针对BCMA的单克隆抗体转让专利
申请号 : CN201680054839.0
文献号 : CN108350073B
文献日 : 2022-03-18
发明人 : M.D.武 , K.施特赖因 , O.阿斯特 , M.巴卡克 , C.德龙 , L.J.迪尔纳 , A.弗莱默泽-格伦肖贝尔 , C.克莱因 , E.默斯纳 , S.莫泽 , P.尤马纳 , T.魏因齐尔
申请人 : 英格玛布有限责任公司
摘要 :
权利要求 :
1.一种特异性结合至人B细胞成熟抗原(BCMA)的单克隆抗体,其中所述抗体包含:a) SEQ ID NO: 21的CDR1H、SEQ ID NO: 22的CDR2H、SEQ ID NO: 17的CDR3H、SEQ ID NO: 27的CDR1L、SEQ ID NO: 28的CDR2L和SEQ ID NO: 20的CDR3L;
b) SEQ ID NO: 21的CDR1H、SEQ ID NO: 22的CDR2H、SEQ ID NO: 17的CDR3H、SEQ ID NO: 23的CDR1L、SEQ ID NO: 24的CDR2L和SEQ ID NO: 20的CDR3L;或c) SEQ ID NO: 21的CDR1H、SEQ ID NO: 22的CDR2H、SEQ ID NO: 17的CDR3H、SEQ ID NO: 25的CDR1L、SEQ ID NO: 26的CDR2L和SEQ ID NO: 20的CDR3L。
2.根据权利要求1所述的抗体,其中所述抗体包含SEQ ID NO: 10的VH区和选自SEQ ID NO: 12、13和14的VL区。
3.一种特异性结合至BCMA和人CD3ɛ的双特异性抗体,其中BCMA结合结构域包含:a) SEQ ID NO: 21的CDR1H、SEQ ID NO: 22的CDR2H、SEQ ID NO: 17的CDR3H、SEQ ID NO: 27的CDR1L、SEQ ID NO: 28的CDR2L和SEQ ID NO: 20的CDR3L;
b) SEQ ID NO: 21的CDR1H、SEQ ID NO: 22的CDR2H、SEQ ID NO: 17的CDR3H、SEQ ID NO: 23的CDR1L、SEQ ID NO: 24的CDR2L和SEQ ID NO: 20的CDR3L;或c) SEQ ID NO: 21的CDR1H、SEQ ID NO: 22的CDR2H、SEQ ID NO: 17的CDR3H、SEQ ID NO: 25的CDR1L、SEQ ID NO: 26的CDR2L和SEQ ID NO: 20的CDR3L,并且其中CD3ɛ结合结构域包含SEQ ID NO: 1的CDR1H、SEQ ID NO: 2的CDR2H、SEQ ID NO: 3的CDR3H、SEQ ID NO: 4的CDR1L、SEQ ID NO: 5的CDR2L和SEQ ID NO: 6的CDR3L。
4.根据权利要求3所述的双特异性抗体,其中BCMA结合结构域包含SEQ ID NO: 10的VH区和SEQ ID NO: 12的VL区,或SEQ ID NO: 10的VH区和SEQ ID NO: 13的VL区,或SEQ ID NO: 10的VH区和SEQ ID NO: 14的VL区。
5.根据权利要求3或4所述的双特异性抗体,其中CD3ɛ结合结构域包含特异性结合至CD3ɛ的抗体的轻链和重链,并且其中
a) 特异性结合至CD3ɛ的抗体的轻链是包含可变结构域VH和恒定结构域CL或可变结构域VL和恒定结构域CH1的交叉轻链;和
b) 特异性结合至CD3ɛ的抗体的重链是包含可变结构域VL和恒定结构域CH1或可变结构域VH和恒定结构域CL的交叉重链。
6.一种特异性结合至BCMA和CD3ɛ的双特异性抗体,其中所述双特异性抗体包含:a) 包含第一抗体的第一轻链和第一重链的第一Fab,所述第一抗体为根据权利要求1或2所述的抗体;以及
b) 包含特异性结合至CD3ɛ的第二抗体的第二轻链和第二重链的第二Fab,其中所述第二轻链是包含可变结构域VH和恒定结构域CL的交叉轻链,和其中所述第二重链是包含可变结构域VL和恒定结构域CH1的交叉重链,并且其中在所述第一轻链的恒定结构域CL中,根据Kabat编号,位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代,并且在所述第一重链的恒定结构域CH1中,根据Kabat的EU索引编号,位置147处的氨基酸和位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代,
任选地其中所述双特异性抗体进一步包含第三Fab,其中所述第三Fab与所述第一Fab相同。
7.一种特异性结合至BCMA和CD3ɛ的双特异性抗体,其中所述双特异性抗体包含:a) 包含第一抗体的第一轻链和第一重链的第一Fab,所述第一抗体为根据权利要求1或2所述的抗体;以及
b) 包含特异性结合至CD3ɛ的第二抗体的第二轻链和第二重链的第二Fab,其中所述第二轻链是包含可变结构域VH和恒定结构域CL的交叉轻链,和其中所述第二重链是包含可变结构域VL和恒定结构域CH1的交叉重链,并且其中在所述第二轻链的恒定结构域CL中,根据Kabat编号,位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代,并且在所述第二重链的恒定结构域CH1中,根据Kabat的EU索引编号,位置147处的氨基酸和位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代。
8.根据权利要求3、4、6和7中任一项所述的双特异性抗体,其中所述双特异性抗体包含不超过一个抗CD3ɛ抗体部分的Fab、不超过两个抗BCMA抗体部分的Fab以及不超过一个Fc部分。
9.根据权利要求3、4、6和7中任一项所述的双特异性抗体,其中所述双特异性抗体包含Fc部分,所述Fc部分的N‑末端连接至所述CD3ɛ抗体Fab的C‑末端以及所述BCMA抗体Fab中的一者的C‑末端。
10.根据权利要求3、4、6和7中任一项所述的双特异性抗体,其中所述双特异性抗体包含所述抗BCMA抗体部分的第二Fab,其C‑末端连接至所述双特异性抗体的CD3ɛ抗体部分的N‑末端。
11.根据权利要求10所述的双特异性抗体,其中所述抗CD3ɛ抗体Fab的VL结构域连接至所述第二抗BCMA抗体Fab的CH1结构域。
12.一种特异性结合至BCMA和CD3ɛ的双特异性抗体,其中所述双特异性抗体包含选自以下的重链和轻链组:
i) SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 50和两个拷贝的SEQ ID NO: 51,ii) SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 53和两个拷贝的SEQ ID NO: 54,或者
iii) SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56和两个拷贝的SEQ ID NO: 57。
13.一种用于制备根据权利要求1至12中任一项所述的抗体的方法,其包括以下步骤:a) 使用包含编码根据权利要求1至12中任一项所述的抗体的轻链和重链的核酸分子的载体转化宿主细胞,
b) 在允许合成所述抗体分子的条件下培养所述宿主细胞;以及c) 从所述培养物回收所述抗体分子。
14.一种包含根据权利要求1至12中任一项所述的抗体和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
15.一种包含根据权利要求1至12中任一项所述的抗体的药物组合物,其用作药剂。
16.一种包含根据权利要求1至12中任一项所述的抗体的药物组合物,其用作治疗浆细胞病症的药剂。
17.一种包含根据权利要求1至12中任一项所述的抗体的药物组合物,其用作治疗多发性骨髓瘤、系统性红斑狼疮、浆细胞白血病或AL‑淀粉样变性的药剂。
18.一种宿主细胞,其包含载体,所述载体包含编码根据权利要求1至12中任一项所述的抗体的核酸分子。
说明书 :
针对BCMA的单克隆抗体
1998年)。BCMA是非糖基化的III型跨膜蛋白,它参与B细胞成熟、生长和存活。BCMA是TNF超
家族的两个配体的受体:APRIL(增殖诱导配体),其为BCMA的高亲和力配体,以及B细胞活化
因子BAFF,其为BCMA的低亲和力配体(THANK、BlyS、B淋巴细胞刺激因子、TALL‑1和zTNF4)。
APRIL和BAFF显示出结构相似性和重叠但不同的受体结合特异性。负调节因子TACI也结合
至BAFF和APRIL两者。APRIL和BAFF与BCMA和/或TACI的协同结合活化转录因子NF‑κB,且增
加促存活Bcl‑2家族成员(如Bcl‑2、Bcl‑xL、Bcl‑w、Mcl‑1、A1)的表达和促凋亡因子(如Bid、
Bad、Bik、Bim等)的下调,从而抑制凋亡和促进存活。该组合作用促进B细胞分化、增殖、存活
和抗体产生(如Rickert RC等人,Immunol Rev(2011)244(1):115‑133所综述)。
其用于治疗淋巴瘤和多发性骨髓瘤的用途例如在WO2002066516和WO2010104949中有所提
及。WO2013154760和WO2015052538涉及包含BCMA识别部分和T细胞活化部分的嵌合抗原受
体(CAR)。Ryan,MC等人,Mol.Cancer Ther.6(2007)3009‑3018涉及具有配体阻断活性的抗
BCMA抗体,其可以促进多发性骨髓瘤(MM)细胞系作为裸抗体或作为抗体‑药物缀合物的细
胞毒性。Ryan示出,SG1(抑制性BCMA抗体)在体外以剂量依赖性方式阻断核因子‑κB的APRIL
依赖性活化。Ryan还提及了并不显著抑制APRIL与BCMA结合的抗体SG2。
WO2009080252中描述了其中可变结构域VL和VH或恒定结构域CL和CH1彼此替代的双特异性
抗体。
有短侧链的氨基酸替代以形成“孔”。相反,将具有大侧链的氨基酸引入另一个CH3结构域中
形成“钮”。通过共表达这两条重链(和两条相同的轻链,其必须适合于两条重链),观察到异
二聚体形成(“钮‑孔”)相对于同二聚体形成(“孔‑孔”或“钮‑钮”)的高产率(Ridgway JB,
Presta LG,CarterP.Protein Eng.9,617–621(1996);以及WO1996027011)。通过使用噬菌
体展示方法来重建两个CH3结构域的相互作用表面并引入二硫桥以稳定异二聚体,可以进
一步提高异二聚体的百分比(Merchant A.M.等人,Nature Biotech 16(1998)677‑681;Aτ
well S,Ridgway JB,Wells JA,CarterP.,JMol.Biol 270(1997)26‑35)。用于钮入孔技术
的新方法在例如EP1870459A1中有所描述。虽然该形式看起来非常有吸引力,但目前没有描
述临床进展的数据可用。该策略的一个重要限制是两个亲本抗体的轻链必须相同以防止错
配和形成无活性的分子。由于这些抗体的重链和/或相同的轻链必须优化,因此该技术不适
于从针对第一和第二靶标的两个抗体开始,轻松地开发针对两个靶标的重组双特异性抗
体。Xie,Z.等人,J Immunol.Methods 286(2005)95‑101涉及双特异性抗体形式,其使用
scFv与用于FC部分的钮入孔技术的组合。
(γ)/德耳塔(δ)异二聚体组成。根据UniProt P07766(CD3E_HUMAN)描述了人CD3ε。
术中描述的另一种抗CD3抗体是UCHT‑1(参见WO2000041474)。现有技术中描述的另一种抗
CD3抗体是BC‑3(Fred Hutchinson Cancer Research Institute;用于GvHD的I/II期试验,
Anasetti等人,Transplantation 54:844(1992))。SP34与UCHT‑1和BC‑3的不同之处在于
SP‑34识别仅存在于CD3的ε链上的表位(参见Salmeron等人,(1991)J.Immunol.147:3047),
而UCHT‑1和BC‑3识别由ε和γ链提供的表位。另外的抗CD3抗体在WO2008119565、
WO2008119566、WO2008119567、WO2010037836、WO2010037837、WO2010037838和US8236308
(WO2007042261)中有所描述。另一种抗CD3抗体的CDR、VH和VL序列显示于SEQ ID NO:7和8
中。
WO2014140248中有所提及。
176‑180和US6602684所述。WO1999054342、WO2004065540、WO2007031875和WO2007039818、
Hristodorov D,Fischer R,Linden L.,Mol Biotechnol.2012年10月25日(Epub)还涉及增
强Fc介导的细胞细胞毒性的抗体的糖基化工程化。
Immunology,65,88(1997)]Chemical Immunology,65,88(1997)]。因此,此类氨基酸的修饰
可以增强细胞介导的效应子功能。此类增加细胞介导的效应子功能的抗体修饰在
EP1931709、WO200042072中有所提及,并且在Fc部分中包括在氨基酸位置234、235、236、
239、267、268、293、295、324、327、328、330和332处的取代。另外的增加细胞介导的效应子功
能的抗体修饰在EP1697415中有所提及,并且包括EU氨基酸位置277、289、306、344或378被
带电氨基酸、极性氨基酸或非极性氨基酸的氨基酸替代。
(WO2003048209)、聚环氧烷修饰的scFv(US7150872)、人源化兔抗体(WO2005016950)、合成
免疫球蛋白结构域(WO2006072620)、共价双抗体(WO2006113665)、柔性体(flexibody)
(WO2003025018)、结构域抗体dAb(WO2004058822)、疫苗体(vaccibody)(WO2004076489)、具
有新世界灵长类框架的抗体(WO2007019620)、具有可切割接头的抗体‑药物缀合物
(WO2009117531)、移除铰链区的IgG4抗体(WO2010063785)、具有IgG4样CH3结构域的双特异
性抗体(WO2008119353)、骆驼科抗体(US6838254)、纳米体(nanobody)(US7655759)、CAT双
抗体(US5837242)、针对靶抗原和CD3的双特异性(scFv)2(US7235641)、sIgA植物体
(plAntibody)(US6303341)、微体(minibody)(US5837821)、IgNAR(US2009148438)、具有修
饰铰链和Fc区的抗体(US2008227958、US20080181890)、三功能抗体(US5273743)、三功能单
抗(triomab)(US6551592)、特洛伊体(troybody)(US6294654)。
中以405nm下的OD所测量,与单独的APRIL相比,所述抗体改变APRIL依赖性NF‑κB活化不超
过20%,并且与无所述抗体的情况下相比,所述抗体改变无APRIL的NF‑κB活化不超过20%。
WO2014122144公开了特异性结合至两个靶标人CD3ε和人BCMA的双特异性抗体,其包含
WO2014122143的抗人BCMA抗体。具有独特性质,尤其是关于作为双特异性T细胞结合物的治
疗用途的抗人BCMA抗体是抗体83A10,其特征在于包含还在WO2014122143和WO2014122144
中公开的作为CDR区的SEQ ID NO:15的CDR1H、SEQ ID NO:16的CDR2H、SEQ ID NO:17的
CDR3H、SEQ ID NO:18的CDR1L、SEQ ID NO:19的CDR3L和SEQ ID NO:20的CDR3L。
发明内容
有效的优点。
a)SEQ ID NO:21的CDR1H区和SEQ ID NO:22的CDR2H区、SEQ ID NO:23的CDR1L区和SEQ ID
NO:24的CDR2L区,
括SEQ ID NO:20的CDR3L区和选自以下组的CDR1L和CDR2L区组合:a)SEQ ID NO:23的CDR1L
区和SEQ ID NO:24的CDR2L区,b)SEQ ID NO:25的CDR1L区和SEQ ID NO:26的CDR2L区,或c)
SEQ ID NO:27的CDR1L区和SEQ ID NO:28的CDR2L区。
组氨酸(H)组成的组。在一个实施方案中,氨基酸49是SEQ ID NO:12中的E、SEQ ID NO:13中
的S或SEQ ID NO:14中的H。
酸74是SEQ ID NO:14中的A。
区,其包括SEQ ID NO:17的CDR3H区,以及VL区,其包括SEQ ID NO:31的CDR1L区、SEQ ID
NO:32的CDR2L区和SEQ ID NO:20的CDR3L区和选自以下组的CDR1L和CDR2L区的组合:
的抗体,其特征在于包含VL区SEQ ID NO:12,其中氨基酸49选自以下组的氨基酸:酪氨酸
(Y)、谷氨酸(E)、丝氨酸(S)和组氨酸(H)。在一个实施方案中,氨基酸49是E。
包含作为VL区的选自由以下组成的组的VL区:SEQ ID NO:12、13和14的VL区。在一个实施方
案中,本发明提供了根据本发明的抗体,其特征在于包含作为VH区的SEQ ID NO:10的VH区
和作为VL区的SEQ ID NO:12的VL区。在一个实施方案中,本发明提供了根据本发明的抗体,
其特征在于包含作为VH区的SEQ ID NO:10的VH区和作为VL区的SEQ ID NO:13的VL区。在一
个实施方案中,本发明提供了根据本发明的抗体,其特征在于包含作为VH区的SEQ ID NO:
10的VH区和作为VL区的SEQ ID NO:14的VL区。
根据本发明的抗体,其特征在于包含作为VH区的SEQ ID NO:38的VH区和作为VL区的SEQ ID
NO:12的VL区。在一个实施方案中,本发明提供了根据本发明的抗体,其特征在于包含作为
VH区的SEQ ID NO:39的VH区和作为VL区的SEQ ID NO:12的VL区。在一个实施方案中,本发
明提供了根据本发明的抗体,其特征在于包含作为VH区的SEQ ID NO:40的VH区和作为VL区
的SEQ ID NO:12的VL区。
1.5和5或1.5和10或1.5和16之间(表5)。
的食蟹猴/人差距在1.25和5之间或在0.8和1.0之间。
T细胞接合体、双抗体或串联scFv、抗体模拟物诸如DAPPin、裸单特异性抗体或抗体药物缀
合物。在一个实施方案中,多特异性抗体、双特异性抗体、双特异性T细胞接合体、双抗体或
串联scFv特异性结合至BCMA和CD3。
部分的其它靶标(参见例如上文“发明背景”)、单链可变片段(scFv)诸如双特异性T细胞接
合体、双抗体、串联scFv和抗体模拟物诸如DARPin,它们也都是本发明的实施方案。双特异
性抗体形式是现有技术领域熟知的,例如还在Kontermann RE,mAbs 4:21‑16(2012);
Holliger P.,Hudson PJ,Nature Biotech.23(2005)1126‑1136和Chan AC,Carter PJ
Nature Reviews Immunology 10,301‑316(2010)和Cuesta AM等人,Trends Biotech 28
(2011)355‑362中有所描述。
的根据本发明的抗BCMA抗体。
的CDR1H、CDR2H、CDR1L和CDR2L区的组合:
ID NO:22的CDR2H区和SEQ ID NO:17的CDR3H区,以及VL区(进一步也称为“BCMA VL”),其含
有SEQ ID NO:20的CDR3L区和选自以下组的CDR1L和CDR2L区的组合:
供了根据本发明的抗体,其特征在于包含作为BCMAVH区的SEQ ID NO:10的VH区和作为VL区
的SEQ ID NO:12的VL区。在一个实施方案中,本发明提供了根据本发明的抗体,其特征在于
包含作为BCMAVH的SEQ ID NO:10的VH区和作为VL区的SEQ ID NO:13的VL区。在一个实施方
案中,本发明提供了根据本发明的抗体,其特征在于包含作为BCMAVH的SEQ ID NO:10的VH
区和作为VL区的SEQ ID NO:14的VL区。
氨酸(E)、丝氨酸(S)和组氨酸(H)。在一个实施方案中,氨基酸49是E(SEQ ID NO:12)、S(SEQ
ID NO:13)或H(SEQ ID NO:14)。本发明提供了根据本发明的双特异性抗体,其特征在于包
含的VL区,其选自由以下组成的组:SEQ ID NO:12、13和14的VL区,其中氨基酸74是苏氨酸
(T)或丙氨酸(A)。在一个实施方案中,氨基酸74是SEQ ID NO:14中的A。
区和SEQ ID NO:20的CDR3L区和选自以下组的CDR1L和CDR2L区的组合:
抗体部分的CH1或CL结构域。
在一个实施方案中,将抗CD3抗体部分的不超过一个Fab片段和抗BCMA抗体部分的不超过一
个Fab片段连接至Fc部分,并且通过Fab片段的C‑末端结合至连接至铰链区是优选的。在一
个实施方案中,抗BCMA抗体部分的第二Fab片段通过其C‑末端连接至抗CD3抗体部分的Fab
片段的N‑末端或连接至Fc部分的铰链区因此在Fc部分和抗CD3抗体部分之间。图1至3示出
了优选的双特异性抗体。
意指Fab CD3片段通过其N‑末端结合至Fab BCMA片段的C‑末端。“Fab BCMA‑Fab CD3”意指
Fab BCMA片段通过其N‑末端结合至Fab CD3片段的C‑末端。
CD3抗体部分的VL结构域连接至所述第二抗BCMA抗体的CH1或CL结构域。
体部分的C‑末端。在一个实施方案中,所述抗CD3抗体部分的CH1结构域连接至所述第二抗
BCMA抗体部分的VH结构域。
连接至所述CD3抗体Fab片段的C‑末端,以及所述抗BCMA抗体的第二Fab片段,其通过其C‑末
端连接至Fc部分的第二N‑末端。在一个实施方案中,CD3抗体Fab片段的CL结构域连接至Fc
部分的铰链区。在一个实施方案中,BCMA抗体Fab片段的CH1结构域连接至Fc部分的铰链区。
Mack M.等人,PNAS,1995年7月18日,第92卷,第15期,7021‑7025)。根据本发明,“化学连接”
(或“连接”)意指片段通过共价结合连接。由于接头是肽接头,此类共价结合通常通过生物
化学重组手段,使用编码各自Fab片段的VL和/或VH结构域的核酸、接头和(如果合适的话)
Fc部分链进行。
CDR,分别为重链CDR1H、CDR2H和CDR3H,并且抗CD3抗体部分的可变结构域VL(也称为
“CD3VL”)包含SEQ ID NO:4、5和6的轻链CDR,分别为轻链CDR1L、CDR2L和CDR3L。
域CL和CH1彼此替代。
抗体部分的CH1或CL结构域。
分或抗BCMA抗体部分的恒定结构域CL,其中位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或
组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号),并且在各自恒定结构域CH1中,位置147处的氨基
酸和位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代。在一个实施方案中,抗体
对于CD3结合是单价的。在一个实施方案中,除了在恒定结构域CL中位置124处的氨基酸替
代之外,位置123处的氨基酸也被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(进一步称
为“电荷变体交换”)。在一个实施方案中,抗体对于CD3结合是单价的,并且氨基酸124是K,
氨基酸147是E,氨基酸213是E,且氨基酸123是R。在一个实施方案中,双特异性抗体另外还
包含相同的抗BCMA结合部分(在一个实施方案中是Fab片段)。这也意味着,如果第一抗BCMA
结合部分包含电荷变体交换,则第二抗BCMA结合部分也包含相同的电荷变体交换。(所有氨
基酸根据Kabat编号)。
域CH1中,位置147处的氨基酸和位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取
代(根据Kabat编号)(参见例如图1A、2A、2C、3A、3C)。
中,所述BCMA‑Fab位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根
据Kabat编号),并且其中在所述BCMA‑Fab的恒定结构域CH1中,位置147处的氨基酸和位置
213处的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据Kabat编号)(参见例如图2A、
2C)。
域CH1中,位置147处的氨基酸和位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取
代(根据Kabat编号)。
施方案中,另外在恒定结构域CL中,位置123处的氨基酸被精氨酸(R)取代。
Fab片段(进一步也称为“BCMA‑Fab”)以及Fc部分组成,其中CD3‑Fab和BCMA‑Fab通过其C‑末
端连接到所述Fc部分的铰链区。CD3‑Fab或BCMA‑Fab包含氨基酸取代,且CD3‑Fab包含交叉
(图1A和1B)。
接至所述Fc部分的铰链区,第二BCMA‑Fab通过其C‑末端连接至CD3‑Fab的N‑末端。CD3‑Fab
包含交叉,并且CD3‑Fab或两个BCMA‑Fab都包含氨基酸取代(图2A和2B)。特别优选的是包含
BCMA‑Fab‑Fc‑CD3‑Fab‑BCMA‑Fab的双特异性抗体,其中两个BCMA‑Fab都包含氨基酸取代,
并且CD3‑Fab包含VL/VH交叉(图2A)。特别优选的是包含由BCMA‑Fab‑Fc‑CD3‑Fab‑BCMA‑Fab
组成的双特异性抗体,其中两个BCMA‑Fab都包含氨基酸取代Q124K、E123R、K147E和K213E,
并且CD3‑Fab包含VL/VH交叉。特别优选的是,两个BCMA‑Fab都包含作为CDR的抗体21、22或
42的CDR,或作为VH/VL的抗体21、22或42的VH/VL。
第二BCMA‑Fab通过其C‑末端连接至CD3‑Fab的N‑末端。CD3‑Fab包含交叉,并且CD3‑Fab或两
个BCMA‑Fab都包含氨基酸取代(图2A和2B)。
CD3‑Fab通过其C‑末端连接至一个BCMA‑Fab的N‑末端。CD3‑Fab包含交叉,并且CD3‑Fab或两
个BCMA‑Fab都包含氨基酸取代(图2C和2D)。
CD3‑Fab的N‑末端。CD3‑Fab包含交叉,并且CD3‑Fab或BCMA‑Fab包含氨基酸取代(图1A和
1B)。
CD3‑Fab的N‑末端。CD3‑Fab包含交叉,并且CD3‑Fab或BCMA‑Fab包含氨基酸取代(图3A和
3B)。
BCMA‑Fab的N‑末端。CD3‑Fab包含交叉,并且CD3‑Fab或BCMA‑Fab包含氨基酸取代(图3C和
3D)。
Mack M.等人,PNAS,1995年7月18日,第92卷,第15期,7021‑7025)。两个Fab片段之间的键联
在重链之间进行。因此,第一Fab片段的CH1的C‑末端连接至第二Fab片段的VH的N‑末端(无
交叉)或VL的N‑末端(交叉)。Fab片段和Fc部分之间键联根据本发明进行,作为CH1和CH2之
间的键联。
CH1和CL中是相同的。在一个实施方案中,特异性结合至BCMA的抗体的第一和第二Fab片段
的氨基酸序列是相同的。在一个实施方案中,BCMA抗体是包含抗体21、22或42的CDR序列的
抗体、包含抗体21、22或42的VH和VL序列的抗体或包含抗体21、22或42的VH、VL、CH1和CL序
列的抗体。
中为人Fc部分。在一个实施方案中,抗BCMA抗体的第二Fab片段通过其C‑末端连接至抗CD3
抗体的Fab片段的N‑末端或连接至Fc部分的铰链区。在一个实施方案中,在BCMA‑Fab的CH1
和CD3‑Fab的VL之间进行键联(VL/VH交叉)。
CDR2和CDR3和可变结构域VL,其包括SEQ ID NO:4、5和6的轻链CDR,分别为抗CD3ε抗体的轻
链CDR1、CDR2和CDR3(CDR MAB CD3)。在一个实施方案中,特异性结合至人CD3的抗体部分的
特征在于可变结构域是SEQ ID NO:7和8的(VHVLMAB CD3)。
中所述界面被改变以促进双特异性抗体的形成,其中所述改变的特征在于:
大侧链体积的氨基酸残基,从而在一条重链的CH3结构域的界面内产生突起,该突起可定位
于另一条重链的CH3结构域的界面内的空腔中,
氨基酸残基,从而在第二CH3结构域的界面内产生空腔,第一CH3结构域的界面内的突起可
定位于该空腔中。
替代。
度下24小时后通过ADCC诱导表达BCMA的制备细胞的20%或更多的细胞死亡。在一个实施方
案中,此类抗体是裸抗体。
结构域组成。优选地,CD3ζ结构域通过间隔子与所述VL结构域的C‑末端连接,并且VL结构域
的N‑末端通过间隔子与所述VH结构域的C‑末端连接。BCMA抗体的嵌合抗原受体、可用的跨
膜结构域和内结构域及其产生方法在例如Ramadoss NS.等人,J.Am.Chem.Soc.J.,DOI:
10.1021/jacs.5b01876(2015),Carpenter RO等人,Clin.Cancer.Res.DOI:10.1158/1078‑
0432.CCR‑12‑2422(2013),WO2015052538和WO2013154760中有所描述。
段),作为具有和不具有Fc部分的结合至BCMA和CD3的双特异性抗体,作为所述形式(尤其是
2+1形式)的双特异性抗体,以及具有本文所述(尤其是表1A所述)的重链和轻链的双特异性
抗体。
髓瘤MM骨髓抽吸物中的人恶性浆细胞消耗至至少80%,其特征在于使用1‑50nM食蟹猴BCMA
在1‑3轮内淘选抗体83A10的可变重链(VH)和可变轻链(VL)噬菌体展示文库(VH文库、VL文
库),并选择具有诸如此类双特异性T细胞结合物的性质的可变轻链和可变重链。优选地,进
行3轮淘选:第1轮使用50nM食蟹猴BCMA,第2轮使用25nM cyBCMA,第3轮使用10nM cyBCMA。
优选地,文库在轻链CDR1和CDR2或重链CDR1和CDR2中随机化。优选地,鉴定轻链和重链,其
各自作为Fab片段(还包含抗体83A10的相应VH或VL)结合至huBCMA(Kd为50pM至5nM)和食蟹
猴BCMA(Kd为0.1nM至20nM)。优选地,双特异性形是图2A的形式,其包含CD3Fab的各自恒定
结构域VL和VH的彼此替代,以及CH1结构域中两个BCMA Fab内的氨基酸交换K213E和K147E
和CL结构域中的氨基酸交换E123R和Q124K。
至第一靶标的抗体的轻链和重链的核酸分子的载体,以及包含编码特异性结合至第二靶标
的抗体的轻链和重链的核酸分子的载体,其中可变结构域VL和VH或恒定结构域CL和CH1彼
此替代。
合物、多特异性抗体或双特异性抗体。
在骨髓隔室中的单克隆扩增和积累。MM还涉及循环具有相同IgG基因重排和体细胞超突变
的克隆浆细胞。MM由称为意义未明的单克隆丙种球蛋白血症(MGUS)的无症状、恶化前的疾
患引起,其特征在于低水平的骨髓浆细胞和单克隆蛋白。MM细胞以低速率增殖。MM是多发性
染色体结构改变(例如,不平衡易位)逐渐发生的结果。MM涉及恶性浆细胞和骨髓微环境(例
如,正常骨髓基质细胞)的相互作用。活性MM的临床体征包括单克隆抗体突增、浆细胞挤满
骨髓、溶解性骨病灶以及由过度刺激破骨细胞而引起的骨破坏(Dimopulos&Terpos,Ann
Oncol 2010;21,增补7:vii143‑150)。另一种涉及浆细胞即表达BCMA的浆细胞病症是全身
性红斑狼疮(SLE),也称为狼疮。SLE是全身性自体免疫性疾病,可以影响身体的任何部分,
表现为免疫系统攻击身体自身的细胞和组织,导致慢性炎症和组织损伤。它是III型过敏反
应,其中抗体‑免疫复合物沉淀并引起另外的免疫应答(Inaki&Lee,Nat Rev Rheumatol
2010;6:326‑337)。另外的浆细胞病症是浆细胞白血病和AL‑淀粉样变性(还可参见实施例
19和20)。在所有这些浆细胞病症中,根据本发明的抗体对浆细胞/恶性浆细胞的消耗预期
对患有此类疾病的患者是有益的。
AMR的特征在于在几天内发生的移植物功能异常,并且是移植后产生的预成的或从头的供
体特异性抗体的结果。它出现在所有肾脏移植物的约5‑7%中,并引起预敏化阳性交叉配型
患者中20‑48%的急性排斥事件(Colvin和Smith,Nature Rev Immunol 2005;5(10):807‑
817)。急性AMR患者的组织病理学通常表现为内皮细胞肿胀、肾小球和肾小管周毛细血管的
中性粒细胞浸润、纤维蛋白血栓、间质水肿和溢血(Trpkov等人,Transplantation 1996;61
(11):1586‑1592)。AMR可以通过C4d染色或其它改进的抗体检测方法在同种异体移植活检
中鉴定。另一种AMR形式也称为慢性同种异体移植损伤,其还涉及供体特异性抗体,但在移
植后数月甚至数年内表现。它在肾活检上被认为是移植肾小球病(也称为慢性同种异体移
植肾小球病),并且其特征在于肾小球系膜扩张和毛细血管基底膜复制(Regele等人,JAm
Soc Nephrol 2002;13(9):2371‑2380)。临床表现有所不同,从患者早期无症状到晚期患有
肾病范围蛋白尿、高血压和同种异体移植物功能异常。疾病进展相当迅速,尤其是进行中的
急性AMR,在几个月内会导致移植物衰竭(Fotheringham等人Nephron–Clin Pract2009;113
(1):c1‑c7)。在患者活检中移植肾小球病的流行率在1年的5%至5年的20%之间变化
(Cosio等人,Am JTransplant2008;8:292‑296)。
2 2
2.5,优选地至25mg/m/周,优选地至250mg/m/周的剂量范围内)。由于本发明的抗体的优异
细胞毒性活性,与非T细胞双特异性(即不结合至一个臂上的CD3)的常规单特异性抗体或常
规双特异性抗体相比,其可以至少以相同的临床剂量范围程度(或甚至更低)施用。设想对
2
于根据本发明的抗体,在临床背景中皮下施用是优选的(例如在0.1‑250mg/m/周的剂量范
围内)。此外,在血清APRIL和BAFF水平高的患者(例如多发性骨髓瘤患者)中,可能不需要增
加根据本发明的抗体的剂量,因为它可能不受配体竞争的影响。相反,在这些患者中其它配
体阻断/竞争抗BCMA抗体的剂量可能需要增加。根据本发明的抗体的另一个优点是消除半
衰期为约4至12天,其允许至少一次或两次/周的施用。
施用来治疗(例如在200‑2000mg/m/周范围内的剂量,持续4周)。设想对于根据本发明的抗
体,在临床背景中皮下施用是可能的和优选的(例如,取决于疾病适应症,在200‑2000mg/
2
m/周的剂量范围内)。此外,在血清APRIL和BAFF水平高的患者(例如多发性骨髓瘤患者)
中,可能不需要增加根据本发明的抗体(例如非配体阻断/竞争抗体)的剂量,因为它可能不
受配体竞争的影响。相反,在这些患者中其它配体阻断/竞争抗BCMA抗体的剂量可能需要增
加,使得皮下施用在技术上更具挑战性(例如药物)。根据本发明的抗体的另一个优点基于
包含Fc部分,其与4至12天的消除半衰期相关,并且允许至少一次或两次/周的施用。
氨基酸取代引入CL‑CH1中,以减少产生中的LC错配/副产物。Fab CD3包含VL‑VH交叉以减少
LC错配和副产物。
Fab CD3(RK/EE)‑Fab BCMA;(C)Fab BCMA(RK/EE)‑Fc‑Fab BCMA(RK/EE)‑Fab CD3;(D)Fab
BCMA‑Fc‑Fab BCMA‑Fab CD3(RK/EE)。将RK/EE的氨基酸取代引入CL‑CH1中,以减少制备中
的LC错配/副产物。优选地,Fab CD3包含VL‑VH交叉以减少LC错配和副产物。优选地,Fab
CD3和Fab BCMA使用柔性接头彼此连接。
Fab BCMA(RK/EE)‑Fab CD3;(D)Fc‑Fab BCMA‑Fab CD3(RK/EE)。优选地,Fab CD3包含VL‑VH
交叉以减少LC错配和副产物。Fab CD3和Fab BCMA使用柔性接头彼此连接。
TCBcv(实心三角形)、42‑TCBcv(实心正方形)诱导的H929MM细胞裂解的浓度响应曲线。所有
抗BCMA/抗CD3 T细胞双特异性抗体对H929细胞具有浓度依赖性杀死,而对照TCB则未观察
到杀死。使用10个PBMC与1个MM细胞的效应子细胞与肿瘤靶细胞(E:T)比率,通过PBMC供体1
(A)、供体3(B)、供体4(C)、供体5(D)进行实验(参见实施例8)。
(实心三角形)、42‑TCBcv(实心正方形)诱导的L363MM细胞裂解的浓度响应曲线。观察到所
有抗BCMA/抗CD3 T细胞双特异性抗体对L363细胞具有浓度依赖性杀死,而对照TCB则未观
察到杀死。使用10个PBMC与1个MM细胞的E:T比率,通过PBMC供体1(A)、供体2(B)、供体3(C)、
供体4(D)、供体5(E)进行实验(参见实施例9)。
圆)、22‑TCBcv(实心三角形)、42‑TCBcv(实心正方形)诱导的RPMI‑8226MM细胞裂解的浓度
响应曲线。观察到所有抗BCMA/抗CD3 T细胞双特异性抗体对RPMI‑8226细胞具有浓度依赖
性杀死,而对照TCB则未观察到杀死。使用10个PBMC与1个MM细胞的E:T比率,通过PBMC供体2
(A)、供体3(B)、供体4(C)、供体5(D)进行实验(参见实施例10)。
42‑TCBcv(实心正方形)诱导的对JJN‑3MM细胞的浓度依赖性杀死。测定膜联蛋白‑V阳性
JJN‑3细胞(A、C)和肿瘤细胞溶解(B、D)的百分比并作图。由特定浓度的抗BCMA/抗CD3 T细
胞双特异性抗体诱导的JJN‑3细胞的裂解百分比的确定如下:从无TCB的膜联蛋白‑V阴性
JJN‑3细胞的绝对计数中减去给定TCB浓度下膜联蛋白‑V阴性JJN‑3细胞的绝对计数;除以
无TCB的膜联蛋白‑V阴性JJN‑3细胞的绝对计数。使用10个PBMC与1个MM细胞的E:T比率,通
过2个PBMC供体:供体1(A、B)和供体2(C、D)进行实验(参见实施例11)。
细胞的重导向T细胞裂解。测定膜联蛋白‑V阳性骨髓瘤浆细胞的百分比并对TCB浓度作图。
根据8色多参数方案,观察到患者骨髓瘤浆细胞的浓度依赖性和特异性裂解,而未观察到T
细胞、B细胞和NK细胞的裂解。在测试TCB抗体的最高浓度下,对照TCB未诱导骨髓瘤浆细胞
的细胞死亡。与83A10‑TCBcv(A)相比,42‑TCBcv(B)和22‑TCBcv(C)更强效地诱导患者骨髓
瘤浆细胞的杀死(参见实施例13)。
重导向T细胞裂解。测定膜联蛋白‑V阴性骨髓瘤浆细胞的百分比并对TCB浓度作图。观察到
患者骨髓瘤浆细胞的浓度依赖性和特异性裂解,而未观察到非恶性骨髓细胞的裂解(数据
未示出)。在测试TCB抗体的最高浓度下,观察到对照TCB未诱导骨髓瘤浆细胞的细胞死亡
(数据未示出)。与83A10‑TCBcv相比,42‑TCBcv和22‑TCBcv更强效地诱导患者骨髓瘤浆细胞
