL/6J小鼠颈椎脱臼处死，在无菌条件下取下脾脏，在RPMI-1640培养基中磨碎，过200目不锈钢筛网，得细胞悬液。细胞悬液在1000r/min条件下离心5min，弃去上清液，收集细胞。用含血清得完全RPMI-1640培养基调整细胞密度为2×106个/mL。在96孔细胞培养板中加入脾细胞悬浮液。
[0040] 2、分组：
[0041] ①阴性对照，不添加ConA(刀豆蛋白A)；
[0042] ②阳性对照组，添加10μL ConA(终浓度5.0μg/mL)；
[0043] ③样品组1，添加终浓度分别为0.0625mg/mL、0.125mg/mL以及0.25mg/mL的实施例1所得羊乳乳清蛋白免疫调节肽；
[0044] ④样品组2，添加终浓度分别为0.0625mg/mL、0.125mg/mL以及0.25mg/mL的实施例2所得羊乳乳清蛋白免疫调节肽。
[0045] 3、具体实验：将细胞孵育48h后，每孔加入20μL MTT(浓度5mg/mL)，继续培养4h后，小心吸去上清，每孔加入150μL DMSO，于570nm处检测OD值。按下列计算刺激指数(SI)：
[0046] SI＝(OD样品i-OD阴性对照)/(OD阳性对照-OD阴性对照)，其中i取1或2；
[0047] SI值越大说明免疫调节活性越强。
[0048] 实验结果见表1：
[0049] 表1实施例1-2中不同浓度羊乳清蛋白免疫调节肽对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增
[0050] 殖的影响
[0051]
[0052] 注：数值以平均值±标准差的形式表示；同列不同字母代表具有显著性差异，p<0.05。
[0053] 从表1中可以看出：实施例1和实施例2中采用0.25、0.5、1.0mg/mL羊乳蛋白免疫调节肽处理后，ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞SI值均有提高。可见，本发明制备的羊乳蛋白免疫调节肽对小鼠脾淋巴细胞增殖活性具有非常明显的促进作用，且呈现出一定的剂量依赖效应。
[0054] 以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
[0055]
