一种具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌鞭毛蛋白FliC转让专利
申请号 : CN201810134891.8
文献号 : CN108330143B
文献日 : 2021-07-09
发明人 : 张志强 , 史秋梅 , 吴同垒 , 高桂生 , 苏硕青
申请人 : 河北科技师范学院
摘要 :
权利要求 :
1.具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌鞭毛蛋白FliC在制备亚单位疫苗中的应用,其特征在于,所述亚单位疫苗的制备方法如下:(1)以迟缓爱德华菌ET‑1基因组序列为模板,P1和P2为引物,PCR扩增fliC基因;其中引物P1和P2为:
P1:5’‑ATGGCACAAGTAATTAATACC‑3’ SEQ ID NO:1;
P2:5’‑ACGCAGCAGAGACAGGACG‑3’ SEQ ID NO:2;
(2)构建pMD18‑T‑fliC载体,对fliC基因进行序列测定;
(3)测序结果正确的菌株扩大培养,提取质粒,以pMD18‑T‑fliC为模板,P3和P4为引物,PCR扩增fliC基因,获得纯化目的基因;其中引物P3和P4为:P3:5’‑CGGGATCCATGGCACAAGTAATTAATACC‑3’,BamHⅠ;SEQ ID NO:3;
P4:5’‑GCGTCGACACGCAGCAGAGACAGGACG‑3’,SalⅠ;SEQ ID NO:4;
(4)利用限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ对纯化目的基因和pET‑32a载体分别进行双酶切,构建重组表达载体pET‑32a‑fliC;
(5)将重组表达载体转化DH5α感受态细胞,挑取单克隆进行PCR和双酶切验证,获得阳性克隆,提取质粒,测序;
(6)将重组表达载体pET‑32a‑fliC和空载体pET‑32a分别转化BL21工程菌,进行重组蛋白的原核表达;
(7)利用SDS‑PAGE分析重组蛋白表达情况;
(8)对重组蛋白进行Western blot验证;
2+
(9)取诱导表达上清,利用Ni 亲和层析方法进行纯化,获得蛋白FliC;
(10)将步骤(9)获得的蛋白FliC用弗氏完全佐剂乳化,获得亚单位疫苗;
步骤(6)所述转化BL21工程菌的具体步骤如下:分别将5μL重组载体pET‑32a‑fliC和5μL空载体pET‑32a加入到100μL BL21工程菌中;冰浴30min,42℃热击90s,冰浴5min;加入1mL液体LB培养基,37℃复壮1h后,各取5μL涂布于氨苄终浓度为100μg/mL的固体LB平板,倒置,
37℃培养过夜。
2.根据权利要求1所述的具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌鞭毛蛋白FliC在制备亚单位疫苗中的应用,其特征在于,步骤(1)所述PCR扩增的反应体系共20μL,其中2×Taq PCR Mix 10μL,20μM P1 1μL,20μM P2 1μL,模板1μL,ddH2O 7μL;PCR扩增的反应程序为94℃预变性5min,94℃ 30s,54℃ 30s,72℃ 60s,25个循环,72℃ 10min。
3.根据权利要求1所述的具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌鞭毛蛋白FliC在制备亚单位疫苗中的应用,其特征在于,步骤(3)所述PCR扩增的反应体系共20μL,其中2×Taq PCR Mix 10μL,20μM P3 1μL,20μM P4 1μL,模板1μL,ddH2O 7μL;PCR扩增的反应程序为94℃预变性5min,94℃ 30s,52℃ 30s,72℃ 60s,30个循环,72℃ 10min。
4.根据权利要求1所述的具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌鞭毛蛋白FliC在制备亚单位疫苗中的应用,其特征在于,步骤(8)所述Western blot验证以His‑Mab为一抗、HRP‑IgG为二抗。
说明书 :
一种具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌鞭毛蛋白FliC
技术领域
背景技术
高效、安全的防治方法。疫苗使用在畜禽生产上的巨大成功给水产养殖提供诸多借鉴,多种
水产疫苗被开发应用,展现良好前景,遗憾的是,目前尚无商品化疫苗用于防控迟缓爱德华
菌感染。除此之外,迟缓爱德华菌可以引起人的多种类型感染,近年来人通过食源途径感染
的报道不断增多,揭示了本菌的公共卫生学价值。
起到疫苗佐剂的作用,进一步研究发现,鞭毛蛋白可以通过TLR5通路诱导炎症反应发生并
促使树突状细胞成熟。该蛋白无论是与抗原混合还是融合表达,均表现出良好的免疫效果。
除此之外,鞭毛蛋白本身具有较强的免疫原性,具有一定的免疫保护力。FliC是构成鞭毛丝
的主要蛋白成分,是目前鞭毛研究的焦点蛋白,其生物学功能得到一定程度解析。本发明通
过原核表达方法获得大量纯化的迟缓爱德华菌鞭毛蛋白FliC的重组蛋白,并进一步利用动
物实验评估该重组蛋白的免疫原性和对于模型动物的保护力,表明迟缓爱德华菌鞭毛蛋白
FliC能够用于研制亚单位疫苗。
发明内容
德华菌亚单位疫苗。
