一种比值式检测HNO的纳米荧光探针及其制备方法和应用

摘要

本发明涉及一种比值式检测HNO的纳米荧光探针的制备方法和应用。本发明所述纳米荧光探针由化合物P‑BODIPY‑R经两性聚合物包裹制得；所述化合物P‑BODIPY‑R结构通式如下：其中R1、R2为引入的取代基，可调节荧光探针分子中的电子效应，使其响应HNO时荧光发生比值式变化。本发明提供的纳米荧光探针可用于比值式检测生物体内的活性小分子HNO。本发明中通过引入两性聚合物并包裹荧光探针小分子P‑BODIPY‑R制备纳米胶束，使探针小分子生物兼容性得到极大的改善，同时该纳米荧光探针对HNO选择性较好，抗干扰能力更强，具有更高的灵敏性，可对活体细胞内和斑马鱼体内的HNO进行实时跟踪检测。

权利要求

1.一种比值式检测HNO的纳米荧光探针，由荧光探针小分子P-BODIPY-R经两性聚合物包裹制得；

所述荧光探针小分子P-BODIPY-R结构通式如下：其中R1为吗啡啉基， R2为苯基。

2.根据权利要求1所述比值式检测HNO的纳米荧光探针，其特征在于，所述纳米荧光探针为纳米胶束，所述纳米胶束的外层为两性聚合物，内部为小分子化合物P-BODIPY-R。

3.一种权利要求1所述比值式检测HNO的纳米荧光探针的制备方法，包括如下步骤：(1)以HO-BODIPY-R为原料经酯化反应得到P-BODIPY-R荧光探针小分子，所述化合物HO-BODIPY-R具有如下所示结构：其中R1为吗啡啉基，R2为苯基；

 (2)所述化合物小分子P-BODIPY-R经两性聚合物包裹制得纳米胶束，进而得到比值式检测HNO的纳米荧光探针。

4.一种用于检测HNO的化合物，其特征在于，所述化合物P-BODIPY-R，其结构通式如下：其中R1为吗啡啉基， R2为苯基。

5.一种权利要求4所述用于检测HNO的化合物的制备方法，包括如下步骤：以HO-BODIPY-R为原料经酯化反应得到P-BODIPY-R化合物，所述化合物HO-BODIPY-R具有如下所示结构：其中R1为吗啡啉基，R2为苯基。

6.一种权利要求1所述检测HNO的比值式纳米荧光探针在检测细胞内HNO或斑马鱼体内HNO的非疾病诊断或治疗的应用。

7.一种权利要求4所述用于检测HNO的化合物在检测细胞内HNO或斑马鱼体内HNO的非疾病诊断或治疗的应用。

说明书

一种比值式检测HNO的纳米荧光探针及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物化工领域，涉及构建一种可用于检测生物体内HNO的新型比值式纳米荧光探针，具体涉及一种检测HNO的纳米荧光探针的制备方法和生物应用。

背景技术

[0002] BODIPY类化合物是一种性能优异的荧光染料，其具有较高的荧光量子产率，通过硼桥键和甲川键把两个吡咯环固定在一个平面上，使分子具有刚性共平面结构，在激发光的作用下能产生较为强烈的荧光，并且其高度的刚性共平面结构使其具有较高的摩尔消光系数、较好的光化学与光物理稳定性、激发波长在可见光区、半峰宽较窄等优点，此外其结构易于修饰，可调节发射波长至近红外区。这些优点使其在生物应用（特别是作为荧光探针的信号检测基团）方面得到广泛的重视。目前合成此类染料的研究工作仍存在不足，如设计的荧光探针分子的水溶性差、检测范围比较局限、大部分用于检测外源性的小分子等。

发明内容

[0003] 本发明第一个目的是提供一种比值式检测HNO的水溶性较好的纳米荧光探针。

[0004] 本发明第二个目的是提供一种比值式检测HNO的纳米荧光探针的制备方法。

[0005] 本发明第三个目的是提供一种比值式检测HNO的纳米荧光探针在检测细胞内HNO的应用。

[0006] 本发明第四个目的是提供一种比值式检测HNO的纳米荧光探针在检测斑马鱼体内HNO的应用。

[0007] 本发明第五个目的是提供一种比值式检测HNO的化合物。

[0008] 本发明第六个目的是提供一种比值式检测HNO的化合物的制备方法。

[0009] 本发明第七个目的是提供一种比值式检测HNO的化合物在检测细胞内HNO的应用。

[0010] 本发明第八个目的是提供一种比值式检测HNO的化合物在检测斑马鱼体内HNO的应用。

[0011] 本发明的技术方案如下：

[0012] 一种检测HNO的比值式纳米荧光探针，其特征在于，所述纳米荧光探针由化合物P-BODIPY-R经两性聚合物包裹而制得；

[0013] 所述小分子化合物P-BODIPY-R结构通式如下：

[0014]

