抗-BCMA抗体，结合BCMA和CD3的双特异性抗原结合分子及其用途

摘要

本文提供了免疫特异性地结合至BCMA的抗体。本发明还描述了能够编码所提供的BCMA特异性抗体或抗原结合片段的相关多核苷酸、表达所提供的抗体或抗原结合片段的细胞以及相关载体和可检测标记的抗体或抗原结合片段。此外，还描述了使用所提供的抗体的方法。例如，所提供的抗体可用于诊断、治疗或监测BCMA表达型癌症的进展、消退或稳定性；用于确定癌症患者是否应该接受治疗；或用于确定受治疗者是否患有BCMA表达型癌症，并因此可适于用BCMA特异性抗癌治疗剂诸如本文所述的针对BCMA和CD3的所述多特异性抗体治疗。

权利要求

1.一种免疫特异性地结合至BCMA的重组抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体具有重链和轻链，所述重链包含：a. SEQ ID NO: 4的氨基酸序列所示的重链互补决定区1 (CDR1)、SEQ ID NO: 5的氨基酸序列所示的重链CDR2和SEQ ID NO: 6的氨基酸序列所示的重链CDR3；

b. SEQ ID NO: 7的氨基酸序列所示的重链CDR1、SEQ ID NO: 5的氨基酸序列所示的重链CDR2和SEQ ID NO: 6的氨基酸序列所示的重链CDR3；

c. SEQ ID NO: 4的氨基酸序列所示的重链CDR1、SEQ ID NO: 5的氨基酸序列所示的重链CDR2和SEQ ID NO: 19的氨基酸序列所示的重链CDR3；

d. SEQ ID NO: 4的氨基酸序列所示的重链CDR1、SEQ ID NO: 8的氨基酸序列所示的重链CDR2和SEQ ID NO: 6的氨基酸序列所示的重链CDR3；

e. SEQ ID NO: 13的氨基酸序列所示的重链CDR1、SEQ ID NO: 5的氨基酸序列所示的重链CDR2和SEQ ID NO: 19的氨基酸序列所示的重链CDR3；

f. SEQ ID NO: 13的氨基酸序列所示的重链CDR1、SEQ ID NO: 8的氨基酸序列所示的重链CDR2和SEQ ID NO: 19的氨基酸序列所示的重链CDR3，其中所述抗体还包含SEQ ID NO: 24的氨基酸序列所示的轻链CDR1、SEQ ID NO: 25的氨基酸序列所示的轻链CDR2和SEQ ID NO: 26的氨基酸序列所示的轻链CDR3。

2.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中(a)的所述抗体的所述重链包含SEQ ID NO: 27的氨基酸序列；(a)的所述抗体的所述重链包含SEQ ID NO: 57的氨基酸序列；(b)的所述抗体的所述重链包含SEQ ID NO: 34的氨基酸序列；(c)的所述抗体的所述重链包含SEQ ID NO: 39的氨基酸序列；(d)的所述抗体的所述重链包含SEQ ID NO: 40的氨基酸序列；(e)的所述抗体的所述重链包含SEQ ID NO: 58的氨基酸序列，或者(f)的所述抗体的所述重链包含SEQ ID NO: 43的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体的所述轻链包含SEQ ID NO: 28的氨基酸序列。

4.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段结合至人BCMA的细胞外结构域。

5.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段为人抗体或抗原结合片段。

6.根据权利要求1所述的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段为Fab片段、Fab2片段或单链抗体。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段抑制BCMA和APRIL的相互作用。

8.根据权利要求7所述的抗体或抗原结合片段，其中通过ELISA所测量，所述抗体或抗原结合片段表现出对于BCMA和APRIL的相互作用的约5.9nM的IC50。

9.根据权利要求1至6中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段为IgG。

10.根据权利要求1至6中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其为IgG4同种型。

11.根据权利要求10所述的抗体，其中所述IgG4在其Fc区中具有S228P置换、L234A置换和L235A置换。

12.根据权利要求1至6中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段免疫特异性地结合人BCMA并与食蟹猴BCMA交叉反应。

13.根据权利要求1至6中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段结合人骨髓瘤细胞的表面上的BCMA。

14.根据权利要求1至6中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段结合人多发性骨髓瘤细胞的表面上的BCMA。

