一株高繁殖能力猪瘟病毒及其构建方法

摘要

本发明涉及猪瘟病毒的构建及应用，旨在提供一株高繁殖能力猪瘟病毒及其构建方法。该病毒苗株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏名称为猪瘟病毒弱毒株定点突变株CSFV‑Cmut8，保藏号为CCTCC No：V201744。本发明利用反向遗传学方法，通过对C株基因组上特定的8个位点进行改造，得到CSFV‑Cmut8。相较于母本C株，该病毒可在体外培养细胞中产生较高滴度，在连续传代过程中保持稳定的遗传特性，并对自然宿主猪无致病力。本发明可以提高疫苗的产量，降低成本，作为猪瘟免疫候选疫苗毒株。本发明可用于提高以C株为骨架的其他疫苗的细胞适应性，提高病毒拯救成功率，降低猪瘟细胞苗的生产成本。

权利要求

1.一株高繁殖能力猪瘟病毒的弱毒疫苗株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏名称为猪瘟病毒弱毒株定点突变株CSFV-Cmut8，保藏号为CCTCC No：V201744。

2.权利要求1所述猪瘟病毒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)以猪瘟病毒疫苗C株的感染性克隆为模板，通过引入突变位点，利用一步定向克隆方法，将C株基因组上1802位、3310位、3433位、3531位、4085位、8286位、10332位和11836位核苷酸进行突变，得到含有8个特定突变位点的感染性克隆；

所述突变的结果为：C1802A、T3310G、C3433T、G3531T、A4085G、C8286A、A10332G和A11836C，相对应的氨基酸变化为：S476R、M979R、A1020V、V1053L、I1237M、L2638I、S3320G和K3821T；

(2)将突变后的感染性克隆线性化，利用体外转录方法得到突变病毒基因组RNA，并电转至PK-15细胞，通过连续传代的方法得到具有感染性的重组病毒CSFV-Cmut8。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所用的8对突变引物如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.16所示。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，还包括对遗传稳定性的测试，是将CSFV-Cmut8连续传30代，对第1、10、20和30代毒进行全长测序，分析其遗传稳定性。

说明书

一株高繁殖能力猪瘟病毒及其构建方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一株高繁殖能力猪瘟病毒及其构建方法。通过该技术的建立，可提高猪瘟弱毒疫苗C株在体外培养细胞中的生长能力，同时也可用于对猪瘟病毒复制、致病机理等方面的深入研究。

背景技术

[0002] 猪瘟(classical swine fever，CSF)是一种高度接触性传染病，其以发病急、高热稽留、毛细血管壁变性引起的全身泛发性点状出血和脾梗死为特征。虽早已引起各国重视，但由于养猪业的集约化和生猪贸易全球化，猪瘟依然对养猪业构成重大威胁。国际动物卫生组织(OIE)将该病列入A类传染病，并规定为国际重要检疫对象。

[0003] 猪瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)是有囊膜的单股正链RNA病毒，属于黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)。其基因组大小约12300nt，由5’端和3’端非编码区及中间一个大开放阅读框(ORF)组成。其ORF翻译后形成一个由3898个氨基酸构成的多聚蛋白前体，在宿主及病毒特有的蛋白酶水解下，形成4个结构蛋白及8个非结构蛋白。

[0004] 在许多国家，疫苗免疫依然是控制猪瘟的有效手段。目前广泛应用的疫苗是我国1954年研发出的猪瘟兔化弱毒疫苗C株。半个多世纪以来，由于其遗传稳定、免疫效果好，被国内外公认为安全有效的弱毒疫苗。但由于C株是由石门系强毒在兔体内长期传代获得，其细胞嗜性发生改变，对猪细胞系的适应性差。在用猪细胞系培养时不能产生较高的滴度，限制了C株细胞苗的生产，提高了生产成本。因此，提高C株在体外培养细胞中的适应性，对于降低其生产成本具有重要意义。

[0005] 近年来，基于猪瘟病毒的反向遗传操作系统已日渐成熟，可在cDNA水平上对C株基因组进行改造。

发明内容

[0006] 本发明要解决的技术问题是，克服现有猪瘟弱毒疫苗株在细胞中生长慢和毒价低的问题、疫苗生产成本高的问题，提供一株高繁殖能力猪瘟病毒及其构建方法。本发明能提高疫苗C株在体外培养细胞中的适应性和增殖能力，降低疫苗的生产成本。

[0007] 为解决技术问题，本发明的解决方案是：

[0008] 提供一株高繁殖能力猪瘟病毒的弱毒疫苗株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏名称为猪瘟病毒弱毒株定点突变株CSFV-Cmut8，保藏号为CCTCC No：V201744。