的杀死,如存活的(膜联蛋白‑V阴性)骨髓瘤浆细胞的浓度依赖性减少所反映。患者001(A)
和患者007(B)中的代表性实验(参见实施例13)。
碘化丙啶阴性骨髓瘤浆细胞的百分比,并且将存活的骨髓浆细胞相对于培养基对照(MC)的
百分比对TCB浓度作图。观察到患者骨髓瘤浆细胞的浓度依赖性和特异性裂解(A‑G),而未
观察到骨髓微环境(BMME)的裂解(H)。在测试TCB抗体的最高浓度下,观察到对照TCB未诱导
骨髓瘤浆细胞的细胞死亡。与83A10‑TCBcv相比,42‑TCBcv和22‑TCBcv更强效地诱导患者骨
髓瘤浆细胞的杀死,如存活的(碘化丙啶阴性)骨髓瘤浆细胞的浓度依赖性减少所反映。如
果对应的统计检验的P‑值<5%(*)、<1%(**)或<0.1%(***),则认为效应具有统计学显著
性。使用从患者1(A)、患者2(B)、患者3(C)、患者4(D)、患者5(E)、患者6(F)和患者7(G、H)收
集的骨髓抽吸物样品进行实验(参见实施例13)。
的活化。比较83A10‑TCBcv(A)、42‑TCBcv(B)和22‑TCBcv(C)中T细胞活化的程度(参见实施
例14)。
度。在给药前和给药后30、90、180分钟、7、24、48、96、168、336、504小时进行血清样品收集。
在给药前和给药后96和336小时收集骨髓样品(参见实施例16)。
TCBcv的IV注射。将绝对血液T细胞计数(每μL血液的CD2+细胞)对治疗后时间作图(参见实
施例16)。
百分比并绘制于等值线图(A)中。绘制使用83A10‑TCBcv 0.3mg/kg处理后食蟹猴中血浆细
胞消耗的动力学(B)(参见实施例16)。
Shi‑scidIL2rγ(空)(NOG)接受人多发性骨髓瘤H929细胞皮下(SC)注射到右背侧。在第15
天(d15),NOG小鼠接受单次腹膜内(IP)注射人PBMC。然后将小鼠仔细地随机分配到不同的
处理组和对照组(n=9/组),并进行统计检验以测试组间的同质性。实验组为对照未处理
组、对照TCB处理组、83A10‑TCBcv 2.6nM/kg处理组和 (BCMA×CD3
(scFv)2)2.6nM/kg处理组。通过尾静脉注射给予的抗体治疗在第19天(d19),即SC注射H929
肿瘤细胞后19天开始。TCB抗体治疗时间表由每周一次IV施用至多3周(即总共3次注射TCB
抗体)组成。在研究期间用卡尺测定肿瘤体积(TV),并通过TV的组间比较评价进展。将TV
(mm3)对肿瘤注射后的天数作图。在d19处理的第一天,媒介物处理的对照组(A)的平均肿瘤
体积达到300±161mm3,2.6nM/kg对照TCB处理组(A)的平均肿瘤体积达到315±148mm3,
2.6nM/kg 83A10‑TCBcv组(B)的平均肿瘤体积达到293±135mm3,2.6nM/kg
组(C)的平均肿瘤体积达到307±138mm3。将每个实验组的每只单独小
鼠的TV对肿瘤注射后的天数作图:(A)对照组,包括媒介物对照(实线)和对照TCB(虚线),
(B)83A10‑TCBcv(2.6nM/kg)组,以及(C) (2.6nM/kg)。黑色箭头显示IV
注射给予的TCB处理。在83A10‑TCBcv(2.6nM/kg)组中,9只小鼠中的6只(67%)在第19天即
第一次TCB处理显示肿瘤消退甚至小于TV,并且肿瘤消退维持直到研究结束。在83A10‑
TCBcv(2.6nM/kg)处理组中,未能显示肿瘤消退的3只小鼠在d19的TV分别等于376、402和
522mm3。相反,在任何时间点,使用等摩尔剂量的 (2.6nM/kg)以每周一
次的时间表处理3周的9只小鼠中没有一只(0%)具有肿瘤消退(参见实施例17)。
TG(%)=100×(分析组的中值TV)/(对照媒介物处理组的中值TV)来确定。出于伦理原因,
当TV达到至少2000mm3时,对小鼠实施安乐死。在83A10‑TCBcv(2.6nM/kg)组中,TG(%)持续
和显著降低,并且与 (2.6nM/kg)相比,TG(%)永远较低(参见实施例
17)。
片和偶联试剂的ProteOn XPR36生物传感器进行所有实验。在GLM芯片上以30μl/min进行固
定化。使用标准胺偶联程序在垂直方向上偶联pAb(山羊)抗huIgG、F(ab)2特异性Ab
(Jackson):全部六个配体通道使用EDC(200mM)和磺基‑NHS(50mM)的混合物活化5分钟。在
表面活化后立即在全部六个通道中注射pAb(山羊)抗hu IgG、F(ab)2特异性抗体(50μg/ml、
10mM乙酸钠,pH5)5分钟。最后,使用1M乙醇胺‑HCl(pH8.5)注射5分钟阻断通道。所有通道的
最终固定化水平相似,在11000至11500RU的范围内。通过沿五个独立的完整水平通道同时
注射(30μl/min)5分钟来从大肠杆菌(e.coli)上清液捕获Fab变体,根据上清液中Fab的浓
度,得到在200至900RU范围内的水平;沿第六通道注射条件培养基,以提供用于双重参考目
的的“内联”空白。一次性动力学测定通过沿垂直通道注射人和食蟹猴BCMA稀释系列(50、
10、2、0.4、0.08、0nM,50μl/min)3分钟来进行。监测解离5分钟。在ProteOnManagerv.2.1中
分析动力学数据。反应点数据的处理涉及使用内联缓冲液空白实施点间参考和双重参考步
骤(Myszka,1999)。平行的一次性注射的处理数据适合于无质量转移的简单1:1朗缪尔结合
模型(Langmuirbinding model)(O'Shannessy等人,1993)。
22、Mab 27、Mab 39和Mab 42与HEK细胞上huBCMA的结合与Mab 83A10与huBCMA‑HEK细胞的
结合相比无显著改进。
后30、90、180分钟、7、24、48、96、168、336、504小时进行药代动力学评估。使血样在试管中室
温下凝结60分钟,以进行血清分离。通过离心使凝血块旋转沉淀。将所得的血清直接储存
在‑80℃下直到进一步分析。在给药前、给药后96和336小时的麻醉/镇痛处理下,在股骨上
另外收集骨髓样品,用于药代动力学评估。使骨髓样品在试管中室温下凝结60分钟,以进行
血清分离。通过离心使凝血块旋转沉淀。将所得的骨髓直接储存在‑80℃下直到进一步分
析。进行药代动力学数据分析和评估。使用Watson软件包(v 7.4,Thermo Fisher
Scientific Waltman,MA,USA)或Phoenix WinNonlin系统(v.6.3,Certara Company,USA)
进行标准非房室分析。多发性骨髓瘤患者骨髓抽吸物中42‑TCBcv的有效浓度范围相当于
10pm至10nM(灰色区域)。括号内浓度的单位为nM。
胞裂解。测定碘化丙啶阴性骨髓瘤浆细胞的百分比,并且将存活的骨髓浆细胞白血病细胞
相对于培养基对照(MC)的百分比对TCB浓度作图。观察到患者浆细胞白血病细胞的浓度依
赖性和特异性裂解(A、B),而未观察到骨髓微环境(BMME)的裂解(数据未示出)。在测试TCB
抗体的最高浓度下,观察到对照TCB未诱导骨髓瘤浆细胞的细胞死亡。42‑TCBcv非常强效地
诱导患者骨髓浆细胞白血病细胞的杀死,如存活的(碘化丙啶阴性)骨髓瘤浆细胞的浓度依
赖性减少所反映。如果对应的统计检验的P‑值<5%(*)、<1%(**)或<0.1%(***),则认为效
应具有统计学显著性。该图示出了从患者1(A)和患者2(B)的骨髓样品获得的结果(还参见
实施例20)。
体超家族的成员。BCMA的胞外结构域根据UniProt的氨基酸1‑54(或5‑51)组成。如本文所
用,术语“针对BCMA的抗体、抗BCMA抗体”涉及特异性结合至BCMA的胞外结构域的抗体。
BCMA蛋白的结合程度比抗体与BCMA的结合低约10倍,优选地>100倍,如例如通过表面等离
子体共振(SPR)如 酶联免疫吸附(ELISA)或流式细胞术(FACS)所测定。在一个实
‑8 ‑8 ‑13 ‑9 ‑13
施方案中,结合至BCMA的抗体具有10 M或更小、优选地10 M至10 M、优选地10 M至10 M
的解离常数(Kd)。在一个实施方案中,抗BCMA抗体结合至在来自不同物种的BCMA中,优选地
在人和食蟹猴中保守的BCMA的表位,此外还优选地结合至小鼠和大鼠BCMA的表位。“特异性
结合至CD3和BCMA的双特异性抗体、针对CD3和BCMA的双特异性抗体”是指结合至两个靶标
的分别定义。特异性结合至BCMA(或BCMA和CD3)的抗体不结合至其它人抗原。因此,在ELISA
中,此类不相关的靶标的OD值将等于或小于特定分析的检出限的OD值,优选地>0.3ng/mL,
或者等于或小于不含贴板BCMA或含未转染的HEK293细胞的对照样品的OD值。
食蟹猴BCMA[M]/KD人BCMA[M](详请参见实施例3)。如本文所用,“Mab CD3的食蟹猴/人差
距”是指亲和力比率KD食蟹猴CD3[M]/KD人CD3[M]。在一个实施方案中,本发明的双特异性
抗BCMA/抗CD3抗体显示出Mab CD3的食蟹猴/人差距在1.25和5之间或在0.8和1.0之间。在
一个实施方案中,根据本发明的双特异性抗体的特征在于其还特异性结合至食蟹猴CD3。在
一个实施方案中,本发明的双特异性抗BCMA/抗CD3抗体显示出Mab CD3的食蟹猴/人差距在
1.25和5之间或在0.8和1.0之间。对于抗BCMA和抗CD3抗体,优选地食蟹猴/人差距在相同的
范围内。
本发明使用His标记的BAFF。优选地His标记的BAFF通过以下步骤产生:将编码BAFF残基82‑
285的DNA片段克隆到表达载体中,与N‑末端His‑标签和后面的凝血酶切割位点形成融合,
表达所述载体并使用凝血酶切割回收蛋白。
H929 MM细胞(CRL‑9068 )的提取物的DNA结合ELISA来测定NF‑κB活性。将未处理或使用0.1
μg/mL TNF‑α、1000ng/mL热处理的HT截短的BAFF、1000ng/mL截短的BAFF、0.1pM至200nM同
种型对照,含或不含0.1pM至200nM抗BCMA抗体处理的NCI‑H929 MM细胞温育20分钟。可以使
用检测来自与NF‑κB共有序列结合的p65的化学发光信号的功能性ELISA来分析NF‑κB活性
(US6150090)。
靶标的CD3。
中,抗体包含可变结构域VH,其包括SEQ ID NO:1、2和3的重链CDR,分别为重链CDR1H、CDR2H
和CDR3H和可变结构域VL,其包括SEQ ID NO:4、5和6的轻链CDR,分别为轻链CDR1L、CDR2L和
CDR3L。在一个实施方案中,抗体包含SEQ ID NO:7(VH)和SEQ ID NO:8(VL)的可变结构域。
域组成的多肽。每条重链包含重链可变区(在本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链
恒定区包含重链恒定结构域CH1、CH2和CH3(抗体种类IgA、IgD和IgG)以及任选地重链恒定
结构域CH4(抗体种类IgE和IgM)。每条轻链包含轻链可变结构域VL和轻链恒定结构域CL。可
变结构域VH和VL可以进一步细分为高变区,称为互补决定区(CDR),其间散布有更保守的区
域,称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成,按照以下顺序从氨基末端到羧
基末端排列:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的“恒定结构域”不直接涉及
抗体与靶标的结合,但表现出各种效应子功能。如本文所用,术语“抗体”还指包含至少特异
性结合抗原CD3或BCMA所需的抗体部分。因此,如果所述抗体部分包含在根据本发明的双特
异性抗体中,则该抗体(或抗体部分)在一个实施方案中可以是Fab片段。根据本发明的抗体
也可以是Fab'、F(ab')2、scFv、di‑scFv或双特异性T细胞接合体(BiTE)。
特别是重组人或人源化抗体。另外的实施方案是异源特异性抗体(双特异性、三特异性等)
以及例如与细胞毒性小分子的其它缀合物。
现有技术的其它形式的双特异性抗体,在一个实施方案中指双特异性单链抗体。
SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47(2×)和SEQ ID NO:48的重链和轻链组合所示,并且如图2A所
示以及EP14179705所述。如本文所用,术语“21‑TCBcv、22‑TCBcv、42‑TCBcv”是指分别地
Mab21的双特异性抗体,如SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:51(2
×)的重链和轻链组合所示,Mab 22的双特异性抗体,如SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:52、SEQ
ID NO:53和SEQ ID NO:54(2×)的重链和轻链组合所示,以及Mab42的双特异性抗体,如SEQ
ID NO:48、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57‑(2×)的重链和轻链组合所示。
指特异性结合至BCMA的抗体,并且与治疗剂例如细胞毒性剂或放射性标记缀合。
施方案中特异性结合至CD3。每个结合结构域包含来自抗体重链的一个可变区(“VH区”),其
中第一结合结构域的VH区特异性结合至CD3分子,第二结合结构域的VH区特异性结合至
BCMA。两个结合结构域任选地通过短多肽间隔子彼此连接。多肽间隔子的非限制性实例是
Gly‑Gly‑Gly‑Gly‑Ser(G‑G‑G‑G‑S)及其重复序列。每个结合结构域可以另外包含来自抗体
轻链的一个可变区(“VL区”),第一和第二结合结构域中的每个内的VH区和VL区通过多肽接
头彼此连接,该多肽接头足够长以允许第一结合结构域的VH区和VL区以及第二结合结构域
的VH区和VL区彼此配对,使得它们一起能够特异性结合至各自的第一和第二结合结构域
(参见例如EP0623679)。双特异性单链抗体还例如在Choi BD等人,Expert OpinBiol
Ther.,2011年7月;11(7):843‑53和WolfE.等人,Drug DiscovToday,2005年9月15日;10
(18):1237‑44中有所提及。
以致于不能在相同链上的两个结构域之间配对(Kipriyanov,Int.J.Cancer 77(1998),
763‑772)。这迫使与另一条链的互补结构域配对,并促进具有两个功能性抗原结合位点的
二聚体分子的组装。为了构建本发明的双特异性双抗体,使抗CD3抗体和抗BCMA抗体的V结
构域融合以形成两条链VH(CD3)‑VL(BCMA)、VH(BCMA)‑VL(CD3)。每条链本身不能结合至各
自的抗原,但在与另一条链配对时重新形成抗CD3抗体和抗BCMA抗体的功能性抗原结合位
点。两个scFv分子与重链可变结构域和轻链可变结构域之间的接头(其对于分子内二聚化
来说太短)共表达并且自组装形成在相对两端具有两个结合位点的双特异性分子。举例来
说,分别编码BCMA和CD3的结合结构域的可变区可以通过PCR从如上所述获得的DNA构建体
扩增,使得它们可以克隆到如pHOG的载体中,如Kipiriyanov等人,J.Immunol,Methods,
200,69‑77(1997a)所述。然后将两个scFV构建体以期望的方向组合在一个表达载体中,据
此缩短VH‑VL接头以防止链自身向后折叠。DNA区段通过终止密码子和核糖体结合位点
(RBS)分开。RBS允许mRNA转录为双顺反子消息,其被核糖体翻译为两个蛋白质,所述蛋白质
非共价相互作用形成双抗体分子。与其它抗体片段一样,双抗体具有可以在细菌(大肠杆
菌)和酵母(巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris))中以功能形式表达并具有高产率(最高
1g/l)的优点。
此类称为 的Fv分子包含四个抗体可变结构域,其中(i)四个可变结构域的前两
个或后两个通过以VH/VL或VL/VH方向形成抗原结合scFv来在相同的链内进行分子内彼此
结合(ii)另外两个结构域与另一条链的对应VH或VL结构域进行分子间结合,形成抗原结合
至VH/VL对。在一个优选的实施方案中,如WO 03/025018中所提及,此类Fv分子的单体包含
至少四个可变结构域,其中一个单体的两个相邻结构域形成抗原结合至VH‑VL或VL‑VH
scFv单位。
白类型之一。DARPin文库模块通过天然锚蛋白重复序列蛋白质序列,使用229个锚蛋白重复
序列进行初始设计,以及另外2200个锚蛋白重复序列进行后续精炼来确定。这些模块用作
DARPin文库的构建块。文库模块类似于人类基因组序列。DARPin由4至6个模块组成。因为每
个模块为大约3.5kDa,所以DARPin的平均大小为16‑21kDa。结合物的选择通过完全无细胞
的核糖体展示进行,并且在He M和Taussig MJ.,Biochem Soc Trans.,2007年11月;35(Pt
5):962‑5中有所描述
CD3受体结合至T细胞,另一个结合至BCMA。
类;这些链分别存在于IgA、IgD、IgE、IgG和IgM抗体(Rhoades RA,Pflanzer RG(2002)
.Human Physiology,第4版,Thomson Learning)。不同的重链在大小和组成上不同;α和γ
含有大约450个氨基酸,而μ和ε具有大约550个氨基酸。
CH3(排成一行)组成的恒定区和用于增加灵活性的铰链区(WoofJ,Burton D Nat Rev
Immunol 4(2004)89‑99);重链μ和ε具有由四个恒定结构域CH1、CH2、CH3和CH4组成的恒定
区(Janeway CA,Jr等人(2001).Immunobiology,第5版,GarlandPublishing)。重链的可变
区在由不同的B细胞产生的抗体中不同,但对于由单个B细胞或B细胞克隆产生的所有抗体
是相同的。每条重链的可变区长约110个氨基酸,并且由单个抗体结构域组成。
酸。在一个实施方案中,轻链是kappa(κ)轻链,恒定结构域CL在一个实施方案中衍生自
kappa(K)轻链(恒定结构域CK)。
精氨酸(R)或组氨酸(H)取代的独立氨基酸取代。在一个实施方案中,除恒定结构域CL之外,
位置123处的氨基酸独立地被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)取代。在一个实施方案中,
氨基酸124是K,氨基酸147是E,氨基酸213是E,氨基酸123是R。氨基酸取代在CD3Fab中或在
一个或两个BCMAFab中。作为电荷变体的针对BCMA和CD3的双特异性抗体在EP14179705中有
所公开,该专利以引用的方式公开(也称为“电荷变体或电荷变体交换”)。
Health,Bethesda,MD(1991),NIH Publication 91‑3242)。
的二价双特异性抗体的两种抗体具有相同亚类(例如IgG1、IgG4等等,优选地IgG1),优选地
相同同种异型(例如高加索人)的Fc部分。
选地人恒定区的所有其它部分。抗体的Fc部分直接涉及补体活化、C1q结合、C3活化和Fc受
体结合。尽管抗体对补体系统的影响取决于某些条件,但是结合至C1q是由Fc部分中的确定
结合位点引起的。此类结合位点是现有技术领域已知的,并且在Lukas,TJ.等人,
J.Immunol.127(1981)2555‑2560;Brunhouse,R.和Cebra,J.J.,MoI.Immunol.16(1979)
907‑917;Burton,D.R.等人,Nature 288(1980)338‑344;Thommesen,J.E.等人,