15.一种重组细胞，所述细胞表达根据权利要求1至14中任一项所述的抗体或抗原结合片段。

16.根据权利要求15所述的细胞，其中所述细胞为杂交瘤。

17.根据权利要求15所述的细胞，其中所述抗体是重组产生的。

18.一种重组BCMA×CD3双特异性抗体或其BCMA×CD3双特异性结合片段，包含：a) 第一重链(HC1)；

b) 第二重链(HC2)；

c) 第一轻链(LC1)；以及

d) 第二轻链(LC2)，

其中HC1与LC1缔合并且HC2与LC2缔合，并且其中HC1包含SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 

60和SEQ ID NO: 61并且LC1包含SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63和SEQ ID NO: 64以形成免疫特异性地结合CD3的第一抗原结合位点，并且其中HC2包含SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 

5和SEQ ID NO: 6并且LC2包含SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25和SEQ ID NO: 26以形成免疫特异性地结合BCMA的第二抗原结合位点。

19.根据权利要求18所述的重组BCMA×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段，包含含有SEQ ID NO: 55的HC1、含有SEQ ID NO: 56的LC1、含有SEQ ID NO: 65的HC2和含有SEQ ID NO: 76的LC2。

20.根据权利要求19所述的BCMA×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段，其中所述抗体或双特异性结合片段为IgG。

21.根据权利要求18所述的BCMA×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段，其中所述抗体或双特异性结合片段为IgG4同种型。

22.根据权利要求18所述的BCMA×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段，其中通过表面等离振子共振所测量，所述抗体或双特异性结合片段以至少0.22nM的亲和力免疫特异性地结合人BCMA。

23.根据权利要求18所述的BCMA×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段，其中所述抗体或其双特异性结合片段结合人骨髓瘤细胞的表面上的BCMA。

24.根据权利要求18所述的BCMA×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段，其中所述抗体或其双特异性结合片段结合人多发性骨髓瘤细胞的表面上的BCMA。

25.根据权利要求18所述的BCMA×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段，其中所述抗体或双特异性结合片段以小于0.37nM的EC50诱导人T细胞体外活化。

26.根据权利要求18所述的BCMA×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段，其中所述抗体或双特异性结合片段以小于0.45nM的EC50诱导BCMA表达型细胞在体外的T细胞依赖性细胞毒性。

27.根据权利要求18所述的BCMA×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段，其中所述抗体或双特异性结合片段不是BCMA激动剂。

28.根据权利要求18至27所述的BCMA×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段，其中所述抗体或双特异性结合片段在低于10nM的浓度下不改变NF‑κB活化。

29.一种重组细胞，所述细胞表达根据权利要求18至28中任一项所述的抗体或双特异性结合片段。

30.根据权利要求29所述的细胞，其中所述细胞为杂交瘤。

31.根据权利要求18至28中任一项所述的BCMA×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段在制备用于治疗患有BCMA表达型癌症的受治疗者的药物中的用途，包括向对其有需要的受治疗者施用治疗有效量的根据权利要求18至28中任一项所述的BCMA×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段足以治疗所述癌症的时间。

32.根据权利要求18至28中任一项所述的BCMA×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段在制备用于抑制BCMA表达型癌细胞的生长或增殖的药物中的用途，包括施用治疗有效量的根据权利要求18至28中任一项所述的BCMA×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段以抑制癌细胞的生长或增殖。

33.根据权利要求18至28中任一项所述的BCMA×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段在制备用于将T细胞重定向至BCMA表达型癌细胞的药物中的用途，包括施用治疗有效量的根据权利要求18至28中任一项所述的BCMA×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段以将T细胞重定向至癌细胞。

34.根据权利要求31、32或33所述的用途，其中所述癌症为血液学癌症。

35.根据权利要求34所述的用途，其中所述血液学癌症是BCMA表达型B细胞癌症。

36.根据权利要求35所述的用途，其中所述BCMA表达型B细胞癌症是多发性骨髓瘤。

37.根据权利要求31所述的用途，还包括施用第二治疗剂。

38.根据权利要求37所述的用途，其中所述第二治疗剂是化学治疗剂或靶向抗癌治疗剂。

39.根据权利要求38所述的用途，其中所述化学治疗剂是阿糖胞苷、蒽环霉素、组胺二盐酸盐或白介素2。

40.一种药物组合物，包含根据权利要求18至28中任一项所述的BCMA×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段以及药学上可接受的载体。