[0015] 其中R1、R2为引入的取代基（R1为具有给电子的胺基取代基团，R2为一般性不具有强推拉电子效应的基团），可调节荧光探针分子中的电子效应，使其响应HNO时荧光发生比值式变化。

[0016] 所述化合物HO-BODIPY-R具有如下所示结构：

[0017]

[0018] 其中R1、R2为引入的取代基（R1为具有给电子的胺基取代基团，R2为一般性不具有强推拉电子效应的基团），可调节荧光探针分子中的电子效应，使其响应HNO时荧光发生比值式变化。

[0019] 根据本发明所述比值式检测HNO的纳米荧光探针为纳米胶束，所述纳米胶束外层为两性聚合物，内部为化合物P-BODIPY-R。

[0020] 根据本发明所述比值式检测HNO的纳米荧光探针，所述小分子化合物识别基为三苯基膦甲酸酯结构。

[0021] 根据本发明所述比值式检测HNO的纳米荧光探针，所述聚合物具有亲水性和亲油性。

[0022] 根据本发明所述比值式检测HNO的纳米荧光探针，所述R1、R2均为引入的取代基，调节R基团(例如选取R1基团为具有给电子的胺基取代基团，R2为一般性不具有强推拉电子效应的基团)可使荧光探针在检测HNO时荧光发生比值式变化。

[0023] 本发明还提供一种所述比值式检测HNO的纳米荧光探针的制备方法，包括如下步骤：

[0024] (1) 以HO-BODIPY-R为原料经酯化反应得到P-BODIPY-R（调节R1基团(例如选取R1基团为具有给电子的胺基取代基团)，得到检测HNO 为比值式变化的小分子化合物）；

[0025] (2) 所述化合物P-BODIPY-R经两性聚合物包裹制得比值式检测HNO的纳米荧光探针。

[0026] 所述比值式检测HNO的纳米荧光探针的制备方法，所述聚合物具有亲水性和亲油性。

[0027] 所述比值式检测HNO的纳米荧光探针的制备方法与合成路线如下：

[0028]

[0029] (a) DPTS, DIPC；(b) 聚合物。

[0030] 本发明是HO-BODIPY-R和1，2-（二苯基膦基）苯甲酸经过酯化反应、包裹等过程，得到能比值式检测HNO的纳米荧光探针NanoP-BODIPY-R。

[0031] 本发明独创性是基于BODIPY母体，通过调节母体结构上的R1，R2基团电子效应，达到比值式检测HNO的目的，同时通过引入两性聚合物包裹，制备纳米胶束的形式，得到生物兼容性好、检测灵明度高、抗干扰能力强的纳米荧光探针NanoP-BODIPY-R。

[0032] 本发明还提供一种用于比值式检测HNO的化合物，其特征在于，所述化合物P-BODIPY-R的结构通式如下：

[0033]

[0034] 其中R1、R2为引入的取代基（R1为具有给电子的胺基取代基团，R2为一般性不具有强推拉电子效应的基团），可调节荧光探针分子中的电子效应，使其响应HNO时荧光发生比值式变化。

[0035] 本发明还提供一种所述用于比值式检测HNO的化合物的制备方法：

[0036] 制备步骤如下：

[0037] 以HO-BODIPY-R为原料与1，2-（二苯基膦基）苯甲酸经酯化反应得到P-BODIPY-R。

[0038] 本发明进一步提供一种所述比值式检测HNO的纳米荧光探针在检测细胞内HNO的应用。

[0039] 本发明进一步提供一种所述比值式检测HNO的纳米荧光探针在检测斑马鱼体内HNO的应用。

[0040] 本发明进一步提供一种所述比值式检测HNO的化合物在检测细胞内HNO的应用。

[0041] 本发明进一步提供一种所述比值式检测HNO的化合物在检测斑马鱼体内HNO的应用。

[0042] 本发明提供的比值式检测HNO的纳米荧光探针的详细制备方法：

[0043] 根据所述用于检测HNO的小分子化合物P-BODIPY-R，优选R1为吗啡啉结构，R2为苯基为例进行说明。

[0044] 制备步骤如下：

[0045] 以HO-BODIPY-N为原料经酯化反应得到P-BODIPY-N。

[0046] 所述化合物P-BODIPY-N的合成路线如下：

[0047]