[0009] 本发明进一步提供了前述猪瘟病毒的构建方法，包括以下步骤：

[0010] (1)以猪瘟病毒疫苗C株的感染性克隆为模板，通过引入突变位点，利用一步定向克隆方法，将C株基因组上1802位、3310位、3433位、3531位、4085位、8286位、10332位和11836位核苷酸进行突变，得到含有8个特定突变位点的感染性克隆；

[0011] 所述突变的结果为：C1802A、T3310G、C3433T、G3531T、A4085G、C8286A、A10332G和A11836C，相对应的氨基酸变化为：S476R、M979R、A1020V、V1053L、I1237M、L2638I、S3320G和K3821T；

[0012] (2)将突变后的感染性克隆线性化，利用体外转录方法得到突变病毒基因组RNA，并电转至PK-15细胞，通过连续传代的方法得到具有感染性的重组病毒CSFV-Cmut8。

[0013] 本发明中，所用的8对突变引物如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.16所示。具体可见下述的表1：

[0014]

[0015]

[0016] 本发明中，还包括对遗传稳定性的测试，是将CSFV-Cmut8连续传30代，对第1、10、20和30代毒进行全长测序，分析其遗传稳定性。

[0017] 本发明中，进一步提供了前述猪瘟病毒弱毒疫苗毒株在制备猪瘟免疫药物中的应用。

[0018] 与现有技术相比，本发明的效果在于：

[0019] 1、本发明利用反向遗传学方法，通过对C株基因组上特定的8个位点进行改造，得到CSFV-Cmut8。相较于母本C株，该病毒可在体外培养细胞中产生较高滴度，在连续传代过程中保持稳定的遗传特性，并对自然宿主猪无致病力。由于具有与其亲本毒株相似的安全性和免疫原性，且在体外培养细胞中生长快于亲本毒株，本发明可以提高疫苗的产量，降低成本，作为猪瘟免疫候选疫苗毒株。

[0020] 2、本发明可用于提高以C株为骨架的其他疫苗(如各类标记疫苗及E2嵌合疫苗)的细胞适应性，提高病毒拯救成功率，降低猪瘟细胞苗的生产成本。

附图说明

[0021] 图1为以C株为母本引入8个突变位点示意图，图中标记的星号为突变位点所在位置。

[0022] 图2为体外转录所得RNA电转入PK-15细胞后，利用免疫荧光(IFA)检测病毒蛋白表达情况。利用抗C株E2蛋白的单克隆抗体检测病毒转染后前三代E2蛋白表达情况。A、B、C分别为电转后第1、2、3代病毒，D为第3代病毒上清感染PK-15细胞后，E2蛋白表达情况。

[0023] 图3为CSFV-Cmut8连续传30代后，将病毒进行全长测序，其中引入的8个突变位点区域的测序结果，这些位点保持稳定不变。

[0024] 图4为CSFV-Cmut8与其母本C株以相同MOI感染细胞后，在不同时间点两病毒滴度与病毒基因组拷贝数的比较，虚线表示RNA拷贝数，实线表示TCID50。

[0025] 图5为CSFV-Cmut8与其母本C株接种48日龄无猪瘟病毒抗体猪后的体温变化，DMEM为培养基对照。

[0026] 图6为CSFV-Cmut8与其母本C株接种48日龄无猪瘟病毒抗体猪后的白细胞、中性粒细胞及淋巴细胞水平变化，DMEM为培养基对照。

[0027] 图7为CSFV-Cmut8与其母本C株接种48日龄无猪瘟病毒抗体猪后的血清E2抗体水平变化，DMEM为培养基对照。

具体实施方式

[0028] 参考附图，下面对本发明进行详细描述。

[0029] 本发明所述的猪瘟病毒弱毒疫苗株，已于2017年10月26日在中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，简称CCTCC)对其进行了保藏，保藏号为CCTCC No：V201744。中国典型培养物保藏中心的地址为：湖北省武汉市武昌珞珈山(武汉大学，保藏中心)。

[0030] 实施例1：C株基因组上特定8个位点突变

[0031] 以猪瘟病毒弱毒C株感染性克隆为模板以，C1802A-fwd/C1802A-rev为引物，PCR扩增得到含有1802位点突变的线性化质粒。利用一步定向克隆试剂盒(Vazyme)，在重组酶的作用下，含有1802位点突变的线性化质粒在体外重组成环，得到含有1802位点突变的感染性克隆pRecC-C1802A。

[0032] 以含有1802位点突变的质粒pRecC-C1802A为模板，T3310G-fwd/T3310G-rev为引物，PCR扩增得到含有1802和3310位点突变的线性化质粒。利用一步定向克隆试剂盒中的重组酶将线性化质粒在体外重组成环，得到含有1802和3310位点突变的感染性克隆pRecC-C1802A,T3310G。

[0033] 用同样的方法，将3433位、3531位、4085位、8286位、10332位和11836位突变引入，最终得到同时携带这8个位点的感染性克隆pRecC-mut8(C1802A、T3310G、C3433T、G3531T、A4085G、C8286A、A10332G和A11836C)。进行突变的流程如图1所示，所用引物序列如发明内容部分的表1所示。