M)各1μL,ddH2O 7μL;PCR扩增的反应程序为94℃预变性5min,94℃30s,54℃30s,72℃60s,
25个循环,72℃10min;其中引物P1和P2为:
Mix 10μL,引物P3(20μM)和P4(20μM)各1μL,模板1μL,ddH2O 7μL;PCR扩增的反应程序为94
℃预变性5min,94℃30s,52℃30s,72℃60s,30个循环,72℃10min;其中引物P3和P4为:
加入到100μL BL21工程菌中;冰浴30min,42℃热击90s,冰浴5min;加入1mL液体LB培养基,
37℃复壮1h后,各取5μL涂布于氨苄终浓度为100μg/mL的固体LB平板,倒置,37℃培养过夜;
物的保护力,从而进一步研制迟缓爱德华菌亚单位疫苗和核酸疫苗靶点,同时,迟缓爱德华
菌FliC蛋白还具有佐剂特性。
附图说明:
具体实施方式
7μL,共20μL;PCR扩增的反应程序为94℃预变性5min,94℃30s,54℃30s,72℃60s,25个循
环,72℃10min;回收fliC基因片段,连接PMD18‑T载体,连接体系如下:目的基因4.5μL,
pMD18‑T Vector 0.5μL,2×Connectbuffer 5μL,共10μL,16℃连接过夜。连接产物转化入
DH5α感受态细胞;挑取单菌落进行PCR检测,阳性菌落送由北京生工测序。
str.AR_0009,S.typhimurium str.LT2,E.coli str.K‑12,S.enterica str.SGB23,
Kosakonia cowaniistr.Esp_Z)菌株fliC基因序列,分析fliC基因保守性,结果发现,爱德
华菌属成员间fliC基因高度保守。
(20μM)和P4(20μM)各1μL,模板1μL,ddH2O 7μL;反应程序为94℃预变性5min,94℃30s,52℃
30s,72℃60s,30个循环,72℃10min;获得大小为1248bp的目的片段(如图1所示),纯化目的
基因,将目的基因与原核表达载体pET‑32a连接构建重组表达载体;其中引物P3和P4为:
22℃连接30min,将全部连接产物转入100μLDH5α感受态细胞中,冰浴30min,42℃热浴90s,
冰浴5min,加入1mL LB液体培养基,37℃复壮1h,涂布于含有氨苄终浓度为100μg/mL的固体
LB平板,倒置于37℃培养过夜。次日,挑取单克隆用P3、P4引物进行PCR验证。阳性克隆提取
质粒进行双酶切验证和序列测定,无突变和移码即得到重组表达载体pET‑32a‑fliC。
的平板,倒置于37℃培养过夜。挑取单菌落接种于含有100μg/L氨苄青霉素的液体LB培养基
中,37℃震荡培养至对数期,加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L,诱导表达5h。离心收集菌体沉
淀,PBS缓冲液洗涤3次;加入蛋白上样缓冲液,充分混匀后煮沸10min,离心,收集上清液即
为蛋白样品,利用SDS‑PAGE进行分析,上样后,电压调至80V,待样品通过分离胶与浓缩胶分
隔线后,将电压调至120V,至电泳结束,取出胶片考马斯亮蓝染色1min,用蒸馏水多次煮沸
脱色;结果如图2所示,在60kD处诱导表达出目的蛋白;以His‑MAb为一抗,HRP‑IgG为二抗,
分别用5%脱脂奶粉按1:1000和1:5000稀释,用Westernblot方法进一步确认目的蛋白表
达,具体步骤如下:SDS‑PAG电泳后,取出胶片,利用转膜仪将蛋白转至NC膜上,80V转膜1h;
转膜结束后,取出NC膜,PBST洗涤3次,5min/次;5%脱脂奶粉室温封闭1h,PBST洗涤3次,
5min/次;用5%脱脂奶粉按1:1000稀释His‑Mab作为一抗,室温孵育1h;PBST洗涤3次,5min/
次;5%脱脂奶粉按1:5000稀释HRP‑IgG作为二抗,室温孵育30min;PBST洗涤3次,5min/次;
加入显影液,避光5min,最后发光显影;结果如图3所示,在60kD处出现目的蛋白条带,证明
His‑FliC重组蛋白表达成功。
SDS‑PAGE,结果如图4所示,均在60kD处出现蛋白条带。
0.36mg/mL。
鼠阳性血清可以特异性识别重组His‑FliC蛋白。
化),间隔2周后,第二次免疫(弗氏不完全佐剂乳化),30d后以弗氏不完全佐剂乳化蛋白加
强免疫;对照组小鼠三次免疫均注射等体积的PBS(加对应佐剂)。第48d对两组小鼠腹腔接
7
种迟缓爱德华菌ET‑CL菌液,剂量为5LD50(2.0×10cfu),感染后观察4d,统计死亡数量。结
果显示,对照组小鼠全部死亡,免疫组小鼠死亡6只,其余小鼠在经历短暂精神沉郁、不食后
逐渐恢复健康。结果如图7所示,表明His‑FliC重组蛋白免疫小鼠后具有一定保护力,保护
率为70%。
对照。免疫途径为皮下注射,免疫分两次进行,第一次免疫后间隔10d进行第二次免疫,蛋白
免疫剂量均为100μg/只。BSA蛋白油乳剂免疫组第一次免疫加完全弗氏佐剂,第二次免疫加
不完全弗氏佐剂进行免疫,空白对照组以PBS替代。
加3倍标准差作为阴阳性判定标准,计算出临界值为0.176,当待检血清OD值大于临界值时
判定为阳性;当待检血清OD值小于临界值时判定为阴性。
BSA免疫小鼠几乎不产生特异性抗体,而弗氏佐剂或FliC混合免疫能够刺激机体产生较高
的特异性抗体,证明了迟缓爱德华菌FliC蛋白的佐剂特性。
小鼠能够产生较高水平特异性抗体,在加强免疫后达到最高水平。