41.一种方法，所述方法用于通过培养根据权利要求29至30中任一项所述的细胞来生成根据权利要求18至28中任一项所述的BCMA×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段。

42.一种分离的合成多核苷酸，所述多核苷酸编码根据权利要求18至28中任一项所述的BCMA×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段。

43.一种试剂盒，包括根据权利要求18至28中任一项所述的BCMA×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段和/或根据权利要求42所述的多核苷酸及其包装。

说明书

抗‑BCMA抗体，结合BCMA和CD3的双特异性抗原结合分子及其

用途

[0001] 本申请要求于2015年8月17日提交的美国临时专利申请序列号62/206,246的权益，该临时专利申请据此全文以引用方式并入。

[0002] 序列表

[0003] 本申请包含已经以ASCII格式电子提交的序列表，所述序列表据此全文以引用方式并入。所述ASCII副本创建于2016年8月15日，命名为PRD3383USNP_SL.txt，大小为87,341字节。

技术领域

[0004] 本文所提供的公开内容涉及免疫特异性地结合B细胞成熟抗原(BCMA)的单克隆抗体、免疫特异性地结合BCMA和簇决定子3(CD3)的多特异性抗体，以及产生和使用所述抗体的方法。

背景技术

[0005] B细胞成熟抗原，也称为BCMA、CD269、TNFRSF17(UniProt Q02223)，是优先在分化的浆细胞中表达的肿瘤坏死受体超家族的成员[Laabi等人，(1992)EMBO J 11(11):3897‑3904；Madry等人，(1998)Int Immunol 10(11):1693‑1702]。BCMA是一种非糖基化I型跨膜蛋白，其参与B细胞成熟、生长和存活。BCMA是TNF超家族的两种配体的受体：APRIL(增殖诱导配体，CD256，TNFSF13)，BCMA的高亲和力配体，以及B细胞活化因子BAFF(THANK，BlyS，B淋巴细胞刺激因子，TALL‑1和zTNF4)，BCMA的低亲和力配体。APRIL和BAFF显示出结构相似性以及重叠但不同的受体结合特异性。负调控因子TACI也结合至BAFF和APRIL两者。APRIL和BAFF与BCMA和/或TACI的配位结合激活转录因子NF‑κB并增加促存活Bcl‑2家族成员(例如，Bcl‑2、Bcl‑xL、Bcl‑w、Mcl‑1、A1)的表达并下调促凋亡因子(例如，Bid、Bad、Bik、Bim等)的表达，从而抑制细胞凋亡并促进存活。该组合作用促进B细胞分化、增殖、存活和抗体产生(如在Rickert RC等人，Immunol Rev，(2011)244(1):115‑133中所综述的)。根据这一发现，BCMA还支持恶性人B细胞(包括多发性骨髓瘤(MM)细胞)的生长和存活。Novak等人发现MM细胞系和新鲜分离的MM细胞在其细胞表面上表达BCMA和TACI蛋白，并且在其细胞表面上具有BAFF‑R蛋白的可变表达(Novak等人，(2004)Blood 103(2):689‑694)。

[0006] 多发性骨髓瘤(MM)是第二常见的恶性血液肿瘤，并且占所有癌症死亡的2％。MM是一种异质性疾病，并且主要由染色体易位引起，尤其是t(11；14)、t(4；14)、t(8；14)、del(13)、del(17)(Drach等人，(1998)Blood 92(3):802‑809；Gertz等人，(2005)Blood 106(8):2837‑2840；Facon等人，(2001)Blood 97(6):1566‑1571)。由于骨髓浸润、骨破坏、肾衰竭、免疫缺陷以及癌症诊断的心理负担，MM影响的患者可能经历各种疾病相关症状。截至2006年，MM的5年相对存活率约为34％，强调MM是目前尚无治愈选择的难治性疾病。

[0007] 在WO2002066516和WO2010104949中提到了使用抗‑BCMA抗体治疗淋巴瘤和多发性骨髓瘤。例如在如下文献中描述了针对BCMA的抗体：Gras M‑P.等人，Int Immunol.，7(1995)1093‑1106；WO200124811；以及WO200124812。然而，尽管事实是BCMA、BAFF‑R和TACI(即属于TNF受体超家族的B细胞受体)及其配体BAFF和APRIL已经受用于对抗癌症的疗法，但仍然需要获得治疗这些医疗状况的更多可用选择。