MoI.Immunol.37(2000)995‑1004;Idusogie,E.E.等人,J.Immunol.164(2000)4178‑4184;
Hezareh,M.等人,J.Virol.75(2001)12161‑12168;Morgan,A.等人,Immunology 86(1995)
319‑324;和EP 0 307 434中有所描述。
化,而IgG4不活化补体系统、不结合至C1q并且不活化C3。在一个实施方案中,Fc部分是人Fc
部分。
Kabat的EU索引编号,并且其中与包含野生型IgG Fc区的抗体相比,所述抗体表现出对人Fc
γRIIIA和/或FcγRIIA和/或FcγRI的亲和力降低,并且其中由所述抗体诱导的ADCC降低
至由包含野生型人IgG Fc区的抗体诱导的ADCC的至少20%。在一个具体的实施方案中,根
据本发明的抗体中的野生型人Fc区的Pro329被甘氨酸或精氨酸或足够大的氨基酸残基取
代,以破坏Fc/Fcγ受体界面内,即在Fc的脯氨酸329和FcγRIII的色氨酸残基Trp 87和Tip
110之间形成的脯氨酸夹心层(Sondermann等人:Nature 406,267‑273(2000年7月20日))。
在本发明的另一方面,Fc变体中的至少一个另外的氨基酸取代是S228P、E233P、L234A、
L235A、L235E、N297A、N297D或P331S,在又一个实施方案中,所述至少一个另外的氨基酸取
代是人IgG1Fc区的L234A和L235A或人IgG4Fc区的S228P和L235E。WO2012130831中详细描述
了此类Fc变体。
胞”意指表达一种或多种Fc受体并介导一种或多种效应子功能的免疫系统的细胞。效应子
细胞包括但不限于单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、
血小板、B细胞、大颗粒淋巴细胞、朗格汉斯细胞(Langerhans'cells)、自然杀伤(NK)细胞和
γδT细胞,可以来自任何有机体,包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔子和猴子。本文的所谓“文
库”意指一组任何形式的Fc变体,包括但不限于纯化或未纯化形式的核酸或氨基酸序列的
列表、可变位置处的核酸或氨基酸取代列表、包含编码文库序列核酸的物理文库或包含Fc
变体蛋白的物理文库。
同种型FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc;FcγRII(CD32),包括同种型FcγR11a(包括同种异型
H131和R131)、FcγR11b(包括FcγR11b‑1和FcγR11b‑2)和FcγR11c;以及FcγRIII
(CD16),包括同种型FcγR111a(包括同种异型V158和F158)和FcγR111b(包括同种异型Fc
γR111b‑NA1和FcγR111b‑NA2)(Jefferis等人,2002,Immunol Lett 82:57‑65)以及任何
未发现的人FcγR或FcγR同种型或同种异型。FcγR可以来自任何生物体,包括但不限于
人、小鼠、大鼠、兔子和猴子。小鼠FcγR包括但不限于FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、Fcγ
RIII(CD16)和FcγRIII‑2(CD16‑2),以及任何未发现的小鼠FcγR或FcγR同种型或同种异
型。
化修饰。此类修饰例如在Duncan等人,1988,Nature 332:563‑564;Lund等人,1991,J
Immunol 147:2657‑2662;Lund等人,1992,Mol Immunol 29:53‑59;Alegre等人,1994,
Transplantation 57:1537‑1543;Hutchins等人,1995,Proc Natl Acad Sci U S A92:
11980‑11984;Jefferis等人,1995,//77muno/Lett 44:111‑117;Lund等人,1995,Faseb J
9:115‑119;Jefferis等人,1996,Immunol Lett 54:101‑104;Lund等人,1996,J Immunol
157:4963‑4969;Armour等人,1999,Eur J Immunol 29:2613‑2624;Idusogie等人,2000,J
Immunol 164:4178‑4184;Reddy等人,2000,J Immunol 164:1925‑1933;Xu等人,2000,Cell
Immunol 200:16‑26;Idusogie等人,2001,J Immunol 166:2571‑2575;Shields等人,2001,
J Biol Chem 276:6591‑6604;Jefferis等人,2002,Immunol Lett 82:57‑65;Presta等人,
2002,Biochem Soc Trans 30:487‑490;US5624821;US5885573;US6194551;WO200042072;
WO199958572中有所提及。根据本发明,此类Fc修饰还包括Fc部分的工程化的糖型。如本文
所用,所谓“工程化的糖型”意指与Fc多肽共价连接的碳水化合物组合物,其中所述碳水化
合物组合物在化学上不同于亲本Fc多肽的组合物。可以通过任何方法产生工程化的糖型,
例如通过使用工程化或变体表达菌株,通过与一种或多种酶(例如D1‑4‑N‑乙酰葡糖胺基转
移酶III(GnTIII))共表达,通过在各种生物体或来自各种生物体的细胞系中表达Fc多肽,
或通过在表达Fc多肽后修饰碳水化合物。产生工程化的糖型的方法是本领域已知的,并且
在Umana等人,1999,Nat Biotechnol 17:176‑180;Davies等人,2001,Biotechnol Bioeng
74:288‑294;Shields等人,2002,J Biol Chem 277:26733‑26740;Shinkawa等人,2003,J
Biol Chem 278:3466‑3473;US6602684;WO200061739;WO200129246;WO200231140;
TM TM
WO200230954;Potelligent technology(Biowa,Inc.,Princeton,N.J.);GlycoMAb
glycosylation engineering technology(GLYCART biotechnology AG,Zurich,
Switzerland))中有所提及。工程化的糖型通常是指不同于母体Fc多肽的碳水化合物或寡
糖组合物。
(95%岩藻糖基化)(作为在CHO宿主细胞,诸如CHO DG44或CHO K1细胞中表达的对照),
CD16a/F158的结合增加至少10倍,或/和相对于亲本抗体,CD16a/V158的结合增加至少20
倍,如通过表面等离振子共振(SPR)使用固定化CD 16a以100nM的抗体浓度所测定。Fcγ
RIII结合可以通过根据现有技术的方法来增加,例如通过修饰Fc部分的氨基酸序列或抗体
的Fc部分的糖基化(参见例如EP2235061)。Mori,K等人,Cytotechnology 55(2007)109和
Satoh M等人,Expert Opin Biol Ther.6(2006)1161‑1173涉及用于产生无岩藻糖基化抗
体的FUT8(α‑1,6‑岩藻糖基转移酶)基因敲除CHO细胞系。
恒定区的嵌合抗体是优选的。本发明涵盖的“嵌合抗体”的其它优选形式是其中恒定区已从
原始抗体的恒定区修饰或改变以产生根据本发明的性质,特别是关于C1q结合和/或Fc受体
(FcR)结合的那些形式。此类嵌合抗体也称为“种类转换抗体”。嵌合抗体是免疫球蛋白基因
的表达产物,该基因包含编码免疫球蛋白可变区的DNA区段和编码免疫球蛋白恒定区的DNA
区段。用于产生嵌合抗体的方法涉及常规重组DNA,并且基因转染技术是本领域熟知的。参
见例如Morrison,S.L.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81(1984)6851‑6855;美国专利No.5,
202,238和5,204,244。
CDR移植到人抗体的构架区以制备“人源化抗体”。参见例如Riechmann,L.等人,Nature 332
(1988)323‑327;和Neuberger,M.S.等人,Nature 314(1985)268‑270。本发明涵盖的“人源
化抗体”的其它形式是其中恒定区已从原始抗体的恒定区另外修饰或改变以产生根据本发
明的性质,特别是关于C1q结合和/或Fc受体(FcR)结合的那些形式。
Curr.Opin.Chem.Biol.5(2001)368‑374)。还可以在转基因动物(例如,小鼠)中产生人抗
体,所述转基因动物在免疫时能够在不存在内源性免疫球蛋白产物的情况下产生完整谱系
或精选的人抗体。人种系免疫球蛋白基因阵列在此类种系突变小鼠中的转移将产生人抗体
(参见例如Jakobovits,A.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(1993)2551‑2555;
Jakobovits,A.等人,Nature 362(1993)255‑258;Bruggemann,M.等人,Year Immunol.7
(1993)33‑40)。人抗体也可以在噬菌体展示文库中产生(Hoogenboom,H.R.和Winter,G.,
J.MoI.Biol.227(1992)381‑388;Marks,J.D.等人,J.MoI.Biol.222(1991)581‑597)。Cole
等人和Boerner等人的技术也可用于制备人单克隆抗体(Cole等人,Monoclonal
Antibodies and Cancer Therapy,AlanR.Liss,第77页(1985);和Boerner,P.等人,
J.Immunol.147(1991)86‑95)。如已经针对根据本发明的嵌合和人源化抗体所提及,如本文
所用,术语“人抗体”还包括此类抗体,其在恒定区中被修饰为产生根据本发明的性质,特别
是关于C1q结合和/或FcR结合,例如通过“种类转换”即Fc部分的改变或突变(例如从IgG1至
IgG4和/或IgG1/IgG4突变)。
如小鼠)分离的抗体或使用转染进宿主细胞的重组表达载体表达的抗体。此类重组人抗体
具有重排形式的可变区和恒定区。根据本发明的重组人抗体已经受体内体细胞超突变。因
此,重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是这样的序列:虽然其衍生自人种系VH和VL序列并
与之相关,但可能不会天然存在于体内人抗体种系谱系内。
同的一般结构,并且每个结构域包含四个框架(FR)区,其序列是广泛保守的,通过三个“高
变区”(或互补决定区,CDR)连接。框架区采用β‑折叠构象,并且CDR可以形成连接β‑折叠结
构的环。每条链中的CDR通过构架区保持其三维结构,并且与来自另一条链的CDR一起形成
结合位点。抗体重链和轻链CDR3区在根据本发明的抗体的结合特异性/亲和力中发挥特别
重要的作用,因此提供本发明的另一个目的。
是除本文定义的高变区残基之外的那些可变区域。因此,抗体的轻链和重链从N‑末端至C‑
末端包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。每条链上的CDR被此类框架氨基酸分
开。特别地,重链的CDR3是对靶标结合贡献最大的区。CDR和FR区根据Kabat等人,Sequences
of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National
Institutes ofHealth,Bethesda,MD(1991)的标准定义来确定。如本文所用,术语“CDR1H、
CDR2H和CDR3H”是指位于可变结构域VH中的重链的各自CDR。如本文所用,术语“CDR1L、
CDR2L和CDR3L”是指位于可变结构域VL中的轻链的各自CDR。
链结构域CL可以是lambda(λ)或kappa(κ)种类,优选地kappa(κ)种类。
些实施方案中可具有特定三维结构特性和/或比电荷特性。表位是抗体结合的靶标区域。
特异性结合至第二靶标的所述抗体的轻链和重链的另外两个载体。两个载体中的一个编码
各自的轻链,两个载体中的另一个编码各自的重链。然而,在制备根据本发明的抗体的替代
方法中,仅一个第一载体(编码特异性结合至第一靶标的抗体的轻链和重链),仅一个第二
载体(编码特异性结合至第二靶标的抗体的轻链和重链)可以用于转化宿主细胞。
养物,而不考虑转移次数。还应当理解,由于有意或无意突变,所有子代在DNA含量上可能不
严格相同。包括与经过筛选用于初始转化细胞具有相同功能或生物学活性的变体子代。在
明确指定的地方,从上下文中可以清晰地看出。
546ff所述的磷酸钙沉淀法进行转染。然而,也可以使用将DNA引入细胞的其它方法,诸如通
过核注射或通过原生质体融合。如果使用含有实质细胞壁构造的一种或多种原核细胞,则
一种转染方法是使用氯化钙进行钙处理,如Cohen SN等人,PNAS 1972,69(8):2110‑2114所
述。
271‑282;Kaufman,RJ.,MoI.Biotechnol.16(2000)151‑161;Werner,R.G.等人,
Arzneimittelforschung 48(1998)870‑880的综述文章以及US6331415和US4816567中有所
描述。
核苷酸衍生自基因组DNA,则在真核细胞中的表达可能包括mRNA的剪接。
合)作用的载体,主要发挥DNA或RNA复制作用的载体复制,以及发挥DNA或RNA的转录和/或
翻译作用的表达载体。还包括提供超过一种所述功能的载体。
上可接受的纯度。对于蛋白质表达,通过标准方法将编码轻链和重链或其片段的核酸插入
表达载体。在合适的原核或真核宿主细胞如CHO细胞、NSO细胞、SP2/0细胞、HEK293细胞、COS
细胞、酵母或大肠杆菌细胞中进行表达,并且从细胞(裂解后的上清液或细胞)回收抗体。双
特异性抗体可以存在于完整细胞、细胞裂解物中,或以部分纯化或基本上纯的形式存在。通
过标准技术,包括碱/SDS处理、柱色谱和本领域熟知的其它技术进行纯化以消除其它细胞
组分或其它污染物,例如其它细胞核酸或蛋白质。参见Ausubel,F.等人编,Current
Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing andWiley Interscience,
NewYork(1987)。
Durocher,Y.等人,Nucl.Acids.Res.30(2002)E9所述。可变结构域的克隆如Orlandi,R.等
人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)3833‑3837;Carter,P.等人,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA89(1992)4285‑4289;和Norderhaug,L.等人,J.Immunol.Methods
204(1997)77‑87所述。优选的瞬时表达系统(HEK293)如Schlaeger,E.‑J.和Christensen,
K.,载于Cytotechnology 30(1999)71‑83和Schlaeger,E.‑J.,载于J.Immunol.Methods
194(1996)191‑199所述。
规程序分离和测序。杂交瘤细胞可以用作此类DNA和RNA的来源。一旦分离DNA,即可将其插
入表达载体,然后将该表达载体转染进不另外产生免疫球蛋白的宿主细胞,诸如HEK293细
胞、CHO细胞或骨髓瘤细胞,以获得宿主细胞中的重组单克隆抗体合成。
上所述。例如,该修饰不改变上述抗体特性诸如IgG同种型和靶标结合,但可以提高重组产
物的产率、蛋白质稳定性或促进纯化。
别部分是根据本发明的抗体(此处不是双特异性抗体)。编码的抗体也可以是所示的抗原结
合片段。此类“BCMA CAR”的结构和产生例如在WO2013154760、WO2015052538、WO2015090229
和WO2015092024中有所描述。
CDR1H、CDR2H、CDR1L和CDR2L区的组合:
何分子衍生或获得的任何跨膜结构域。例如,跨膜结构域可以从CD8a分子或CD28分子获得
或衍生。CD8是用作T细胞受体(TCR)的辅助受体的跨膜糖蛋白,主要在细胞毒性T细胞的表
面上表达。最常见的CD8形式以CD8α和CD8β链组成的二聚体存在。CD28在T细胞上表达并且
提供T细胞活化所需的共刺激信号。CD28是CD80(B7.1)和CD86(B7.2)的受体。在一个优选的
实施方案中,CD8α和CD28是人的。除跨膜结构域之外,T细胞活化部分还包含细胞内(即,细
胞质)T细胞信号转导结构域。细胞间T细胞信号转导结构域可以从CD28分子、CD3ζ分子或其
修饰形式、人Fc受体γ(FcRy)链、CD27分子、OX40分子、4‑IBB分子或本领域已知的其它细胞
内信号转导分子获得或衍生。如上所讨论,CD28是在T细胞共刺激中重要的T细胞标记物。
CD3ζ与TCR相关联以产生信号并包含基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。4‑1BB,也称
为CD137,其向T细胞传递强效的共刺激信号,促进T淋巴细胞的分化并增强其长期存活。在
一个实施方案中,CD28、CD3ζ、4‑1BB、OX40和CD27是人的。
人,Int J Cancer 2002),T细胞双特异性结合物(TCB)以比常规单特异性抗体更低的剂量
2
给予。例如,博纳吐单抗(blinatumomab)(CD19×CD3)以5至15μg/m /天(即,仅0.35至
2 2
0.105mg/m/周)的连续静脉内剂量给予,用于治疗急性淋巴细胞性白血病,或以60μg/m /天
的连续静脉内剂量给予,用于治疗的非霍奇金淋巴瘤(Non Hodgkin Lymphoma),并且这些
剂量的血清浓度在0.5到4ng/ml的范围内(Klinger等人,Blood2012;Topp等人,J Clin
Oncol 2011;Goebeler等人,Ann Oncol 2011)。因为低剂量的TCB可以在患者中发挥高功
效,所以设想对于根据本发明的抗体,在临床背景中,皮下施用是可能的和优选的(优选地
2 2
在0.1至2.5mg/m/周的剂量范围内,优选地25mg/m /周,优选地250mg/m2/周)。即使在这些
低浓度/剂量/受体占有率下,TCB也可以引起相当大的不良事件(Klinger等人,
Blood2012)。因此,控制肿瘤细胞占有率/覆盖率是至关重要的。在血清APRIL和BAFF水平高
且可变的患者(例如多发性骨髓瘤患者,Moreaux等人,2004;Blood 103(8):3148‑3157)中,
结合至肿瘤细胞的TCB数量或肿瘤细胞占有率可以受到APRIL/BAFF的显著影响。但是通过
使用本发明所述的抗体,肿瘤细胞占用率或功效/安全性,可能不需要增加根据本发明的抗
体的剂量,因为所述抗体可能不受APRIL/BAFF配体竞争的影响。根据本发明的抗体的另一
个优点基于包含Fc部分,其使消除半衰期增加至约4至12天,并且与无Fc部分的TCB(例如博
纳吐单抗)需要通过患者携带的泵进行静脉内和连续给予相比,允许至少一次或两次/周施
用。