[0048] (1)化合物P-BODIPY-N的合成

[0049] 取1，2-（二苯基膦基）苯甲酸溶于干燥的CH2Cl2中，室温搅拌至完全溶解，降温至0℃后，加入DPTS和DIPC，搅拌5min，再加入HO-BODIPY-N, 慢慢升温至室温，反应完后加入水洗涤，合并有机相，无水硫酸钠干燥，柱层析得橙红色固体。

[0050] (2)NanoP-BODIPY-R的制备

[0051] 取1ml的超纯水，将两性聚合物加入超声至澄清透明状，然后加入P-BODIPY-R超声约20min至澄清，滤膜过滤，即可制得用于检测HNO的纳米荧光探针。

[0052] 本发明提供用于检测HNO的化合物P-BODIPY-R，其结构通式如下：

[0053]

[0054] 其中R1、R2为引入的取代基，可以通过改变R1、R2得到具有特定功能的探针分子P-BODIPY-R，然后可利用两性聚合物包裹的方法改善水溶性，最后制得用于检测HNO的纳米荧光探针NanoP-BODIPY-N。

[0055] 术语：

[0056] Absorption为吸收值。

[0057] Fluoresence intensity为荧光强度。

[0058] BODIPY为氟硼二吡咯分子。

[0059] I568为568nm的荧光强度。

[0060] I601为601nm的荧光强度。

[0061] 有益技术效果：

[0062] 本发明提供一种比值式检测HNO的纳米荧光探针NanoP-BODIPY-R可用于检测细胞和斑马鱼体内活性小分子HNO，该探针克服了相关技术中存在的一些缺陷，如该类荧光探针利用三苯基膦结构作为识别基团，由于过多的苯环结构使得该类探针分子水溶性普遍较差。在本发明中，通过利用两亲性聚合物包裹探针小分子的方式，制备纳米胶束，得到纳米荧光探针NanoP-BODIPY-R, 从而大幅度提高了该类探针分子的水溶解性，解决了该类荧光探针分子水溶性差的问题；同时该荧光探针对HNO选择性比较好，克服了传统荧光探针在检测生物体内HNO时容易被生物体内还原性物质干扰的问题，该纳米荧光探针抗干扰能力更强，具有更高的灵敏性。同时，本发明所述的纳米荧光探针可以应用于对细胞和斑马鱼体内HNO的实时跟踪监测。

[0063] 本发明提供一种比值式检测HNO的化合物P-BODIPY-R，可用于比值式检测细胞和斑马鱼体内活性小分子HNO，化合物P-BODIPY-R对HNO选择性较好，抗干扰能力更强，具有更高的灵敏性。

附图说明

[0064] 图1是制备的纳米荧光探针NanoP-BODIPY-N尺寸表征图；

[0065] 图2(A)是纳米荧光探针NanoP-BODIPY-N在PBS 缓冲溶液（pH=7.4）中加入AS（HNO释放剂）前后的荧光发射光谱图；图2(B)为P-BODIPY-N在PBS 缓冲溶液（pH=7.4）中加入AS前后的荧光发射光谱图；

[0066] 图3是纳米荧光探针NanoP-BODIPY-N在PBS缓冲溶液（pH=7.4)中的干扰测试图；

[0067] 图4是纳米荧光探针NanoP-BODIPY-N在检测HepG2细胞中HNO的荧光成像效果图；图中（A-D）是空白对照组，图中（E-H）是纳米荧光探针NanoP-BODIPY-N与细胞内HNO作用后的效果图；

[0068] 图5是纳米荧光探针NanoP-BODIPY-N在检测斑马鱼体内的HNO的荧光成像效果图，图中（A-D）是空白对照组，图中（E-H）是纳米荧光探针NanoP-BODIPY-N与斑马鱼体内HNO作用后的效果图；

[0069] 图6是化合物P-BODIPY-N的氢谱，氘代试剂为d6-DMSO；

[0070] 图7是化合物P-BODIPY-N的高分辨率质谱HRMS (m/z)。

具体实施方式

[0071] 为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

[0072] 实施例：化合物P-BODIPY-N的合成

[0073] 取1，2-（二苯基膦基）苯甲酸溶于干燥的CH2Cl2中，室温搅拌至完全溶解，降温至0℃后，加入DPTS和DIPC，搅拌5min，再加入HO-BODIPY-N, 慢慢升温至室温，反应完后加入水洗涤，合并有机相，无水硫酸钠干燥，柱层析得橙红色固体。