[0034] 实施例2：含特定8个位点突变的C株病毒拯救。

[0035] 将1mL过夜培养的菌液接入200mL LB培养基中，同时加入浓度为50mg/mL的Ampicillin 200μL，28℃扩大培养16h。收集菌液后用质粒纯化试剂盒(Promega)提取质粒。测定浓度后，用限制性内切酶XhoⅠ(TaKaRa)将质粒酶切过夜，得到线性化质粒。以纯化后的线性化质粒为模板，体外转录出病毒基因组RNA(Ambion)。

[0036] PK-15细胞消化后，用无血清培养基Opti-MEM(Thermo)洗两次。将2μg基因组RNA与2×106细胞混匀后加入2mm电转杯(Bio-Rad)中，用电转仪Gene Pulser Xcell(Bio-Rad)进行电转，参数：150V，25μF，电阻无穷。电转后用完全培养基将细胞重悬，37℃5％CO2培养箱中培养72h，IFA鉴定是否出毒。结果显示可以检测到荧光信号，且呈典型的戒指环状核周围染色。将细胞进行带毒传代，同时进行IFA检测，直至绝大部分细胞均被病毒感染(图2)。

[0037] 为检测是否产生成熟的子代病毒粒子，将带毒传代的细胞反复冻融，离心去除细胞碎片后，取上清接种PK-15细胞，72h后进行IFA检测。结果同样可检测到荧光信号，表明已产生具有感染性的子代病毒，命名为CSFV-Cmut8。

[0038] 实施例3：CSFV-Cmut8遗传稳定性检测。

[0039] 将CSFV-Cmut8感染PK-15细胞后，带毒传30代。期间收集每一代毒液，放于-80℃冰箱保存。将第1、10、20和30代毒提取RNA(AXYGEN)，反转为cDNA(Vazyme)后，将基因组分成5段进行全长测序，测序用引物的序列为SEQ ID NO.17～SEQ ID NO.26，具体如下述表2所示。测序结果显示第1、10、20和30代毒未出现突变，特定的8个位点也未出现回复突变(图3)，表明此病毒遗传稳定性良好。

[0040]

[0041] 实施例4：CSFV-Cmut8生长曲线测定

[0042] PK-15细胞铺24孔板，每孔1×105个细胞，C株和CSFV-Cmut8两株毒以MOI＝0.01感染细胞。在感染后第24h、36h、48h、60h、72h和96h分别收集总培养物及细胞RNA，并对每个时间点进行IFA检测，样品于-80℃保存。计算各时间点的TCID50及病毒基因组拷贝数，绘制病毒生长曲线。

[0043] 结果CSFV-Cmut8的增殖能力明显强于母本C株(图4)，在72h时，CSFV-Cmut8滴度达到最高值(106.5TCID50/mL)，而C株滴度在96h时达到最高值(104.875TCID50/mL)，滴度相差约40倍。CSFV-Cmut8的基因组拷贝数也显著高于母本C株。

[0044] 实施例5：CSFV-Cmut8安全性。

[0045] 17头50日龄仔猪随机分为3组，I组5头，II组6头，III组6头。I组颈部肌肉注射5mL DMEM培养基作为对照；II组颈部肌肉注射5×104TCID50猪瘟兔化弱毒C株；III组颈部肌肉注射5×104TCID50CSFV-Cmut8。期间每天记录体温一次，并对出现的症状进行记录评分。每隔7天对猪进行采血，并采集鼻拭子及肛拭子，检测病毒血症、抗体生成情况、免疫相关细胞数的变化。在第21天每组随机挑选3头猪进行剖检，检测病理变化情况。在第35天对剩余猪进行剖检，检测病理变化情况。

[0046] 结果：在试验期内各组猪均未出现体温升高(图5)及任何猪瘟病毒引起的典型症状。血常规检测结果显示，CSFV-Cmut8组的白细胞、中性粒细胞及淋巴细胞数未出现明显变化，与疫苗C株和DMEM两对照组基本趋势一致(图6)。病毒血症检测结果显示，在第7天，C株组和CSFV-Cmut8组各有3头猪可检到微量的病毒RNA，第14天两组各有2头猪可检到微量RNA，第21天及以后均检测不到病毒RNA。在每周收集的鼻拭子及肛拭子中均未检测到病毒RNA。第21天及35天的剖检结果显示，各免疫器官及病毒嗜性组织中均未出现病理变化。与母本C株一样，CSFV-Cmut8组在第14天起可检测到E2蛋白特异性抗体，此后持续上升，第28天接近高峰(图7)。以上结果表明，CSFV-Cmut8保持了母本C株良好的生物安全性及诱导抗体生成的能力。

[0047] 需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以多种变化形式。本领域的技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变化形式，均应认为是本发明的保护范围。