抗CD3 TCB抗体21‑TCBcv、22‑TCBcv、42‑TCBcv的T细胞重导向细胞毒性的效力(实施例8、表
12、图4)。研究了本发明的抗体,分析显示H929细胞的浓度依赖性杀死或EC50值被发现大于
所测定的83A10‑TCBcv的EC50值;表明作为TCB的根据本发明的抗BCMA抗体诱导H929MM细胞
的杀死的效力低于作为TCB的Mab 83A10。当在RPMI‑8226MM细胞系以及JJN‑3细胞系上测定
T细胞重导向细胞毒性时,出乎意料地观察到翻转(分别地,实施例10和11、表13和14和15、
图6和7):作为TCB的根据本发明抗体显示出EC50小于从而效力高于83A10‑TCBcv。出乎本发
明人意料的是,作为TCB的根据本发明的抗体在与从MM患者新鲜采集的骨髓抽吸物中的
83A10TCBcv进行直接比较时显示出几个优点(注意:为了获得尽可能最好的比较,在所有骨
髓抽吸物中始终以相同的浓度测试所有T细胞双特异性(TCB)抗体);
1nM作为TCB的根据本发明的抗体的浓度下,在七份不同的患者骨髓抽吸物中,相对于碘化
丙啶阴性的存活多发性骨髓瘤癌细胞对照的减少在77.1%和100%之间。在相同的七份骨
髓抽吸物中,1nM 83A10‑TCBcv仅实现减少37.1%至98.3%(表20和21)。
为TCB的根据本发明的抗体的杀死(图9A和9B)。
BCMA,适合于在食蟹猴中进行毒理学检查。出乎意料地,对食蟹猴BCMA的结合亲和力非常接
近于对人BCMA的结合亲和力。SPR已用于测定对人和食蟹猴BCMA的结合亲和力(实施例2、表
4)。食蟹猴/人差距(食蟹猴与人BCMA的亲和力比率,KD)从测定亲和力数据通过将对食蟹猴
BCMA的亲和力除以对人BCMA的亲和力来计算(实施例3、表5)。对于83A10,得到的食蟹猴/人
差距为15.3(即对食蟹猴的结合亲和力比对人BCMA的低15.3倍)。出乎本发明人意料的是,
根据本发明的抗体显示出食蟹猴/人差距在15.4和1.7之间,它是与83A10相似或在很大程
度上更有利的食蟹猴/人差距(表5)。因为在根据本发明的BCMA×CD3 TCB中使用的CD3结合
物对食蟹猴CD3具有交叉反应性,所以可以从食蟹猴获得药代动力学和药效动力学研究(参
见实施例16)。在食蟹猴中的毒理学研究也预示着在人类中的药理学和毒理学效应,以及与
食蟹猴特征的交叉反应对患者是有益的。本发明的BCMA抗体还结合至鼠BCMA(例如,通过
SPR测定的克隆22和42的Kd为0.9nM和2.5nM,参见实施例1.1.1A.4中的表2D)。BCMA×CD3
TCB的CD3结合物对鼠CD3不具有交叉反应性。
的食蟹猴/人差距使得本发明的抗体和各自的TCB成为治疗MM患者的实质上有希望的试剂。
此外,本发明的抗BCMA×CD3 TCBcv具有如83A10‑TCBcv的有利特性,如长期消除半衰期、每
周一次施用(静脉内、皮下)的功效、低或无凝集倾向以及可以以高纯度和良好产率制备。
ID NO:21的CDR1H区和SEQ ID NO:22的CDR2H区、SEQ ID NO:23的CDR1L区和SEQ ID NO:24
的CDR2L区,
VL区包含SEQ ID NO:20的CDR3L区和选自以下组的CDR1L和CDR2L区的组合:
SEQ ID NO:20的CDR3L区和选自以下组的CDR1L和CDR2L区组合:
组合:
ID NO:21的CDR1H区、SEQ ID NO:22的CDR2H区和SEQ ID NO:17的CDR3H区,以及VL区,所述
VL区包含SEQ ID NO:20的CDR3L区和选自以下组的CDR1L和CDR2L区组合:
ID NO:10的VH区和作为VL区的SEQ ID NO:13的VL区或作为BCMA VH的SEQ ID NO:10的VH区
和作为VL区的SEQ ID NO:14的VL区。
NO:32的CDR2L区和SEQ ID NO:20的CDR3L区和选自以下组的CDR1L和CDR2L区组合:
分。
者的C‑末端。
抗体(CD3抗体部分)的所述Fab片段的N‑末端。
CDR1、CDR2和CDR3,并且抗CD3抗体部分的可变结构域VL(进一步也称为“CD3VL”)包含SEQ
ID NO:4、5和6的轻链CDR,分别为轻链CDR1、CDR2和CDR3。
结构域CH1中,位置147处的氨基酸和位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立
地取代(根据Kabat编号)(参见例如图1A、2A、2C、3A、3C)。
赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号),并且其中在所述BCMA‑
Fab的恒定结构域CH1中,位置147处的氨基酸和位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨
酸(D)独立地取代(根据Kabat编号)(参见例如图2A、2C)。
域CH1中,位置147处的氨基酸和位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取
代(根据Kabat编号)。
缀合物或双特异性抗体。
体片段。
SEQ ID NO:20的CDR3L区以及选自以下组的CDR1H、CDR2H、CDR1L和CDR2L区的组合:
治疗48小时后,将多发性骨髓瘤MM骨髓抽吸物中的人恶性浆细胞消耗至至少80%的程度,
所述方法的特征在于
15至36中任一项所述的双特异性抗体,所述双特异性抗体以这种方式消耗此类人恶性浆细
胞,
案15至36中任一项所述的双特异性抗体,所述双特异性抗体以这种方式消耗此类人恶性浆
细胞,以及
测定,与APRIL相比,改变APRIL依赖性NF‑κB活化不超过20%,并且与无所述抗体的情况下
相比,改变无APRIL的NF‑κB活化不超过20%。
分析中以450nm下的OD所测定。与在无APRIL的情况下所述抗体与人BCMA的结合相比,所述
抗体以50nM的浓度结合被140ng/ml鼠APRIL减少不超过10%,如在ELISA分析中以450nm下
的OD所测定。
如在ELISA分析中以405nm下的OD所测定,与单独的APRIL相比,所述抗体改变APRIL依赖性
NF‑κB活化不超过20%,与单独的BAFF相比,改变BAFF依赖性NF‑κB活化不超过20%,并且与
无所述抗体的情况下相比,改变无BAFF和APRIL的NF‑κB活化不超过20%。
被1000ng/ml APRIL减少不超过15%,如所述ELISA所测定。
1000ng/ml BAFF减少不超过20%,如所述ELISA所测定,并且被1000ng/ml APRIL减少并且
被1000ng/ml BAFF减少不超过15%,如所述ELISA所测定。
及不超过10%,如在存在或不存在浓度为2.5μg/ml的APRIL或者BAFF的情况下,所述抗体以
TM
5nM、优选地50nM以及140nM的浓度与NCI‑H929细胞( CRL‑9068 )的结合所测定。
进行修改。
述。根据制造商的说明书使用分子生物学试剂。关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序
列的一般信息在下面给出:Kabat,E.A.等人,(1991)Sequences of Proteins of
Immunological Interest,第5版,NIH Publication No.91‑3242。根据Kabat,E.A.等人,
Sequences ofProteins ofImmunological Interest,第5版,Public Health Service,
National Institutes of Health,Bethesda,MD,(1991)对抗体链的氨基酸编号和提及。
随后通过所示限制性位点如Kpnl/Sad或Ascl/Pacl克隆到基于pPCRScript(Stratagene)的
pGA4克隆载体中。亚克隆基因片段的DNA序列通过DNA测序来确认。基因合成片段根据给定
的说明书在Geneart(Regensburg,Germany)订购。
一限制性核酸内切酶切割位点的基因区段克隆到标准表达载体中或测序载体中用于进一
步分析。使用可商购获得的质粒纯化试剂盒从转化的细菌纯化质粒DNA。通过紫外光谱测定
质粒浓度。亚克隆基因片段的DNA序列通过DNA测序来确认。基因区段使用合适的限制性位
点来设计以允许亚克隆到各自的表达载体中。如果需要的话,蛋白质编码基因使用编码靶
向在真核细胞中分泌的蛋白质的前导肽的5'末端DNA序列来设计。
装。亚克隆核酸序列通过DNA测序来验证。对于瞬时转染,通过来自转化的大肠杆菌培养物
(NucleobondAX,Macherey‑Nagel)的质粒制剂来制备更大量的质粒。
链或人IgG1恒定轻链框内。抗体表达由嵌合MPSV启动子驱动,该启动子包含CMV增强子和
MPSV启动子,随后是5'UTR、内含子和IgκMAR元件。转录由CDS的3’末端处的合成polyA信号
序列终止。所有载体均携带编码靶向在真核细胞中分泌的蛋白质的前导肽的5'末端DNA序
列。此外,每个载体含有EBV OriP序列,用于在EBV EBNA表达细胞中进行附加体质粒复制。
由重链和轻链组成的Fab片段,各自包含可变区和恒定区。至少一个Fab片段是“Crossfab”
片段,其中VH和VL被交换。Fab片段内的VH和VL交换确保不同特异性的Fab片段不具有相同
的结构域排列。双特异性分子设计对于CD3是单价的,对于其中一个Fab片段与内部
CrossFab(2+1)的N‑末端融合的BCMA是二价的。双特异性分子含有Fc部分以使分子具有长
半衰期。图2给出了构建体的示意图;构建体的优选序列如SEQ ID NO:39至52所示。通过使
用聚合物基‑溶液将哺乳动物表达载体共转染至悬浮液中生长的HEK293EBNA细胞来产生分
子。对于2+1CrossFab‑IgG构建体的制备,用对应的表达载体以1:2:1:1的比率(“载体Fc
(钮)”:“载体轻链”:“载体轻链CrossFab”:“载体重链CrossFab”)转染细胞。
Sons,Inc.所述使用。
活细胞/mL接种于补充有6mM L‑谷氨酰胺的Ex‑Cell培养基中。对于每毫升的最终产物体
积,将2.0Mio存活细胞离心(以210×g离心5分钟)。吸出上清液并将细胞重悬于100μL CD
CHO培养基中。通过在100μL CD CHO培养基中混合1μg DNA(比例重链:修饰的重链:轻链:修
饰的轻链=1:1:2:1)来制备每毫升最终产物体积的DNA。在加入0.27μL聚合物基‑溶液
(1mg/mL)后,将混合物涡旋15秒,并在室温下放置10分钟。在10分钟后,将重悬的细胞和
DNA/聚合物基‑溶液的混合物放置在一起,然后转移到适当的容器中,将该容器置于振荡装
置中(37℃,5%CO2)。在3小时温育时间后,每毫升最终产物体积加入800μL补充有6mM L‑谷
氨酰胺、1.25mM丙戊酸和12.5%Pepsoy(50g/L)的Ex‑Cell培养基。在24小时后,每毫升最终
产物体积加入70μL接种溶液。在7天后或当细胞存活力等于或小于70%时,通过离心和无菌
过滤将细胞与上清液分离。通过亲和步骤和一个或两个精细纯化步骤,即阳离子交换色谱
和尺寸排阻色谱来纯化抗体。当需要时,使用另外的精细纯化步骤。在悬浮液中通过使用聚
合物基‑溶液将哺乳动物表达载体共转染至HEK293‑EBNA细胞来产生重组抗BCMA人抗体和
双特异性抗体。根据形式使用两种或四种载体来转染细胞。对于人IgG1,一种质粒编码重
链,另一种质粒编码轻链。对于双特异性抗体,共转染四种质粒。其中两种编码两个不同的
重链,另外两种编码两个不同的轻链。在转染前一天,将HEK293‑EBNA细胞以1.5Mio存活细
胞/mL接种于补充有6mM L‑谷氨酰胺的F17培养基中。
性凝胶,含 抗氧化剂运行缓冲液添加剂)或MOPS(非还原性凝胶)运行缓冲液。
通过使用20mM磷酸钠、100mM氯化钠、100mM甘氨酸pH3.0分步洗脱,从柱上洗脱抗体。立即用
0.5M磷酸钠pH8.0(1:10)中和具有所需抗体的级分,汇集并通过离心浓缩。无菌过滤浓缩
物,并通过阳离子交换色谱和/或尺寸排阻色谱进一步处理。
缓冲液(分别为20mM磷酸钠、20mM柠檬酸钠、20mM TRIS pH5.0和20mM磷酸钠、20mM柠檬酸
钠、20mM TRIS、100mM氯化钠pH5.0)两次洗涤步骤后,使用20mM磷酸钠、20mM柠檬酸钠、20mM
TRIS、100mM氯化钠pH8.5梯度洗脱蛋白质。将具有所需抗体的级分汇集,通过离心浓缩,无
菌过滤并进一步进行尺寸排阻步骤。
集含有单体的级分,通过离心浓缩,并无菌过滤到无菌小瓶中。
酸单盐酸盐、0.02%(w/v)叠氮化钠pH6.7缓冲液中测定最终蛋白质制剂的纯度和单体含
量。
2μl 2M Tris加入20μg蛋白质来将蛋白质溶液的pH调节至pH7.0。加入0.8μg PNGaseF并在
37℃下温育12h。
719510)上进行。洗脱液A为5%乙腈和0.05%(v/v)甲酸水溶液,洗脱液B为95%乙腈、5%水
和0.05%甲酸。流速为1ml/分钟,在40℃下进行分离,如上所述处理获得6μg(15μl)蛋白质
样品。
0.5 15
10 60
12.5 100
14.5 100
14.6 15
16 15
16.1 100
裂电压和700至3200m/z的质量范围采集。MS数据通过仪器软件从4至17分钟采集。
液并小心地在Histopaque梯度(Sigma,H8889)上分层。在室温下以450×g离心30分钟(制动
关闭)后,丢弃血浆上含有PBMC的中间相的部分。将PBMC转移到新的50ml Falcon管中,并用
PBS填充管至总体积50ml。在室温下以400×g离心混合物10分钟(制动打开)。丢弃上清液,
并用无菌PBS洗涤PBMC沉淀物两次(在4℃下以350×g离心步骤10分钟)。对所得的PBMC群进
行自动计数(ViCell),并在37℃、5%CO2的培养箱中储存在含有10%FCS和1%L‑丙氨酰‑L‑
谷氨酰胺(Biochrom,K0302)的RPMI1640培养基中,直到开始分析。
1114545)稀释至90%。将两倍体积的稀释血液在一倍体积的稀释密度梯度上分层,并在室
温下通过以520×g无制动离心30分钟来分离PBMC级分。将PBMC带转移到新的50ml Falcon
管中,通过在4℃下以400×g离心10分钟用无菌PBS洗涤。进行一次低速离心以除去血小板
(15分钟、150×g、4℃),并对所得的PBMC群进行自动计数(ViCell),立即用于进一步分析。
实施例
末端的avi标签识别序列处共表达BirA生物素连接酶来进行体内位点特异性生物素化。人
和食蟹猴BCMA的胞外结构域分别包含甲硫氨酸4至天冬酰胺53,以及甲硫氨酸4至天冬酰胺
52。这些以N‑末端融合至人IgG1的铰链,从而通过钮入孔技术使其能够与未融合的人
IgG1Fc部分(孔链)异源二聚化。
装步骤来构建。对于83A10L1/L2文库,用NcoI/BsiWI,对于83A10H1/H2文库,用MunI和NheI,
以及基于克隆83A10的质粒制剂的类似处理的受体载体消化最终组装产物。对于各个文库,
将以下量的消化的随机化(部分)V结构域和一种或多种消化的受体载体进行连接(μg V结
构域/μg载体):a.m.83A10L1/L2文库(3/10)、83A10H1/H2文库(3/10),分别汇集83A10L1/L2
和83A10H1/H2文库的纯化连接物,并对于2个文库中的每个将其用于进行15次大肠杆菌TG1
10 10
细胞转化,以获得2.44×10 (对于83A10L1/L2文库)和1.4×10 (对于a.m.83A10H1/H2文
库)的最终文库大小。回收和纯化展示这些Fab文库的噬菌粒颗粒。
上。根据以下模式进行选择:
到50nM、25nM、10nM或2nM人或食蟹猴BCMA(取决于文库和选择轮次)20分钟,3)加入磁性链
霉亲和素珠粒10分钟,4)使用10×1ml 20和10×1ml PBS洗涤磁性链霉亲和
素珠粒,5)通过加入1ml 100mM TEA(三乙胺)10分钟来洗脱噬菌体颗粒,并通过加入500μl
1M pH7.4来中和,和6)对数期大肠杆菌TG1细胞的再感染,用辅助噬菌体VCSM13
感染,并随后PEG/NaCl沉淀噬菌粒颗粒以用于随后的选择轮次。
流线3(对于第1轮50nM huBCMA,对于第2轮25nM huBCMA,对于第3轮10nM cynoBCMA),流线4
(对于第1轮50nM huBCMA,对于第2轮25nM cynoBCMA,对于第3轮10nM cynoBCMA),流线5(对
于第1轮50nM cynoBCMA,对于第2轮25nM cynoBCMA,对于第3轮10nM cynoBCMA)。
底3×的信号。用10nM huBCMA、10nM cyBCMA或50nM Fc消耗物涂布中性亲和素96孔条板,然
后加入含Fab的细菌上清液,并通过使用抗Flag/HRP二抗经由Flag标签检测特异性结合的
Fab。将ELISA‑阳性克隆以1ml培养物以96孔板形式进行细菌表达,并对上清液进行动力学
筛选实验ProteOn。鉴定出500个阳性克隆,它们中的大多数具有相似的亲和力。
联试剂(10mM乙酸钠pH4.5、磺基‑N‑羟基琥珀酰亚胺、1‑乙基‑3‑(3‑二甲基氨基丙基)‑碳二
亚胺盐酸盐[EDC]和乙醇胺)的ProteOn XPR36生物传感器购自BioRadInc.(Hercules,CA)。
在GLM芯片上以30μl/min进行固定化。使用标准胺偶联程序在垂直方向上偶联pAb(山羊)抗
hu IgG、F(ab)2特异性Ab(Jackson):全部六个配体通道使用EDC(200mM)和磺基‑NHS(50mM)
的混合物活化5分钟。在表面活化后立即在全部六个通道中注射pAb(山羊)抗hu IgG、F(ab)
2特异性抗体(50μg/ml、10mM乙酸钠,pH5)5分钟。最后,使用1M乙醇胺‑HCl(pH8.5)注射5分
钟阻断通道。所有通道的最终固定化水平相似,在11000至11500RU的范围内。通过沿五个独
立的完整水平通道同时注射(30μl/min)5分钟来从大肠杆菌上清液捕获Fab变体,并且根据
上清液中Fab的浓度,得到在200至900RU范围内的水平;沿第六通道注射条件培养基,以提
供用于双重参考目的的“内联”空白。一次性动力学测量通过沿垂直通道注射人、食蟹猴和
小鼠BCMA的稀释系列(50、10、2、0.4、0.08、0nM,50μl/min)3分钟来进行。监测解离5分钟。在
ProteOn Manager v.2.1中分析动力学数据。反应点数据的处理涉及使用内联缓冲液空白
应用点间参考和双重参考步骤(Myszka,1999)。使重复的一次性注射的处理数据拟合至无
质量转移的简单1:1朗缪尔结合模型(O'Shannessy等人,1993)。
的水平;沿第六通道注射条件培养基,以提供用于双重参考目的的“内联”空白。一次性动力
学测量通过沿垂直通道注射人、食蟹猴和小鼠BCMA稀释系列(25、5、1、0.2、0.04、0nM,50μl/
min)3分钟来进行。监测解离5分钟。如上所述分析动力学数据。表2D中汇总了OSK测量结果;
i/m,不确定的测量结果。对huBCMA的亲和力被发现在约50pm至5nM之间。对cynoBCMA的亲和
力被发现在约2nM至20nM之间(克隆很少落在该范围之外,参见图17)。
生34个VH/VL组合。测量HEK‑huBCMA细胞上的结合亲和力(图18和表2E)。据发现,抗体Mab
21、Mab 22、Mab 27、Mab 39和Mab 42与HEK细胞上huBCMA的结合与Mab 83A10与huBCMA‑HEK