[0074] 化合物P-BODIPY-N的氢谱（如图6），氘代试剂为d6-DMSO。

[0075] 1H NMR (d6-DMSO, 600 MHz): δ 8.27-8.25 (q, 1H), δ 7.60-7.58 (t, 2H), δ 7.54-7.53 (d, 2H), δ 7.42-7.38 (m, 10H), δ 7.22-7.19 (m,5H), δ 6.98-6.97 (d, 1H), δ 6.93-6.92 (d, 1H), δ 6.77-6.76 (d, 1H), δ 6.56-6.55 (m, 1H), δ 4.10 (s,1H), δ 3.82 (s, 1H).

[0076] 化合物P-BODIPY-N的高分辨率质谱HRMS  (m/z)(如图7)  :  Calcd  for C43H35BF2N3O3P: 720.2519,Found: 720.2506 [M - H]-.

[0077] 实施例：纳米荧光探针NanoP-BODIPY-N的制备

[0078] 取1ml的超纯水，将mPEG-DSPE加入超声至澄清透明状，然后加入P-BODIPY-N超声约20min至澄清，滤膜过滤，即可得检测HNO的比值式纳米荧光探针。

[0079] 效果例：

[0080] 参考图1是纳米荧光探针NanoP-BODIPY-N通过用DLS和TEM表征测得的尺寸。

[0081] 参考图2(A)是纳米荧光探针NanoP-BODIPY-N在PBS缓冲溶液（0.01mol/L, pH=7.4）中，在加入AS前后的的荧光发射光谱图，图2(B) 是化合物P-BODIPY-N在PBS缓冲溶液（0.01mol/L, pH=7.4）中，在加入AS前后的的荧光发射光谱图；由图中得出：纳米荧光探针NanoP-BODIPY-N和化合物P-BODIPY-N在加入AS前后荧光发射有很显著的红移，I601/I568的ratio值也有较大变化，说明NanoP-BODIPY-N和化合物P-BODIPY-N均能够对HNO进行检测。

[0082] 参考图3是纳米荧光探针NanoP-BODIPY-N在PBS缓冲溶液（pH=7.4)中的干扰测试图。由图可以看出NanoP-BODIPY-N对HNO选择性较好。

[0083] 参考图4是纳米荧光探针NanoP-BODIPY-N在HepG2细胞中成像效果图。图中（A-D）是NanoP-BODIPY-N在未加入AS的情况下细胞成像图，图中（E-H）是加入AS后，探针与细胞中HNO作用的成像效果图。

[0084] 参考图5是纳米荧光探针NanoP-BODIPY-N在斑马鱼中成像效果图，图中（A-D）是NanoP-BODIPY-N在未加入AS的情况下再斑马鱼体内成像图，图中（E-H）为加入AS后，探针与斑马鱼体内HNO作用的成像效果图。

[0085] 本发明所要求保护的纳米荧光探针经实验证明均具有类似上述效果例所述的功能，即本发明提供的检测HNO的纳米荧光探针和化合物P-BODIPY-N；

[0086] 其中示例化合物P-BODIPY-N结构式如下：

[0087]

[0088] 本发明提供一种比值式检测HNO的纳米荧光探针NanoP-BODIPY-R可用于检测细胞和斑马鱼体内活性小分子HNO，该探针克服了相关技术中存在的一些缺陷，如该类荧光探针利用三苯基膦结构作为识别基团，由于过多的苯环结构使得该类探针分子水溶性普遍较差。在本发明中，通过利用两亲性聚合物包裹探针小分子的方式，制备纳米胶束，得到纳米荧光探针NanoP-BODIPY-R, 从而大幅度提高了该类探针分子的水溶解性，解决了该类荧光探针分子水溶性差的问题；同时该荧光探针对HNO选择性比较好，克服了传统荧光探针在检测生物体内HNO时容易被生物体内还原性物质干扰的问题，该纳米荧光探针抗干扰能力更强，具有更高的灵敏性。同时，本发明所述的纳米荧光探针可以应用于对细胞和斑马鱼体内HNO的实时跟踪监测。

[0089] 本发明提供一种比值式检测HNO的化合物P-BODIPY-R，可用于比值式检测细胞和斑马鱼体内活性小分子HNO，化合物P-BODIPY-R对HNO选择性比较好，抗干扰能力更强，具有更高的灵敏性。

[0090] 以上显示描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的主要用途。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。