发明内容

[0008] 本文提供了免疫特异性地结合至BCMA的抗体及其抗原结合片段。本文还描述了能够编码所提供的BCMA特异性抗体和抗原结合片段的相关多核苷酸、表达所提供的抗体和抗原结合片段的细胞以及相关载体和可检测标记的抗体和抗原结合片段。此外，还描述了使用所提供的抗体和抗原结合片段的方法。例如，BCMA特异性抗体和抗原结合片段可用于诊断或监测BCMA表达型癌症的进展、消退或稳定性；以用于确定癌症患者是否应该接受治疗；或用于确定受治疗者是否患有BCMA表达型癌症，并因此可适于用BCMA特异性抗癌治疗剂诸如本文所述的针对BCMA和CD3的多特异性抗体治疗。

[0009] 本文还提供了免疫特异性地结合至BCMA和CD3的多特异性抗体及其多特异性抗原结合片段。本文还描述了能够编码所提供的BCMA×CD3多特异性抗体的相关多核苷酸、表达所提供的抗体的细胞以及相关载体和可检测标记的多特异性抗体。此外，还描述了使用所提供的多特异性抗体的方法。例如，BCMA×CD3多特异性抗体可用于诊断或监测BCMA表达型癌症的进展、消退或稳定性；以用于确定癌症患者是否应该接受治疗；或用于确定受治疗者是否患有BCMA表达型癌症，并因此可适于用BCMA特异性抗癌治疗剂诸如本文所述的BCMA×CD3多特异性抗体治疗。

[0010] BCMA特异性抗体

[0011] 本文描述了特异于BCMA的重组抗体和抗原结合片段。在一些实施方案中，BCMA特异性抗体和抗原结合片段结合人BCMA。在一些实施方案中，BCMA特异性抗体和抗原结合片段结合人BCMA和食蟹猴BCMA。在一些实施方案中，BCMA特异性抗体和抗原结合片段与包含来自BCMA细胞外结构域(ECD)的一个或多个残基的表位结合。通过ELISA所测量，该BCMA特异性抗体或抗原结合片段可以至少5.9nM的IC50阻断APRIL结合。

[0012] 表1提供了本文所述的一些BCMA特异性抗体的示例的汇总：

[0013] 表1：针对人BCMA产生的mAb的CDR序列

[0014] (每个列出的序列的SEQ ID NO在括号中提供)

[0015]

[0016]

[0017] 在一些实施方案中，提供了BCMA特异性抗体或其抗原结合片段，它们包含含有表1所述抗体中的任一种抗体的CDR1、CDR2和CDR3的重链。在一些实施方案中，提供了BCMA特异性抗体或其抗原结合片段，它们包含含有表1所述抗体中的任一种抗体的CDR1、CDR2和CDR3的重链以及含有表1所述抗体中的任一种抗体的CDR1、CDR2和CDR3的轻链。

[0018] 人IgG类分为四种同种型：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。它们在Fc区的氨基酸序列中共享大于95％的同源性，但显示的主要差别在于铰链区的氨基酸组成和结构。Fc区介导效应子功能，诸如抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。在ADCC中，抗体的Fc区结合至免疫效应子细胞(诸如自然杀伤细胞和巨噬细胞)的表面上的Fc受体(FcgR)，导致靶细胞的吞噬作用或裂解。在CDC中，抗体通过触发细胞表面的补体级联反应来杀伤靶细胞。本文所述的抗体包括具有与任何IgG同种型组合的可变结构域的所述特征的抗体，包括其中Fc序列已经被修饰以实现不同效应子功能的修饰型式。

[0019] 对于治疗性抗体的许多应用，Fc介导的效应子功能不是作用机制的一部分。这些Fc介导的效应子功能可能是有害的，并可能通过引起机制外毒性而带来安全风险。修饰效应子功能可通过改造Fc区以减弱其与FcgR或补体因子的结合来实现。IgG与活化性FcgR(FcgRI、FcgRIIa、FcgRIIIa和FcgRIIIb)和抑制性FcgR(FcgRIIb)或补体(C1q)的第一组分的结合取决于位于铰链区和CH2结构域中的残基。已经在IgG1、IgG2和IgG4中引入突变以降低或沉默Fc功能。本文所述的抗体可包括这些修饰形式。