细胞的结合相比无显著改进。然而,Mab 21、Mab 22、Mab 27、Mab 33、Mab 39和Mab 42的选
择是由于其整体性质,如对huBCMA、cynoBCMA的亲和力,通过流式细胞术测定的作为双特异
性抗体与BCMA阳性多发性骨髓瘤细胞系H929、L363和RPMI‑8226的结合,杀死骨髓瘤细胞
H929、L363和RPMI‑8226的效力,杀死患者骨髓抽吸物的存活的骨髓瘤浆细胞的效力,以及
在食蟹猴中的药代动力学(PK)和药效动力学(杀死BCMA阳性细胞)数据。
JJN‑3)上评估BCMA表达。将NCI‑H929细胞((H929) CRL‑9068 )在具有10‑20%热
灭活的FCS的80‑90%RPMI 1640中培养,并且可含有2mM L‑谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和50μM
巯基乙醇。在含有90%RPMI 1640和10%热灭活FCS的培养基中培养RPMI‑8226细胞((RPMI)
TM
CCL‑155 )。在经改良含有2mM L‑谷氨酰胺、10mM HEPES、1mM丙酮酸钠、4500mg/L
葡萄糖和1500mg/L碳酸氢钠和15%热灭活的FCS的RPMI‑1640培养基中培养U266B1((U266)
TM
TIB‑196 )细胞。在85%RPMI 1640和15%热灭活的FCS中培养L‑363细胞系
(Leibniz Institute DSMZ–德国微生物和细胞培养物保藏中心(German collection
ofmicroorganisms and cell cultures);DSMZ No.ACC 49)。在40%杜尔贝科氏MEM
(Dulbecco’s MEM)+40%伊斯科夫氏MDM(Iscove’s MDM)+20%热灭活的FBS中培养JJN‑3细
胞系(DSMZ No.ACC 541)。简而言之,将细胞收集、洗涤,进行存活力计数,以50,000个细胞/
孔重悬于96孔圆底板中,并在4℃下与10μg/ml抗人BCMA抗体(Abcam,#ab54834,小鼠IgG1)
一起温育30分钟(防止内化)。使用小鼠IgG1作为同种型对照(BD Biosciences,#554121)。
然后离心细胞(以350×g,5分钟),洗涤两次,并在4℃下与FITC缀合的抗小鼠二抗一起温育
30分钟。在温育时间结束时,离心细胞(350×g,5分钟),用FACS缓冲液洗涤两次,重悬于
100ul FACS缓冲液中,并在运行FACS Diva软件的CantoII装置上分析。通过QIFIKIT分析
(Dako,#K0078,按照制造商的说明书)评估H929、RPMI‑8226和U266B1骨髓瘤细胞系的表面
膜上BCMA受体数量的相对定量。H929细胞以最高密度表达人BCMA,比其它骨髓瘤细胞高最
多5‑6倍。与U266和L363(中/低BCMA‑表达的骨髓瘤细胞)、RPMI‑8226(低BCMA‑表达的骨髓
瘤细胞)和JJN‑3(极低BCMA‑表达的骨髓瘤细胞)相比,H929被视为高BCMA‑表达的骨髓瘤细
胞系。表3汇总了每个实验(n=5)的人多发性骨髓瘤细胞系的细胞表面上的相对BCMA受体
数量。
0.005%表面活性剂P20,Biacore,Freiburg/Germany)在Biacore T200上进行。确定了抗
BCMA抗体和重组BCMA Fc(kih)(人和食蟹猴)之间相互作用的亲合力。生物素化的重组人和
食蟹猴BCMA Fc(kih)按照说明书(Biacore,Freiburg/Germany)直接偶联在SA芯片上。固定
化水平在200至700RU的范围内。使抗BCMA抗体以2倍浓度范围(1.95至500nM)以30μL/min的
流速经120秒通过流动池。监测解离180秒。通过减去在参考流动池上获得的响应来校正本
体折射率差值(bulk refractive index differences)。此处,如标准胺偶联试剂盒中所
述,使抗BCMA抗体流经过预先活化和失活的空表面。使用Biacore T200评价软件(vAA,
BiacoreAB,Uppsala/Sweden)得出表观动力学常数,以通过数值积分拟合1:1朗缪尔结合的
速率方程,尽管存在出于比较目的的相互作用二价性。还确定了抗BCMA抗体和重组人
BCMAFc(kih)之间相互作用的亲和力。在pH5.0下使用标准胺偶联试剂盒(Biacore,
Freiburg/Germany)将抗人Fab抗体(GE Healthcare)直接偶联在CM5芯片上。固定化水平为
约6500RU。在25nM下捕获抗BCMA抗体90秒。使重组人BCMA Fc(kih)以4倍浓度范围(1.95至
500nM)以30μL/min的流速通过流动池达120秒。监测解离120秒。通过减去在参考流动池上
获得的响应来校正本体折射率差值。此处,使重组BCMA流经含固定化抗人Fab抗体的表面,
但在其上注射了HBS‑EP而不是抗BCMA抗体。使用Biacore T100评价软件(vAA,BiacoreAB,
Uppsala/Sweden)得出动力学常数,以通过数值积分拟合1:1朗缪尔结合的速率方程(表4)。
BCMA的亲和力除以对人BCMA的亲和力,且意味着BCMA抗体以相较于至食蟹猴BCMA的x倍结
合亲和力结合至人BCMA,其中x=cyno/hu差距值。结果示于表5中。
构域VH,其包含SEQ ID NO:1、2和3的重链CDR,分别为重链CDR1、CDR2和CDR3;和可变结构域
VL,其包含SEQ ID NO:4、5和6的轻链CDR,分别为轻链CDR1、CDR2和CDR3。优选地,抗体包含
SEQ ID NO:7(VH)和SEQ ID NO:8(VL)的可变结构域。将如上所述的抗‑CD3抗体用于产生以
下实施例使用的T细胞双特异性抗体。
上述抗CD3抗体的重链和轻链的四条蛋白质链。为了使具有错配重链(例如具有抗CD3抗体
的两条重链)的副产物的形成最小化,使用突变异二聚体Fc区,其携带“钮入孔突变”和工程
化二硫键,如WO2009080251和WO2009080252所述。为了使具有错配轻链(例如具有抗BCMA抗
体的两条轻链)的副产物的形成最小化,使用WO2009080251和WO2009080252所述的方法将
CH1×恒定κ交叉应用于抗CD3抗体的重链和轻链。
将优先地结合至肿瘤靶标BCMA并且避免CD3抗体下沉,因此药物暴露集中于肿瘤的可能性
更高。
抗BCMA IgG1抗体的完整Fab(重链VH和CH1结构域加上轻链VL和CL结构域)的cDNA以及抗
CD3VH和VLcDNA用作起始材料。对于每个双特异性抗体,分别涉及具有Fc区的包含对应的抗
BCMA抗体的重链和轻链以及上述抗CD3抗体的重链和轻链的四条蛋白质链。
学方法产生的融合cDNA,诸如剪接‑重叠‑延伸PCR,其编码由以下组成的融合蛋白:(以N‑末
端至C‑末端的顺序)分泌性前导序列,上述对应的抗BCMA抗体的Fab(VH,其后是CH1结构
域),具有序列Gly‑Gly‑Gly‑Gly‑Ser‑Gly‑Gly‑Gly‑Gly‑Ser的柔性甘氨酸(Gly)‑丝氨酸
(Ser)接头,上述对应的抗BCMA抗体的Fab(VH,其后是CH1结构域),具有序列Gly‑Gly‑Gly‑
Gly‑Ser‑Gly‑Gly‑Gly‑Gly‑Ser的柔性甘氨酸(Gly)‑丝氨酸(Ser)接头,上述抗CD3抗体的
VH和人轻链cDNA的恒定κ结构域,c)通过标准分子生物学方法产生的融合cDNA,诸如剪接‑
重叠‑延伸PC,其编码由(以N‑末端至C‑末端的顺序)分泌性前导序列、上述抗CD3抗体的VL、
人IgG1cDNA的恒定CH1结构域组成的融合蛋白。使用上述用于产生人或人源化IgG1抗体的
方法共转染哺乳动物细胞和抗体产生和纯化,具有一个修改:为了纯化抗体,第一捕获步骤
不使用蛋白A进行,而是使用填充有结合至人κ轻链恒定区(诸如KappaSelect(GE
Healthcare Life Sciences))的树脂的亲和色谱柱进行。此外,可以包括二硫化物以提高
稳定性和产率以及形成离子桥并提高异源二聚化产率的另外的残基(EP 1870459A1)。
由重链和轻链组成的Fab片段,各自包含可变区和恒定区。至少一个Fab片段是“Crossfab”
片段,其中Fab重链和轻链的恒定结构域被交换。Fab片段内的重链和轻链恒定结构域交换
确保不同特异性的Fab片段不具有相同的结构域排列,因此不交换轻链。双特异性分子设计
对于CD3是单价的,且对于其中一个Fab片段与内部CrossFab(2+1)的N‑末端融合的BCMA是
二价的。双特异性分子含有Fc部分以具有更长的半衰期。图1‑3给出了构建体的示意性图
示;表2A示出了优选的构建体的序列。通过使用聚合物基‑溶液将用哺乳动物表达载体共转
染悬浮液中生长的HEK293EBNA细胞来产生分子。对于2+1CrossFab‑IgG构建体的制备,用对
应的表达载体以1:2:1:1的比率(“载体Fc(钮)”:“载体轻链”:“载体轻链CrossFab”:“载体
重链CrossFab”)转染细胞。
HEK293‑EBNA细胞以1.5Mio存活细胞/mL接种于补充有6mM L‑谷氨酰胺的Ex‑Cell培养基
中。对于每毫升的最终产物体积,将2.0Mio存活细胞离心(以210×g离心5分钟)。吸出上清
液并将细胞重悬于100μL CD CHO培养基中。通过在100μL CD CHO培养基中混合1μg DNA(比
例重链:修饰的重链:轻链:修饰的轻链=1:1:2:1)来制备每毫升最终产物体积的DNA。在加
入0.27μL聚合物基的溶液(1mg/mL)后,将混合物涡旋15秒,并在室温下放置10分钟。在10分
钟后,将重悬的细胞和DNA/聚合物基‑溶液混合物放置在一起,然后转移到适当的容器中,
将该容器置于振荡装置中(37℃,5%CO2)。在3小时温育时间后,对每毫升最终产物体积加
入800μL补充有6mM L‑谷氨酰胺、1.25mM丙戊酸和12.5%Pepsoy(50g/L)的Ex‑Cell培养基。
在24小时后,每毫升最终产物体积加入70μL进料溶液。在7天后或当细胞存活力等于或小于
70%时,通过离心和无菌过滤将细胞与上清液分离。通过亲和步骤和一个或两个精细纯化
(polishing)步骤,即阳离子交换色谱和尺寸排阻色谱来纯化抗体。当需要时,使用另外的
精细纯化步骤。
通过使用20mM磷酸钠、100mM氯化钠、100mM甘氨酸pH 3.0分步洗脱,从柱上洗脱抗体。将具
有所需抗体的级分立即用0.5M磷酸钠pH 8.0(1:10)中和,汇集并通过离心浓缩。将浓缩物
无菌过滤,并通过阳离子交换色谱和/或尺寸排阻色谱进一步处理。
洗涤缓冲液(分别为20mM磷酸钠、20mM柠檬酸钠、20mM TRIS pH5.0和20mM磷酸钠、20mM柠檬
酸钠、20mM TRIS、100mM氯化钠pH5.0)两次洗涤步骤后,使用20mM磷酸钠、20mM柠檬酸钠、
20mM TRIS、100mM氯化钠pH8.5梯度洗脱蛋白质。将含有所需抗体的级分汇集,通过离心浓
缩,无菌过滤并进一步进行尺寸排阻步骤。
有单体的级分汇集,通过离心浓缩,并无菌过滤到无菌小瓶中。
酸单盐酸盐、0.02%(w/v)叠氮化钠pH6.7缓冲液中测定最终蛋白质制剂的纯度和单体含
量。
PNGaseF(ProZyme)处理构建体。因此,通过以0.5mg/ml的浓度将2μl 2M Tris加入20μg蛋白
质来将蛋白质溶液的pH调节至pH7.0。加入0.8μg PNGaseF并在37℃下温育12小时。然后进
行LC‑MS在线检测。LC‑MS方法在偶联至TOF 6441质谱仪(Agilent)的Agilent HPLC 1200上
进行。色谱分离在MachereyNagel Polysterene柱;RP1000‑8(8μm粒度,4.6×250mm;产品目
录号719510)上进行。洗脱液A为5%乙腈和0.05%(v/v)甲酸水溶液,洗脱液B为95%乙腈、
5%水和0.05%甲酸。流速为1ml/分钟,在40℃下进行分离,并如上所述处理获得6μg(15μl)
蛋白质样品。
裂电压和700至3200m/z的质量范围采集。MS数据通过仪器软件从4至17分钟采集。
色谱(SEC)纯化步骤应用于83A10‑TCB抗体得到<30%的纯度和82.8%的单体含量(A)。当另
外的纯化步骤(包括阳离子交换色谱(cIEX)和最终尺寸排阻色谱(re‑SEC)步骤)应用于(A)
中的最终蛋白制剂时,纯度增加至93.4%,但单体含量保持相同且产率显著降低至0.42mg/
L。然而,当比电荷修饰应用于83A10抗BCMAFab CL‑CH1(即83A10‑TCBcv抗体)时,已观察到
TCB分子的优异产生/纯化特征,如纯度为95.3%、单体含量为100%以及产率高达3.3mg/L
所证明,即使当与(B)相比,PA+cIEX+SEC纯化步骤应用于(C)时,产生/纯化曲线显示出7.9
倍低产率和17.2%低单体含量,尽管包括另外的re‑SEC纯化步骤。
是如图2a所述的分子形式。如图11所示,在每个纯化步骤后并排测定和比较83A10‑TCB和
83A10‑TCBcv抗体的性质,1)仅PA亲和色谱(A、B),2)PA亲和色谱,然后是SEC(C、D)以及3)PA
亲和色谱,然后是SEC,然后是cIEX和re‑SEC(E、F)。EP14179705(以引用的方式并入)的图11
示出了83A10‑TCB和83A10‑TCBcv抗体的各自纯化方法后最终蛋白质溶液的CE‑SDS(非还原
性)图。如EP14179705(以引用的方式并入)的图11A和11B所示,在仅通过PA亲和色谱纯化
后,已观察到电荷变体应用于TCB抗体的改进。在该头对头研究中,PA亲和色谱纯化步骤应
用于83A10‑TCB抗体得到61.3%的纯度、26.2mg/L的产率和63.7%的单体含量(11A)。相比
之下,当通过PA亲和色谱纯化83A10‑TCBcv抗体时,所有性质都得到改善,纯度更高,为
81.0%,产率更高,为51.5mg/L,且单体含量为68.2%(11B)。如EP14179705(以引用的方式
并入)的图12A和12B所示,当另外的SEC纯化步骤应用于最终蛋白质制剂时,83A10‑TCB获得
了69.5%的纯度,14.1mg/L的产率和74.7%的单体含量(C),相比之下,83A10‑TCBcv的纯度
和单体含量分别高达91.0%和83.9%且产率为10.3mg/L(D)。尽管在该特定实验中83A10‑
TCBcv的产率比83A10‑TCB稍低(即27%更低),但是83A10‑TCBcv的正确分子的百分比比
83A10‑TCB高得多,分别为90%对比于40‑60%,如LC‑MS所测量。在第三次头对头比较中,仅
在PA亲和色谱纯化步骤后,将来自EP14179705(以引用的方式并入)的图11C和11D的83A10‑
TCB和83A10‑TCBcv最终蛋白质制剂,与大约1L(等体积)的来自另一个纯化批次(相同的产
生)的各自最终蛋白质制剂汇集。然后通过cIEX和SEC纯化方法进一步纯化汇集的蛋白质制
剂。如EP14179705(以引用的方式并入)的图11E和11F所示,当与不具有电荷变体的TCB抗体
比较时,始终观察到具有电荷变体的TCB抗体的产生/纯化特征的改善。在几个步骤的纯化
方法(即PA+/‑SEC+cIEX+SEC)用于纯化83A10‑TCB抗体后,纯度仅达到43.1%,且单体含量
可达到98.3%,但不利的是产率降低至0.43mg/L。如通过LC‑MS测量的正确分子的百分比仍
然很差,为60‑70%。最后,最终蛋白质制剂的质量对于体外用途是不可接受的。与此形成鲜
明对比的是,当具有相同时序的多个相同纯化步骤应用于83A10‑TCBcv抗体时,达到96.2%
的纯度和98.9%的单体含量以及95%的正确分子,如LC‑MS所测量。然而,在cIEX纯化步骤
后,产率也大大降低至0.64mg/L。结果显示,更好的纯度、更高的单体含量,更高的正确分子
百分比以及更好的产率可以仅在两个标准纯化步骤(即PA亲和色谱和SEC(EP14179705的图
11D))后通过83A10‑TCBcv抗体实现,而此类性质不能用83A10‑TCB实现,即使在应用另外的
纯化步骤时(EP14179705的图11E)。
83A10‑TCB相较于83A10‑TCVcv的性质。EP14179705(以引用的方式并入)的表14汇总了在PA
和SEC加上单独PA其后是cIEX和re‑SEC纯化步骤后83A10‑TCB相较于83A10‑TCVcv的性质。
对于EP14179705(以引用的方式并入)的表12至14,粗体的值突出显示了83A10‑TCB相对于
83A10‑TCVcv之间比较的优异性质。除了一个例外(即产率或含量(yield respectively
amount),参见EP14179705(以引用的方式并入)的表13),其可能不具有代表性,对于从3个
头对头比较实验获得的所有产生/纯化参数和值,83A10‑TCBcv优于83A10‑TCB。总体结果清
晰地表明,产生/纯化特征的优点可以通过将CL‑CH1电荷修饰应用于TCB抗体来实现,并且
仅需要两个纯化步骤(即PA亲和色谱和SEC)来已经实现具有非常良好可开发性性质的高质
量蛋白制剂。基于83A10‑TCBcv的改进的产生/纯化特性,以与83A10‑TCBcv类似的方式,使
用电荷变体产生21‑TCBcv、22‑TCBcv、27‑TCBcv、33‑TCBcv、39‑TCBcv和42‑TCBcv。
异性抗体的产生/纯化特征
BCMA的人胃腺癌细胞系)用作阴性对照。简而言之,将培养的细胞收集,计数并使用ViCell
评价细胞存活力。然后在含有BSA的FACS染色缓冲液(BD Biosciences)中将存活细胞调整
6
至2×10个细胞/ml。将100μl该细胞悬浮液进一步等分到圆底96孔板中的每个孔,并在4℃
下与30μl抗BCMA抗体或对应的IgG对照一起温育30分钟。滴定所有抗BCMA/抗CD3 TCB抗体
(和TCB对照)并在1–300nM之间终浓度范围内进行分析。然后将细胞离心(5分钟,350×g),
用120μl/孔FACS染色缓冲液(BD Biosciences)洗涤,重悬并在4℃下与荧光染料缀合的PE
缀合AffiniPure F(ab’)2片段山羊抗人IgG Fc片段特异性(Jackson Immuno Research
Lab;109‑116‑170)一起再温育30分钟。然后用染色缓冲液(BD Biosciences)洗涤细胞两
次,每个孔使用100μl BD固定缓冲液(#BD Biosciences,554655)在4℃下固定20分钟,重悬
于120μl FACS缓冲液中并使用BD FACS CantoII进行分析。如适用,使用Prism GraphPad
(LaJolla,CA,USA)计算EC50,并且EC50值表示达到抗BCMA/抗CD3 TCB抗体与H929细胞、
L363细胞和RPMI‑8226细胞结合的最大结合的50%所需的抗体浓度,分别汇总于表8、表9和
表10中。Asterix表示估计的EC50值,如由Prism软件推导和计算。不能估计21‑TCBcv与L363
细胞结合和22‑TCBcv与RPMI‑8226细胞结合的EC50值。
之,从血沉棕黄层分离人类PBMC,并将30万个细胞/孔涂布于圆底96孔板中。或者,将来自健
康供体的280μl全血涂布于深孔96孔板的每个孔中。加入BCMA阳性肿瘤靶细胞以获得10:1
的最终E:T比率。加入抗BCMA/抗CD3 TCB抗体和对照,终浓度为0.1pM–10nM。在37℃、5%CO2
温育最多24小时后,将测定板以350×g离心5分钟,并将上清液转移到新的深孔96孔板中进
行后续分析。根据制造商的说明书使用人Th1/Th2细胞因子试剂盒II(BD#551809)或以下
CBA Flex组的组合在FACS CantoII上进行CBA分析:人颗粒酶B(BD#560304)、人IFN‑γ
Flex组(BD#558269)、人TNF‑αFlex组(BD#558273)、人IL‑10Flex组(BD#558274)、人IL‑
6Flex组(BD#558276)、人IL‑4Flex组(BD#558272)、人IL‑2Flex组(BD#558270)。表13示出了
83A10‑TCBcv诱导细胞因子产生和丝氨酸蛋白酶颗粒酶B(细胞毒性T细胞功能的标记物)的
浓度依赖性增加。表11示出了每个抗BCMA/抗CD3 T细胞双特异性抗体浓度的EC50值和分泌
的细胞因子/蛋白酶的量。
达‑H929多发性骨髓瘤靶细胞通过细胞解离缓冲液收集,洗涤并重悬于补充有10%胎牛血
清(Invitrogen)的RPMI中。将大约30,000个细胞/孔涂布于圆底96孔板中,并加入各种稀释
度的构建体达到所需的最终浓度(一式三份);终浓度在0.1pM至10nM的范围内。对于适当的
比较,将所有TCB构建体和对照调整至相同的摩尔浓度。将人PBMC(效应子细胞)加入孔中以
获得10:1的最终E:T比率,对应于1个肿瘤靶细胞对约3至5个T细胞的E:T比率。阴性对照组
仅以效应子细胞或靶细胞表示。对于标准化,通过终浓度为1%的Triton X‑100温育靶细
胞,诱导细胞死亡来确定H929MM靶细胞的最大裂解(=100%)。最小裂解(=0%)仅以与效
应子细胞(即不含任何T细胞双特异性抗体)共温育的靶细胞表示。在37℃、5%CO2中温育
20‑24小时或48小时后,按照制造商的说明书,使用LDH检测试剂盒(RocheApplied
Science)测量从凋亡/坏死MM靶细胞到上清液中的LDH释放。在浓度‑响应曲线中,将LDH释
放的百分比对抗BCMA/抗CD3 T细胞双特异性抗体的浓度作图。将EC50值使用Prism软件
(GraphPad)测量,并确定为导致50%最大LDH释放的TCB抗体浓度。如图4所示,所有抗BCMA/
抗CD3TCB抗体(21‑、22‑、42‑和83A10‑TCBcv)诱导BCMA‑阳性H929骨髓瘤细胞的浓度依赖性
杀死,如通过LDH释放所测量。H929细胞的裂解是特异性的,因为即使在最高测试浓度下,对
照TCB抗体(不结合至BCMA阳性靶细胞但仅结合至T细胞上的CD3)也不诱导LDH释放。表12汇
总了由抗BCMA/抗CD3 TCB抗体诱导的BCMA高‑表达的H929细胞的重导向T细胞杀死的EC50
值。
中/低表达的L363多发性骨髓瘤靶细胞用细胞解离缓冲液收集,洗涤并重悬于补充有10%
胎牛血清(Invitrogen)的RPMI中。将大约30,000个细胞/孔涂铺于圆底96孔板中,并加入各
稀释度的构建体达到所需的最终浓度(一式三份);终浓度在0.1pM至10nM的范围内。对于适
当的比较,将所有TCB构建体和对照调整至相同的摩尔浓度。将人PBMC(效应子细胞)加入孔
中以获得10:1的最终E:T比率,对应于1个肿瘤靶细胞对约3至5个T细胞的E:T比率。阴性对
照组仅以效应子或靶细胞表示。对于标准化,通过终浓度为1%的Triton X‑100温育靶细
胞,诱导细胞死亡来确定MM靶细胞的最大裂解(=100%)。最小裂解(=0%)仅以与效应子
细胞(即不含任何T细胞双特异性抗体)共温育的靶细胞表示。在37℃、5%CO2中温育20‑24
小时后,然后按照制造商的说明书使用LDH检测试剂盒(RocheApplied Science)测量从凋
亡/坏死MM靶细胞到上清液中的LDH释放。在浓度‑响应曲线中将LDH释放的百分比对抗
BCMA/抗CD3 T细胞双特异性抗体的浓度作图。使用Prism软件(GraphPad)测定EC50值,并确
定为导致50%最大LDH释放的TCB抗体浓度。如图5所示,所有抗BCMA/抗CD3 TCB抗体(21‑、
22‑、42‑和83A10‑TCBcv)诱导BCMA阳性L363骨髓瘤细胞的浓度‑依赖性杀死,如通过LDH释
放所测量。L363细胞的裂解是特异性的,因为即使在最高测试浓度下,对照TCB抗体(不结合
至BCMA阳性靶细胞但仅结合至T细胞上的CD3也不诱导LDH释放。表13汇总了由抗BCMA/抗
CD3 TCB抗体诱导的BCMA中/低表达的L363细胞的重导向T细胞杀死的EC50值。
低表达的L363多发性骨髓瘤靶细胞用细胞解离缓冲液收集,洗涤并重悬于补充有10%胎牛
血清(Invitrogen)的RPMI中。将大约30,000个细胞/孔涂铺于圆底96孔板中,并加入各种稀
释度的构建体达到所需的最终浓度(一式三份);终浓度在0.1pM至10nM的范围内。对于适当
的比较,将所有TCB构建体和对照调整至相同的摩尔浓度。将人PBMC(效应子细胞)加入孔中
以获得10:1的最终E:T比率,对应于1个肿瘤靶细胞对约3至5个T细胞的E:T比率。阴性对照
组仅以效应子或靶细胞表示。对于标准化,通过终浓度为1%的Triton X‑100温育靶细胞,
诱导细胞死亡来确定MM靶细胞的最大裂解(=100%)。最小裂解(=0%)仅以与效应子细胞
(即不含任何T细胞双特异性抗体)共温育的靶细胞表示。在37℃、5%CO2中温育20‑24小时
后,然后按照制造商的说明书使用LDH检测试剂盒(Roche Applied Science)测量从凋亡/
坏死MM靶细胞到上清液中的LDH释放。在浓度‑响应曲线中将LDH释放的百分比对抗BCMA/抗
CD3 T细胞双特异性抗体的浓度作图。使用Prism软件(GraphPad)测定EC50值,并确定为导
致50%最大LDH释放的TCB抗体浓度。如图6所示,所有抗BCMA/抗CD3 TCB抗体(21‑、22‑、42‑
和83A10‑TCBcv)诱导BCMA‑阳性RPMI‑8226骨髓瘤细胞的浓度依赖性杀死,如通过LDH释放
所测量。RPMI‑8226细胞的裂解是特异性的,因为即使在最高测试浓度下,对照TCB抗体(不
结合至BCMA阳性靶细胞但仅结合至T细胞上的CD3)也不诱导LDH释放。表13汇总了由抗
BCMA/抗CD3 TCB抗体诱导的BCMA中/低表达的RPMI‑8226细胞的重导向T细胞杀死的EC50
值。
达的JJN‑3多发性骨髓瘤靶细胞用细胞解离缓冲液收集,洗涤并重悬于补充有10%胎牛血
清(Invitrogen)的RPMI中。将大约30,000个细胞/孔涂铺于圆底96孔板中,并加入各种稀释
度的构建体达到所需的最终浓度(一式三份);终浓度在0.1pM至10nM的范围内。对于适当的
比较,将所有TCB构建体和对照调整至相同的摩尔浓度。将人PBMC(效应子细胞)加入孔中以
获得10:1的最终E:T比率,对应于1个肿瘤靶细胞对约3至5个T细胞的E:T比率。阴性对照组
仅以效应子或靶细胞表示。对于标准化,通过终浓度为1%的Triton X‑100温育靶细胞,诱
导细胞死亡来确定MM靶细胞的最大裂解(=100%)。最小裂解(=0%)仅以与效应子细胞
(即不含任何T细胞双特异性抗体)共温育的靶细胞表示。i)在37℃、5%CO2中温育48小时
后,将培养的骨髓瘤细胞收集,洗涤并用荧光染料缀合的抗体和膜联蛋白‑V染色,以确定凋
亡的骨髓瘤细胞。染色组包括CD138‑APCC750/CD38‑FITC/CD5‑BV510/CD56‑PE/CD19‑
PerCP‑Cy7/CD45‑V450/膜联蛋白‑V‑PerCP‑Cy5.5。所用的荧光染料标记的抗体购自BD
Biosciences(San Jose,CA)和Caltag Laboratories(San Francisco CA)。使用多色流式
细胞仪和安装的软件(例如运行FACS Diva软件的CantoII装置或使用CellQUEST软件的
FACSCalibur流式细胞仪)进行采集。使用Paint‑A‑Gate PRO程序(BD Biosciences)进行数
据分析。测量JJN‑3细胞上的膜联蛋白‑V,并将膜联蛋白‑v‑阳性JJN‑3细胞的百分比对抗
BCMA/抗CD3 T细胞双特异性抗体的浓度作图。由特定浓度的抗BCMA/抗CD3 T细胞双特异性
抗体诱导的JJN‑3细胞的裂解百分比也通过以下步骤确定:测量给定TCB浓度下膜联蛋白‑
V‑阴性JJN‑3细胞的绝对计数,并将其从无TCB的膜联蛋白‑V‑阴性JJN‑3细胞的绝对计数中
减去;除以无TCB的膜联蛋白‑V‑阴性JJN‑3细胞的绝对计数。图7示出了抗BCMA/抗CD3 TCB
抗体(22‑、42‑和83A10‑TCBcv)诱导BCMA低表达JJN‑3骨髓瘤细胞的浓度依赖性杀死,如通
过流式细胞术所测量。JJN‑3细胞的裂解是特异性的,因为即使在最高测试浓度下,对照TCB
抗体(不结合至BCMA阳性靶细胞但仅结合至T细胞上的CD3)也不诱导膜联蛋白‑v阳性JJN‑3
细胞的增加或JJN‑3细胞裂解。表14和表15分别汇总了由抗BCMA/抗CD3 TCB抗体诱导的膜
联蛋白‑v阳性JJN‑3细胞的百分比和JJN‑3细胞的裂解百分比。
清液中的LDH释放。在浓度‑响应曲线中,将LDH释放的百分比对抗BCMA/抗CD3 T细胞双特异
性抗体的浓度作图。使用Prism软件(GraphPad)测量EC50值,并确定为导致50%最大LDH释
放的TCB抗体浓度。
排序。然而,尽管易于获得和实用的人骨髓瘤细胞系,但具有不能代表多发性骨髓瘤异质性
的警告,多发性骨髓瘤是非常复杂的疾病,其特征在于在分子水平上具有显著的异质性。此
外,骨髓瘤细胞系不以相同的强度和密度表达BCMA受体,因为一些细胞表达BCMA比其它细
胞更强(例如H929细胞相对于RPMI‑8226细胞),并且在不同的患者中也可观察到此类细胞
水平上的异质性。在与多发性骨髓瘤的关键意见领袖进行的学术合作中,正在研究测定患
者样品中的BCMA表达和密度以及使用临床患者样品评价抗BCMA/抗CD3 TCB抗体。根据当地
伦理委员会指导方针和赫尔辛基宣言(Declaration of Helsinki),在给出知情同意后,从
多发性骨髓瘤患者收集血液和骨髓抽吸物。
6
对总共2×10 个细胞/管进行染色,裂解,然后使用直接免疫荧光技术和多色染色进行洗
+ + + ‑ +
涤,其目的在于鉴定为CD138CD38CD45CD19CD56的恶性浆细胞的特异性鉴定和免疫表型
表征。然后使用一个荧光染料缀合的抗体组(包括至少CD38‑FITC/CD56‑PE/CD19‑PerCP‑
Cy7/CD45‑V450/BCMA‑APC)对细胞进行染色。所用的荧光染料标记的抗体购自BD Bio
sciences(San Jose,CA)和Caltag Laboratories(San Francisco CA)。在免疫表型分析中
使用内部APC缀合的抗人BCMA抗体。使用多色流式细胞仪和安装的软件(例如运行FACS
Diva软件的CantoII装置或使用CellQUEST软件的FACSCalibur流式细胞仪)进行采集。使用
Paint‑A‑Gate PRO程序(BD Biosciences)进行数据分析。测量并门控恶性浆细胞群的BCMA
表达,并测定骨髓瘤患者的平均荧光强度(MFI)值并进行比较。
(BioLegend#357502)或小鼠IgG2a同种型对照(BioLegend#401501)(在FACS缓冲液(PBS,
0.1%BSA)中稀释至最终浓度为25μg/ml(或饱和浓度))染色,并且染色在4℃下在黑暗中进
行30分钟。接着,将100μl的设置或校准珠粒加入单独的孔中,并将细胞以及珠粒用FACS缓
冲液洗涤两次。将细胞和珠粒重悬于25μl FACS缓冲液中,所述缓冲液含有由Qifikit提供
的荧光素缀合的抗小鼠二抗(在饱和浓度下)。将细胞和珠粒在4℃下在黑暗中染色45分钟。
将细胞洗涤一次,并将所有样品重悬于100μl FACS缓冲液中。立即在多色流式细胞仪和安
装的软件(例如运行FACS Diva软件的CantoII装置或使用CellQUEST软件的FACSCalibur流
式细胞仪)上分析样品。
的重导向T细胞杀死。为了评价抗BCMA/抗CD3 TCB抗体诱导骨髓骨髓瘤浆细胞的重导向T细
胞杀死的效应,将全骨髓抽吸物从多发性骨髓瘤患者收集到EDTA涂布的管中并立即用于细
胞培养测定。通过流式细胞术确定和测量全骨髓样品中存在的效应子细胞与肿瘤细胞的比
率(E:T比率)。简而言之,将200μl骨髓样品转移到96孔深孔板中。在无菌培养基中制备抗
BCMA/抗CD3 TCB抗体和对照抗体稀释液,并将10μl制剂加入各孔中,终浓度在0.1pM至30nM
的范围内。通过轻轻振荡混合骨髓‑抗体悬浮液,然后在37℃、5%CO2下温育48小时,用石蜡
膜密封。在温育期间后,将20μl基于抗体组(包括CD138‑APCC750/CD38‑FITC/CD5‑BV510/
CD56‑PE/CD19‑PerCP‑Cy7/CD45‑V450/BCMA‑APC/膜联蛋白‑V‑PerCP‑Cy5.5)制备的对应
FACS抗体溶液加入96孔U型底平板。荧光染料标记的抗体购自BD Biosciences(San Jose,
CA)和Caltag Laboratories(San Francisco CA),并使用内部APC缀合的抗人BCMA抗体。然
后将样品在室温下在黑暗中温育15分钟,并使用多色流式细胞仪进行采集和分析。通过评
+ + + ‑ +
价骨髓瘤细胞群CD138CD38CD45CD19CD56上门控的膜联蛋白‑V阳性表达来确定骨髓瘤
细胞的细胞死亡。然后确定骨髓瘤细胞死亡的百分比。由特定浓度的抗BCMA/抗CD3 T细胞
双特异性抗体诱导的患者骨髓瘤浆细胞的裂解百分比也通过以下步骤确定:测量给定TCB
浓度下膜联蛋白‑V阴性骨髓瘤浆细胞的绝对计数,并将其从无TCB的膜联蛋白‑V‑阴性骨髓
瘤浆细胞的绝对计数中减去;除以无TCB的膜联蛋白‑V‑阴性骨髓瘤浆细胞的绝对计数。为
了验证抗BCMA/抗CD3 T细胞双特异性抗体的特异性,还在其它骨髓细胞类型诸如T细胞、B
细胞和NK细胞中测量膜联蛋白‑V表达。如图8所示,患者骨髓瘤浆细胞存在浓度依赖性和特
异性裂解,而未观察到T细胞、B细胞和NK细胞的裂解。此外,对照TCB(仅结合至CD3而不结合
至BCMA)在最高浓度的TCB抗体下不诱导骨髓瘤浆细胞的细胞死亡。如表18所示,对于42‑
TCBcv和22‑TCBcv,在最高浓度(30nM)下膜联蛋白‑V阳性患者骨髓瘤细胞的百分比分别达
到52.54%和55.72%,相比之下83A10‑TCBcv为29.31%,结论是42‑TCBcv和22‑TCBcv诱导
患者骨髓骨髓瘤浆细胞的杀死比83A10‑TCBcv更强效。
抗体的浓度作图。测量EC50值,并将其确定为导致50%最大存活的骨髓瘤浆细胞的TCB抗体
浓度。在存在各自的抗BCMA/抗CD3 T细胞双特异性抗体的情况下,EMAX(%)被确定为存活
的骨髓瘤浆细胞的最大值。在五个骨髓瘤患者骨髓抽吸物样品的大多数中,83A10‑TCBcv诱
导骨髓瘤浆细胞裂解的效力低于22‑TCBcv和42‑TCBcv得多(表26;图9示出了5名患者中的2
名的示例性浓度响应曲线)。与83A10‑TCBcv的仅1/5患者样品相比,在22‑TCBcv或42‑TCBcv
处理的5/5患者样品中观察到存活的骨髓瘤细胞的浓度依赖性减少。表19示出了83A10‑
TCBcv与22‑TCBcv和42‑TCBcv的比较以及抗BCMA/抗CD3T细胞双特异性抗体对骨髓瘤浆细
胞的存活力的效应。结果清晰地显示,在4/5患者样品中22‑TCBcv和42‑TCBcv存在的存活的
骨髓瘤浆细胞更少(即更多的骨髓瘤骨髓浆细胞裂解),如各自的患者样品中22‑TCBcv和
42‑TCBcv对比83A10‑TCBcv的更低的EMAX(%)值所示。观察到患者骨髓瘤浆细胞的浓度依
赖性和特异性裂解,而未观察到非恶性骨髓细胞的裂解(数据未示出)。
Bergisch Gladbach,Germany)染色,通过自动MACS细胞分离柱,并使用具有足够剩余数量
MM浆细胞(通常>4%的骨髓瘤浆细胞)的收集级分进行另外的实验。在24孔板中,温育和培
养500,000个细胞/孔48小时。将抗BCMA/抗CD3TCB抗体和对照抗体稀释液加入各孔中,且
TCB终浓度为0.1.pM至10nM。每个剂量点一式三份进行。使用流式细胞仪(FACSCalibur;
Becton Dickinson)通过碘化丙啶/CD138‐FITC双染色研究浆细胞和骨髓微环境细胞的存
活力。数据分析使用FACSDiva软件(Becton Dickinson)进行。如图10所示,柱状图示出了对
一式三份各自的培养基对照(MC)的平均值归一化的平均值。对于统计分析,使用单侧t‑检
验。在10nM(IMAX10)浓度下MM浆细胞生长的最大抑制和在1nM(IMAX1)下测量的抑制分别以
百分比给出,称为培养基对照。还示出了与培养基对照相比对照TCB抗体(10nM)的最大抑
制。除IMAX值的计算(Microsoft Microsoft Office Professional 2013)之外,使
用R3.1.19和Bioconductor 2.1310进行计算。如果对应的统计检验的P‑值<5%(*)、<1%
(**)或<0.1%(***),则认为效应具有统计学显著性。如图10A‑10G所示,结果清晰地显示,
与83A10‑TCBcv相比,在7/7患者样品中22‑TCBcv和42‑TCBcv存在的存活的骨髓骨髓瘤浆细
胞更少(即更多的骨髓骨髓瘤浆细胞裂解)。表20示出了相对于培养基对照的由抗BCMA/抗
CD3 T细胞双特异性抗体诱导的患者骨髓抽吸物的存活的骨髓瘤浆细胞的百分比。表21示
出了IMAX10和IMAX1值。结果显示,22‑TCBcv和42‑TCBcv比83A10‑TCBcv明显更有效地诱导
患者骨髓骨髓瘤浆细胞的杀死。尽管骨髓浆细胞(BMPC)的特异性裂解由抗BCMA/抗CD3 T细
胞双特异性抗体诱导并且在所有骨髓患者样品中观察到,但是在各自的样品中骨髓微环境
(BMME)不受影响(图10H,代表7个患者样品)。
IMAX1下的抑制的IMAX10和IMAX1值。
用基于包括八种标记物的抗体组制备的FACS抗体溶液染色:CD8/CD69/TIM‑3/CD16/CD25/
CD4/HLA‑DR/PD‑1。然后将样品在室温下在黑暗中温育15分钟,并使用多色流式细胞仪进行
+ +
采集和分析。通过评价在CD4和CD8T细胞群体上门控的CD25、CD69和/或HLA‑DR阳性表达来
确定T细胞活化。然后测量T细胞活化的百分比。图11示出了来自多发性骨髓瘤患者的骨髓
+ +
浸润性CD4 和CD8 T细胞上的CD69和CD25的浓度依赖性上调。表22汇总了由抗BCMA/抗CD3
+ +
TCB抗体诱导的CD4和CD8T细胞上的CD69和CD25表达增加;数据来自一名患者。
细胞活化和增加的骨髓瘤患者骨髓浸润性CD4和CD8T细胞的功能,在48小时温育后从各自
处理组、未处理组和对照组的培养物收集上清液,并测量细胞因子和丝氨酸蛋白酶的含量。
根据制造商的说明书使用人Th1/Th2细胞因子试剂盒II(BD#551809)或以下CBA Flex组的
组合在多色流式细胞仪上进行细胞因子珠粒阵列(CBA)分析:人颗粒酶B(BD#560304)、人
IFN‑γFlex组(BD#558269)、人TNF‑αFlex组(BD#558273)、人IL‑10Flex组(BD#558274)、人
IL‑6Flex组(BD#558276)、人IL‑4Flex组(BD#558272)、人IL‑2Flex组(BD#558270)。
著优点是长得多的消除半衰期/低得多的体内清除率,其与(scFv)2(需要通过患者携带的
泵施用几个星期至几个月的治疗)非常短的清除半衰期(例如1至4小时)相比,可以允许每
周两次或一次IV或SC施用(Topp等人,J Clin Oncol 2011;29(18):2493‑8)。每周两次或一