[0020] 在一个实施方案中，抗体包含具有以下特性中的一者或多者的Fc区：(a)与亲本Fc相比效应子功能降低；(b)对FcgRI、FcgRIIa、FcgRIIb、FcgRIIIb和/或FcgRIIIa的亲和力降低；(c)对FcgRI的亲和力降低；(d)对FcgRIIa的亲和力降低；(e)对FcgRIIb的亲和力降低；(f)对FcgRIIIb的亲和力降低；或(g)对FcgRIIIa的亲和力降低。

[0021] 在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段是IgG或其衍生物，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4同种型。在其中抗体具有IgG4同种型的一些实施方案中，所述抗体在其Fc区中含有K409R、S228P、L234A和L235A置换。本文所述的抗体可包括这些修饰形式。

[0022] 在一些实施方案中，通过ELISA所测量，所述抗体能够以5.9nM的IC50抑制APRIL结合。

[0023] 在一些实施方案中，所述抗体结合至BCMA阳性多发性骨髓瘤细胞系。

[0024] 除所述BCMA特异性抗体和抗原结合片段之外，还提供了能够编码所述抗体和抗原结合片段的多核苷酸序列。还提供了包含所述多核苷酸的载体，以及表达本文提供的BCMA特异性抗体或抗原结合片段的细胞。还描述了能够表达所公开的载体的细胞。这些细胞可以是哺乳动物细胞(诸如293F细胞、CHO细胞)、昆虫细胞(诸如Sf7细胞)、酵母细胞、植物细胞或细菌细胞(诸如大肠杆菌(E.coli))。所述抗体也可以由杂交瘤细胞产生。

[0025] 使用BCMA特异性抗体的方法

[0026] 还公开了使用所述BCMA特异性抗体或抗原结合片段的方法。用于本部分所讨论的方法中的特定抗体包括具有针对表1中的抗体所述的那组CDR的那些抗体。例如，这些抗体或抗原结合片段可用于治疗癌症，通过干扰BCMA‑受体相互作用或其中抗体缀合至毒素，从而将毒素靶向BCMA表达型癌症。此外，这些抗体或抗原结合片段还可用于检测生物样品诸如血液或血清中BCMA的存在；用于定量分析生物样品诸如血液或血清中BCMA的量；用于诊断BCMA表达型癌症；用于确定治疗患有癌症的受治疗者的方法；或用于监测受治疗者中BCMA表达型癌症的进展。在一些实施方案中，BCMA表达型癌症可以是淋巴瘤诸如多发性骨髓瘤(MM)。所述方法可以在受治疗者接受BCMA表达型癌症的治疗，诸如用针对BCMA和CD3的多特异性抗体治疗之前进行。此外，所述方法可以在受治疗者接受BCMA表达型癌症的治疗，诸如用本文所述针对BCMA和CD3的多特异性抗体治疗之后进行。

[0027] 所述检测生物样品中的BCMA的方法包括将生物样品暴露于本文所述的BCMA特异性抗体或抗原结合片段中的一种或多种。

[0028] 所述诊断受治疗者中BCMA表达型癌症的方法还包括将生物样品暴露于本文所述的BCMA特异性抗体或抗原结合片段中的一种或多种；然而，该方法还包括定量存在于样品中的BCMA的量；将存在于样品中的BCMA的量与已知标准品或参照样品进行比较；以及确定受治疗者的BCMA水平是否落入与癌症相关的BCMA水平内。

[0029] 本文还描述了监测受治疗者中BCMA表达型癌症的方法。所述方法包括将生物样品暴露于本文所述的BCMA特异性抗体或抗原结合片段中的一种或多种；定量存在于由抗体或其抗原结合片段结合的样品中的BCMA的量；将存在于样品中的BCMA的量与已知标准品或参照样品或先前从受治疗者中获得的类似样品中的BCMA的量进行比较；以及基于所比较的样品中BCMA的量的差异，确定受治疗者的BCMA水平是否指示癌症进展、消退或稳定疾病。

[0030] 从受治疗者中获得或来源于受治疗者的样品是生物样品，诸如尿液、血液、血清、血浆、唾液、腹水、循环细胞、循环肿瘤细胞、非组织缔合的细胞、组织、手术切除的肿瘤组织、活体组织切片、细针抽吸样品或组织学制备物。