次施用对患者来说方便得多,而且风险也小得多(例如泵的故障,导管的问题等)。
认可的CRO进行单剂量药代动力学(PK)药效动力学(PD)研究。使约两岁且体重大约3kg、生
物学上未接触实验的成年食蟹猴适应至少40天,并根据体重、临床观察和临床病理学检查
进行选择。通过个体花纹和颜色编码的笼卡来识别动物。所有动物程序(包括安置、健康监
测、禁食、给药等)和伦理修订根据现行国家立法执行的用于生物医学研究的动物保护指令
进行。将动物根据最近的试验前体重随机分配到处理组。在排除具有不可接受的试验前结
果的动物后,使用 系统(该系统被设计为实现关于试验前体重的平衡)中包括的
计算机程序从两个体重极限值排除动物,并将其余的动物随机分配到处理组。将动物分配
到三个处理组,每个处理组的83A10‑TCBcv(每组n=2只动物,即1只雌性和1只雄性)为
0.003、0.03和0.3mg/kg。动物接受单次i.v.注射83A10‑TCBcv,并且根据以下收集时间表和
程序通过外周静脉收集每个时间点的至少0.8mL血样用于PK评价:给药前,给药后30分钟、
90分钟、180分钟、7小时、24小时、48小时、96小时、168小时、336小时、504小时。使血样在试
管中室温下凝结60分钟,以进行血清分离。通过离心使凝血块旋转沉淀(至少10分钟,
1200g,+4℃)。将所得的血清(约300μL)直接储存在‑80℃下直到进一步分析。根据以下收集
时间表在麻醉/镇痛处理下,还在股骨处收集骨髓样品,用于PK评价:给药前,给药后96小时
和336小时。使骨髓样品在试管中室温下凝结60分钟,以进行血清分离。通过离心使凝血块
旋转沉淀(至少10分钟,1200g,+4℃)。将所得的骨髓(约1mL)直接储存在‑80℃下直到进一
步分析。进行PK数据分析和评价。使用Watson软件包(v 7.4,Thermo Fisher Scientific
Waltman,MA,USA)或Phoenix WinNonlin系统(v.6.3,Certara Company,USA)进行标准非房
室分析。如图12和表23所示,通过ELISA测量在IV注射后不同时间点收集的血清样品的
83A10‑TCBcv的血清浓度。表24示出了如通过ELISA测量的每个处理组的骨髓中83A10‑
TCBcv的浓度(BLQ意指低于定量水平)。
1nM和4nM之间的血浆浓度,表明每周一次剂量为大约0.03mg/kg的疗法可为可行的(200ng/
ml对应于大约1nM)
度,在该浓度下在从MM患者新鲜采集的骨髓抽吸物中观察到MM浆细胞的显著杀死;再次显
示了如每周一次的方便给药间隔的机会
通过流式细胞术进行PD评价,以评价83A10‑TCBcv作为单剂量iv给药对血液和骨髓浆细胞、
B细胞和T细胞的作用。应用表面标记物的“裂解和洗涤”直接免疫荧光染色法。简而言之,将
100μL血液或骨髓在+4℃下在黑暗中与两种抗体混合物一起温育30分钟,该混合物包括
CD45/CD2/CD16/CD20/CD27/CD38或CD45/CD2/CD16/CD4/CD25/CD8。为了裂解红血细胞,将
2mL裂解缓冲溶液加入样品中并在室温下在黑暗中温育15分钟。通过离心收集细胞并用染
色缓冲液(PBS 2%胎牛血清)洗涤。将染色的样品保持冷藏,避光,直到当天用细胞计数器
采集。使用配备有488和635激光线、BD FACS Canto II的Bect on Dickinson流式细胞仪进
行FACS数据采集。使用BD FACSDiva软件进行数据收集和分析。基于通过血液分析仪
TM
(ADVIA 120,Sie mens)获得的WBC计数,使用双平台进行绝对细胞数计数。如图13所示,在
接受83A10‑TCBcv的单剂量IV处理的所有动物中观察到外周T细胞重新分布,如循环T细胞
计数的减少所示。如图14A所示,在已用83A10‑TCBcv 0.3mg/kg处理后24小时,在处理的动
物中观察到血浆细胞(BCMA阳性细胞)减少,而总B细胞(BCMA阴性细胞)未减少。图14b示出
了在食蟹猴中用83A10‑TCBcv 0.3mg/kg处理后血液中浆细胞减少的动力学。
小时、96小时、168小时。将血样放入置于冰水浴中的塑料管中,然后离心(至少10分钟,
1200g,+4℃)。将所得的血浆直接储存在‑80℃下直到分析。细胞因子分析使用多重珠粒‑基
的细胞因子免疫测定(Luminex Technology)进行。使用Bio‑Plex Manager 4.1软件(Bio‑
Rad)分析数据:使用五参数逻辑回归模型(5PL)。
(0.1mg/kg)。在确定的收集时间表后的时间点收集血液和骨髓样品,并相应地处理以进行
PK和PD测量(免疫表型分型和细胞因子产生)。
180分钟、7小时、24小时、48小时、96小时、168小时、336小时、504小时。使血样在试管中在室
温下凝结60分钟,以进行血清分离。通过离心使凝血块旋转沉淀(至少10分钟,1200g,+4
℃)。将所得的血清(约300μL)直接储存在‑80℃下直到进一步分析。根据以下收集时间表在
麻醉/镇痛处理下,在股骨处另外收集骨髓样品,用于PK评价:给药前,给药后96和336小时。
使骨髓样品在试管中在室温下凝结60分钟,以进行血清分离。通过离心使凝血块旋转沉淀
(至少10分钟,1200g,+4℃)。将所得的骨髓(约1mL)直接储存在‑80℃下直到进一步分析。进
行PK数据分析和评价。使用Watson软件包(v 7.4,Thermo Fisher Scientific Waltman,
MA,USA)或Phoenix WinNonlin系统(v.6.3,Certara Company,USA)进行标准非房室分析。
如图19和表24A‑D所示,通过ELISA测量在IV或SC注射后不同时间点收集的血清和骨髓样品
的42‑TCBcv的浓度。多发性骨髓瘤患者骨髓抽吸物中42‑TCBcv的有效浓度范围相当于10pm
至10nM(灰色区域)。括号内浓度以nM计。BLQ,低于定量水平;i/m,不确定的测量。
示出SC注射42‑TCBcv的接近100%的高生物利用率。此外,结果显示骨髓中42‑TCBcv的浓度
与42‑TCBcv血清浓度非常相似。血清中的42‑TCBcv浓度可以很好地代表骨髓中即在骨髓瘤
肿瘤细胞富集的主要位置处具有的42‑TCBcv的浓度。
液的食蟹猴CD20 B细胞也在细胞表面上表达BCMA并且比血液中的浆细胞显著更频繁(更
高的绝对计数)。使用血液B细胞消耗作为抗BCMA/抗CD3 TCBcv抗体的可靠的药效动力学效
应并且用于比较83A10‑TCBcv、42‑TCBcv和22‑TCBcv之间的体内功效。绝对B细胞计数基于
由流式细胞术和血液分析仪获得的WBC计数组成的双平台计算,并在以下时间点测量:给药
前,IV输注10分钟后24小时,48小时,96小时和196小时。B细胞消耗百分比如下计算:
食蟹猴的功效差异可能主要归因于各自的BCMA抗体。
+ +
胞(即靶细胞)富集的骨髓中活化的CD8 细胞毒性T细胞(即效应子细胞)的增加。绝对CD8
+
CD25活化的T细胞计数基于由流式细胞术和用血液分析仪获得的WBC计数组成的双平台计
算
药效动力学效应差异可能主要归因于各自的BCMA抗体。结果表明,骨髓中和血液中BCMA阳
性B细胞的消耗最可能是由抗BCMA/抗CD3 TCBcv抗体诱导的细胞毒性T细胞活化的结果。
和 (如WO 2013072415和WO2013072406所述)的体内效应在PBMC‑人源化
NOG小鼠中的H929人骨髓瘤异种移植物模型中进行比较和评价。NOG小鼠适用于人源化小鼠
模型,因为它们完全缺乏包括驻留NK细胞群的免疫细胞,并因此更容许人异种细胞的肿瘤
植入(Ito等人,Curr T op Microbiol Immunol 2008;324:53‑76)。简而言之,在研究的第0
天(d0),将含有50:50基质胶(BD Biosciences,France)的100μL RPMI 1640培养基中的5×
6 TM
10个人骨髓瘤细胞系NCI‑H929(NCI‑H929,A CRL‑9068 )皮下(SC)注射到8‑10周龄
的免疫缺陷NOD/Shi‑scid IL2rγ(空)(NOG)雌性小鼠(Taconic,Ry,Danemark)的右背侧。
60
在H929肿瘤细胞SC移植前24至72小时,所有小鼠接受γ‑源(1.44Gy, Co,BioMep,Breteniè
7
res,France)全身辐照。在第15天(d15),NOG小鼠接受单次腹膜内(IP)注射2×10人PBMC
(于500μL PBS 1X pH7.4中)。人PBMC的表征通过免疫表型分型(流式细胞术)进行。然后使
用Vivo 软件(Biosystemes,Couternon,France)将小鼠仔细地随机分配到不同的
处理组和对照组(n=9/组),并进行统计检验(方差分析)以测试组间的同质性。在第19天
3
(d19),即在SC注射H929肿瘤细胞后19天,当所有小鼠中的肿瘤体积达到至少100‑150mm时
3
开始抗体处理,其中媒介物处理对照组的平均肿瘤体积为300±161mm ,2.6nM/kg对照TCB
3 3
处理组为315±148mm ,2.6nM/kg 83A10‑TCBcv组为293±135mm ,且2.6nM/kg BCMA50‑
3
(scFv)2( )组为307±138mm 。TCB抗体治疗时间表基于先前通过83A10‑
TCBcv获得的药代动力学结果,并且由每周一次IV施用至多3周(即总共3次注射TCB抗体)组
成。在使用人PBMC(d19)复溶宿主小鼠后四天,通过尾静脉注射给予第一剂量的抗BCMA/抗
CD3 83A10‑TCBcv抗体(2.6nM/kg,分别地,0.5mg/kg)。在83A10‑TCBcv和对照TCBcv处理的
所有组的小鼠中,在每次处理前1小时、第二次处理前2小时和终止时,通过颈静脉/下颌静
脉穿刺(麻醉下)采集血样。立即将血样转移到含促凝剂的管(T MG管,樱桃红色盖,
)中。将管在室温下放置30分钟以允许凝血。然后将管以1,300g离
心5分钟以进行凝血块/血清分离。制备血清等分试样,在液氮中快速冷冻并储存于‑80℃下
直到进一步分析。在研究期间用卡尺测量肿瘤体积(TV),并通过TV的组间比较评价进展。肿
瘤生长百分比定义为TG(%),其通过计算TG(%)=100×(分析组的中值TV)/(对照媒介物
3
处理组的中值TV)来确定。出于伦理原因,当TV达到至少2000mm 时,对小鼠实施安乐死。图
15示出了每个实验组的每只单独小鼠的TV:(A)对照组,包括媒介物对照(实线)和对照TCB
(虚线),(B)83A10‑TCBcv(2.6nM/kg)组,以及(C) (2.6nM/kg)。在83A10‑
TCBcv(2.6nM/kg)组中,9只小鼠中的6只(67%)在d19即第一次TCB处理时显示肿瘤消退甚
至小于TV,并且肿瘤消退维持直到研究结束。在83A10‑TCBcv(2.6nM/kg)处理组中,未能显
3
示肿瘤消退的3只小鼠在d19的TV分别等于376、402和522mm 。相反,在任何时间点,使用等
摩尔剂量的 (2.6nM/kg)以每周一次的时间表处理3周的9只小鼠中没有
一只(0%)具有肿瘤消退。表25示出了所有实验组中肿瘤体积随时间推移的进展。计算d19
至d43的肿瘤生长百分比,并且在83A10‑TCBcv(2.6nM/kg)组和
(2.6nM/kg)之间进行比较(图16)。结果表明,在83A10‑TCBcv(2.6nM/kg)组中,TG(%)持续
和显著降低,并且与BCMA (2.6nM/kg)相比,TG(%)永远更低。表26示出了第19
至43天的中值肿瘤体积(TV)和肿瘤生长百分比(TG(%))。总体结果清晰地表明,当处理以
等摩尔剂量每周一次的时间表给予3周时,83A10‑TCBcv在体内诱导抗肿瘤活性的能力优于
种移植物。简而言之,在研究的第0天(d0),将含有50:50基质胶(BD Biosciences,France)
6 6
的200μL 0.9%NaCl溶液中的10×10‑20×10个人骨髓瘤细胞系RPMI‑8226( CCL‑
TM
155 )皮下(SC)注射到8‑10周龄的免疫缺陷NOD/Shi‑scid IL2rγ(空)(NOG)雌性小鼠
(Taconic,Ry,Danemark)的右背侧。在RPMI‑8226细胞系SC移植前24至72小时,所有小鼠接
60
受γ‑源(1.44Gy, Co,BioMep,Bretenières,France)全身辐照。一旦肿瘤体积达到至少
3 7
100‑150mm,NOG小鼠在第9天(d9)和第45天(d45)之间接受单次腹膜内(IP)注射2×10个人
PBMC(于500μL PBS 1×pH7.4中)一次。人PBMC的表征通过免疫表型分型(流式细胞术)进
行。然后使用Vivo 软件(Biosystemes,Couternon,France)将小鼠仔细地随机分
配到不同的处理组和对照组(n=9/组),并进行统计检验(方差分析)以测试组间的同质性。
3
在人PBMC IP注射后至少24h至48h并且当所有小鼠中的肿瘤体积达到至少100‑150mm时抗
体治疗开始。TCB抗体治疗时间表基于先前的药代动力学结果,并且由每周一次或每周两次
通过尾静脉IV施用至多3周(即总共3次注射TCB抗体)组成。在每次处理前1小时、第二次处
理前2小时和终止时,通过颈静脉/下颌静脉穿刺(麻醉下)采集血样。立即将血样转移到含
促凝剂的管(T MG管,樱桃红色盖, )。将管在室温下放置30分钟以
允许凝血。然后将管以1,300g离心5分钟以进行凝血块/血清分离。制备血清等分试样,在液
氮中快速冷冻并储存于‑80℃下直到进一步分析。在研究期间用卡尺测量肿瘤体积(TV),并
通过TV的组间比较评价进展。肿瘤生长百分比定义为抑制TG(%),其通过计算TG(%)=100
×(分析组的中值TV)/(对照媒介物处理组的中值TV)来确定。
以确保异种移植物模型适用于测试抗BCMA/抗CD3 T细胞双特异性抗体。在第0天,将BCMA ‑
表达的RPMI‑8226MM细胞SC注射到NOG小鼠。在第22天,IP注射人PBMC,并且一周后可以在血
液中检测到人T细胞(数据未示出)。如图20所示,测量肿瘤生长和体重直到第50天。不幸的
和出乎意料的是,由于以下原因该异种移植物模型被证明不适于测试抗BCMA/抗CD3 T细胞
双特异性抗体的抗肿瘤活性:1)RPMI‑8226人骨髓瘤异种移植物在PBMC‑人源化NOG小鼠中
未能一致地生长;2)移植有RPMI‑8226异种移植物的PBMC‑人源化NOG小鼠在IP注射人PBMC
后即开始丧失体重,这是移植物抗宿主病的体征。出于伦理原因对这些小鼠实施安乐死;3)
在宿主小鼠处死时SC注射后在肿瘤异种移植物中观察到BCMA表达的丧失。
胞的重导向T细胞细胞毒性
还没有对这种高度侵袭性和致命性疾病的明确登记的疗法。BCMA在正常浆细胞的存活中具
有重要作用,并且根据本发明的抗BCMA/抗CD3 T细胞双特异性抗体可用于患有所述疾病的
患者中的血浆细胞白血病治疗。使用Ficoll或其它可比较的方法,通过密度梯度分离从浆
细胞白血病患者样品(含有>80%浆细胞,高白细胞计数)新鲜采集的外周血单核细胞
(PBMC),并且使用抗BCMA/抗CD3 T细胞双特异性抗体浓度或0.1pM至30nM的对照抗体在37
℃下在潮湿空气气氛中温育24小时和48小时。来自浆细胞白血病患者的全骨髓抽吸物也可
以用作样品。每个剂量点一式三份进行。使用Diva软件(BD)在FACSCalibur上通过全部群体
和CD138阳性细胞的膜联蛋白/碘化丙啶染色来确定细胞凋亡。使用流式细胞术
(FACSCalibur;Becton Dickinson)通过碘化丙啶/CD138‐FITC双染色研究浆细胞和PBMC全
部群体的存活力。数据分析使用FACSDiva软件(Becton Dickinson)进行。平均值对一式三
份各自的培养基对照(MC)的平均值归一化。对于统计分析,使用单侧t‐检验。10nM(IMAX10)
浓度下PCL细胞生长的最大抑制和1nM(IMAX1)下测量的抑制分别以百分比给出,称为培养
基对照。还测量了与培养基对照相比对照TCB抗体(10或30nM)的最大抑制。除IMAX值的计算
(Microsoft Microsoft Office Professional 2013)之外,使用R 3.1.19和
Bioconductor 2.1310进行计算。如果对应的统计检验的P‑值<5%(*)、<1%(**)或<0.1%
+
(***),则认为效应具有统计学显著性。还在来自浆细胞白血病患者样品的PBMC CD138 浆
细胞上测量BCMA表达并确定效应子细胞与肿瘤细胞(E:T)比率。如图20所示,结果清晰地显
示,与培养基对照相比,在两个浆细胞白血病患者样品中,具有42‑TCBcv的存活的骨髓浆细
胞白血病细胞(即更多的骨髓浆细胞白血病细胞裂解)显著减少。表27示出了相对于培养基
对照的由10nM(IMAX10)和1nM(IMAX1)抗BCMA/抗CD3 T细胞双特异性抗体诱导的患者骨髓
抽吸物或外周血的浆细胞白血病细胞的最大抑制百分比。结果表明,42‑TCBcv非常强效地
诱导患者骨髓浆细胞白血病细胞的杀死。尽管骨髓浆细胞白血病细胞的特异性裂解由抗
BCMA/抗CD3 T细胞双特异性抗体诱导并且观察到骨髓样品(PCL患者1),但是在各自的样品
中骨髓微环境(BMME)不受影响(数据未示出)。
的最大抑制和1nM(IMAX1)下的抑制的IMAX10和IMAX1值。
淀粉样变性中,抗体的轻链(LC)错误折叠,并且异常的LC错误折叠蛋白质结果是形成淀粉
样蛋白。这些错误折叠淀粉样蛋白沉积在组织、神经和器官中和周围。由于淀粉样蛋白在器
官、神经或组织中累积,逐渐引起损伤并影响其功能。AL淀粉样变性患者通常受到多于一个
器官的影响。由于BCMA在正常浆细胞的存活中具有重要作用,因此评价抗BCMA/抗CD3 T细
胞双特异性抗体杀死AL淀粉样变性中的浆细胞的效应是非常合理的。新鲜采集的AL淀粉样
变性患者的全骨髓样品/抽吸物直接暴露于抗BCMA/抗CD3 TCB抗体或使用CD138磁性微珠
(Miltenyi Biotec,Bergisch Gladbach,Germany)染色,通过自动MACS细胞分离柱,并且将
具有通常>4%的足够剩余数量的AL淀粉样变性浆细胞的收集级分用于进一步实验。在24孔
板中,温育和培养500,000个细胞/孔48小时。将抗BCMA/抗CD3 TCB抗体和对照抗体稀释液
加入各孔中,TCB终浓度为0.1pM至30nM。每个剂量点一式三份进行。使用流式细胞术
(FACSCalibur;Becton Dickinson)通过碘化丙啶/CD138‐FITC双染色研究浆细胞和骨髓微
环境细胞的存活力。使用FACSDiva软件(BectonDickinson)进行数据分析。平均值对一式三
份各自的培养基对照(MC)的平均值归一化。对于统计分析,使用单侧t‐检验。在10nM
(IMAX10)浓度下PCL细胞生长的最大抑制和在1nM(IMAX1)下测量的抑制分别以百分比给
出,称为培养基对照。还测量了与培养基对照相比对照TCB抗体(10或30nM)的最大抑制。除
IMAX值的计算(Microsoft Microsoft Office Professional 2013)之外,使用
R3.1.19和Bioconductor 2.1310进行计算。如果对应的统计检验的P‑值<5%(*)、<1%(**)
或<0.1%(***),则认为效应具有统计学显著性。还在来自AL淀粉样变性患者样品的骨髓
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CD138浆细胞上测量BCMA表达并确定效应子细胞与肿瘤细胞(E:T)的比率。