[0031] 可对所述的BCMA特异性抗体或抗原结合片段进行标记以用于所述方法或本领域技术人员已知的其它方法。例如，本文所述的抗体或其抗原结合片段可以用放射标记物、荧111 111
光标记物、表位标签、生物素、发色团标记物、ECL标记物、酶、钌、 In‑DOTA、 In‑二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和β‑半乳糖苷酶，或者聚组氨酸或本领域已知的类似此类标记物进行标记。

[0032] BCMA特异性抗体试剂盒

[0033] 本文描述了包括所公开的BCMA特异性抗体或其抗原结合片段的试剂盒。所述试剂盒可用于实施使用本文提供的BCMA特异性抗体或抗原结合片段的方法或本领域技术人员已知的其它方法。在一些实施方案中，所述试剂盒可包括本文所述的抗体或抗原结合片段以及用于检测生物样品中是否存在BCMA的试剂。因此，所述试剂盒可包括本文所述的抗体或其抗原结合片段中的一种或多种，以及用于在不使用时盛装抗体或片段的容器、抗体或片段的使用说明、附连于固体支持物的抗体或片段和/或如本文所述的抗体或片段的可检测标记形式。

[0034] BCMA×CD3多特异性抗体

[0035] 通过TCR/CD3复合体将T淋巴细胞重定向至表达BCMA的MM细胞代表了一种有吸引力的替代方法。T淋巴细胞的TCR/CD3复合体由在细胞表面共表达的TCRα/β或TCRγ/δ异二聚体与CD3标记的γ、δ、ε、ζ和η的不变亚基组成。人CD3ε以UniProt P07766描述(CD3E_HUMAN)。现有技术中所述的抗CD3ε抗体是SP34(Yang SJ，The Journal of Immunology，(1986)137；1097‑1100)。SP34与灵长类和人CD3反应。SP34购自Pharmingen。现有技术中所述的另一种抗CD3抗体是UCHT‑1(参见WO2000041474)。现有技术中所述的另一种抗CD3抗体是BC‑3(Fred Hutchinson Cancer Research Institute，用于GvHD的I/II期试验，Anasetti等人，Transplantation，54:844(1992))。SP34与UCHT‑1和BC‑3的不同之处在于，SP‑34识别仅存在于CD3的ε链上的表位(参见Salmeron等人，1991年，J.Immunol.，第147卷，第3047页)，而UCHT‑1和BC‑3识别由ε链和γ链二者贡献的表位。在WO2008119565、WO2008119566、WO2008119567、WO2010037836、WO2010037837和WO2010037838中提到了具有与抗体SP34相同序列的抗体的序列。在US8236308(WO2007042261)中提到了与抗体SP34的重链可变结构域(VH)具有96％同一性的序列。

[0036] 在WO2007117600、WO2009132058、WO2012066058、WO2012143498、WO2013072406、WO2013072415和WO2014122144中提到了多种针对CD3和BCMA的双特异性抗体。然而，目前还没有描述临床进展的数据可用。

[0037] 本文描述了结合BCMA和CD3的重组的多特异性抗体(“BCMA×CD3多特异性抗体”)及其多特异性抗原结合片段。在一些实施方案中，提供了免疫特异性地结合至BCMA的重组抗体或其抗原结合片段。

[0038] 在一些实施方案中，多特异性抗体的BCMA特异性臂结合人BCMA和食蟹猴BCMA。在一些实施方案中，BCMA×CD3多特异性抗体或抗原结合片段的BCMA特异性臂结合人BCMA的细胞外结构域。在优选的实施方案中，BCMA×CD3多特异性抗体或抗原结合片段是双特异性抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，提供了包含：a)第一重链(HC1)、b)第二重链(HC2)、c)第一轻链(LC1)和d)第二轻链(LC2)的重组的BCMA×CD3双特异性抗体，其中HC1和LC1配对形成免疫特异性地结合BCMA的第一抗原结合位点，并且HC2和LC2配对形成免疫特异性地结合CD3或其BCMA×CD3双特异性结合片段的第二抗原结合位点。在另一个实施方案中，提供了表达所述抗体或双特异性结合片段的重组细胞。在一些实施方案中，BCMA×CD3多特异性抗体的BCMA结合臂(或“BCMA特异性臂”)来源于自本文所述的BCMA抗体(例如，来源于具有表1所列的CDR序列的抗体)。

[0039] 在一些实施方案中，BCMA×CD3多特异性抗体或抗原结合片段的BCMA特异性臂是IgG或其衍生物。在一些实施方案中，通过表面等离振子共振所测量，所述BCMA×CD3多特异性抗体能够以至少0.18nM的解离常数结合至BCMA。在一些实施方案中，所述BCMA×CD3多特异性抗体不是激动剂。在一些实施方案中，所述BCMA×CD3多特异性抗体在低于10nM的浓度下不改变NF‑κB活化。

[0040] 在一些实施方案中，BCMA×CD3多特异性抗体的CD3结合臂(或“CD3特异性臂”)来源于小鼠单克隆抗体SP34，一种小鼠IgG3/λ同种型。(K.R.Abhinandan和A.C.Martin，2008年，Mol.Immunol.，第45卷，第3832‑3839页)。在一些实施方案中，BCMA×CD3多特异性抗体的CD3结合臂包含选自表2的一条重链和一条轻链。

[0041] 表2：CD3特异性抗体和抗原结合片段的重链和轻链。

[0042]

[0043]

[0044] 人IgG类分为四种同种型：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。它们在Fc区的氨基酸序列中共享大于95％的同源性，但显示的主要差别在于铰链区的氨基酸组成和结构。Fc区介导效应子功能，诸如抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。在ADCC中，抗体的Fc区结合至免疫效应子细胞(诸如自然杀伤细胞和巨噬细胞)的表面上的Fc受体(FcgR)，导致靶细胞的吞噬作用或裂解。在CDC中，抗体通过触发细胞表面的补体级联反应来杀伤靶细胞。

[0045] 对于治疗性抗体的许多应用，Fc介导的效应子功能不是作用机制的一部分。这些Fc介导的效应子功能可能是有害的，并可能通过引起机制外毒性而带来安全风险。修饰效应子功能可通过改造Fc区以减弱其与FcgR或补体因子的结合来实现。IgG与活化性FcgR(FcgRI、FcgRIIa、FcgRIIIa和FcgRIIIb)和抑制性FcgR(FcgRIIb)或补体(C1q)的第一组分的结合取决于位于铰链区和CH2结构域中的残基。已经在IgG1、IgG2和IgG4中引入突变以降低或沉默Fc功能。

[0046] 在一个实施方案中，抗体包含具有以下特性中的一者或多者的Fc区：(a)与亲本Fc相比效应子功能降低；(b)对FcgRI、FcgRIIa、FcgRIIb、FcgRIIIb和/或FcgRIIIa的亲和力降低；(c)对FcgRI的亲和力降低；(d)对FcgRIIa的亲和力降低；(e)对FcgRIIb的亲和力降低；(f)对FcgRIIIb的亲和力降低；或(g)对FcgRIIIa的亲和力降低。

[0047] 在一些实施方案中，衍生多特异性抗体的CD3特异性臂的CD3特异性抗体或抗原结合片段是IgG或其衍生物。在一些实施方案中，衍生多特异性抗体的CD3特异性臂的CD3特异性抗体或抗原结合片段是IgG1或其衍生物。在一些实施方案中，例如，衍生CD3结合臂的CD3特异性IgG1抗体的Fc区在其Fc区中包含L234A、L235A和F405L置换。在一些实施方案中，衍生多特异性抗体的CD3特异性臂的CD3特异性抗体或抗原结合片段是IgG4或其衍生物。在一些实施方案中，例如，衍生CD3结合臂的CD3特异性IgG4抗体的Fc区在其Fc区中包含S228P、L234A、L235A、F405L和R409K置换。在一些实施方案中，衍生多特异性抗体的CD3特异性臂的CD3特异性抗体或抗原结合片段结合原代人T细胞和/或原代食蟹猴T细胞上的CD3ε。在一些实施方案中，衍生多特异性抗体的CD3特异性臂的CD3特异性抗体或抗原结合片段激活原代人CD4+ T细胞和/或原代食蟹猴CD4+ T细胞。

[0048] 除了所述BCMA×CD3多特异性抗体之外，还提供了能够编码所述BCMA×CD3多特异性抗体的多核苷酸序列。在一些实施方案中，提供了编码BCMA×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段的HC1、HC2、LC1或LC2的分离的合成多核苷酸。还提供了包含所述多核苷酸的载体，以及表达本文提供的BCMA×CD3多特异性抗体的细胞。还描述了能够表达所公开的载体的细胞。这些细胞可以是哺乳动物细胞(诸如293F细胞、CHO细胞)、昆虫细胞(诸如Sf7细胞)、酵母细胞、植物细胞或细菌细胞(诸如大肠杆菌)。所述抗体也可以由杂交瘤细胞产生。在一些实施方案中，提供了用于通过培养细胞产生BCMA×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段的方法。

[0049] 本文还提供了包含BCMA×CD3多特异性抗体或抗原结合片段的药物组合物以及药学上可接受的载体。

[0050] 使用BCMA×CD3多特异性抗体的方法

[0051] 还公开了使用所述BCMA×CD3多特异性抗体及其多特异性抗原结合片段的方法。例如，BCMA×CD3多特异性抗体及其多特异性抗原结合片段可用于治疗对其有需要的受治疗者中的BCMA表达型癌症。在一些实施方案中，BCMA表达型癌症是淋巴瘤诸如多发性骨髓瘤。

[0052] 所述治疗对其有需要的受治疗者中BCMA表达型癌症的方法包括对受治疗者施用治疗有效量的所述BCMA×CD3多特异性抗体或其多特异性抗原结合片段。在一些实施方案中，受治疗者是哺乳动物，优选是人。在优选的实施方案中，提供了通过向对其有需要的患者施用治疗有效量的BCMA×CD3双特异性抗体或双特异性抗原结合片段足以治疗癌症的时间，从而治疗患有癌症的受治疗者的方法。

[0053] 本文还提供了用于抑制癌细胞的生长或增殖的方法，该方法通过施用治疗有效量的BCMA×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段以抑制癌细胞的生长或增殖。

[0054] 本文还提供了将T细胞重定向至BCMA表达型癌细胞的方法，该方法通过施用治疗有效量的BCMA×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段而将T细胞重定向至癌症。

[0055] BCMA×CD3特异性抗体试剂盒

[0056] 本文描述了包括所公开的BCMA×CD3多特异性抗体的试剂盒。所述试剂盒可用于实施使用本文提供的BCMA×CD3多特异性抗体的方法或本领域技术人员已知的其它方法。在一些实施方案中，所述试剂盒可包括本文所述的抗体和用于治疗BCMA表达型癌症的试剂。因此，所述试剂盒可包括本文所述的多特异性抗体或其多特异性抗原结合片段中的一种或多种、以及用于在不使用时盛装抗体或片段的容器和/或抗体或片段的使用说明、附连于固体支持物的抗体或片段和/或如本文所述的抗体或片段的可检测标记形式。

具体实施方式

[0057] 定义

[0058] 与说明书的各方面相关的各种术语在说明书和权利要求书中通篇使用。除非另外指明，否则此类术语被赋予本领域的普通含义。其它具体定义的术语应按照与本文所提供的定义相符的方式理解。

[0059] 如本说明书和所附权利要求中所用，除非内容另有明确说明，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代。因此，例如，对“一个细胞”的提及包括两个或更多个细胞的组合等等。

[0060] 如本文所用，术语“约”在涉及可测量值诸如量、时距等时，意指涵盖与指定值至多±10％的变化，因为这类变化适合执行本发明所公开的方法。除非另外指明，否则说明书和权利要求书中使用的表示成分的量、特性诸如分子量、反应条件等的所有数字在所有情况下均应理解为被术语“约”修饰。因此，除非有相反的说明，否则在下述说明书和所附权利要求书中列出的数值参数均为近似值，这些近似值可根据本发明寻求获得的期望特性而变化。在最低程度上且不试图将等同原则的应用限制到权利要求书的保护范围的前提下，至少应当根据所报告的数值的有效数位并通过应用惯常的四舍五入法来解释每一个数值参数。

[0061] 尽管用以阐明本发明之宽范围的数值范围和参数是近似的，但在具体的实施例中提出的数值却是尽可能精确地报告的。然而，任何数值均固有地包含某些误差，所述误差必然会由存在于其各自测试测量法中的标准偏差产生。

[0062] “分离的”意指生物组分(诸如核酸、肽或蛋白质)已经与组分天然存在的生物体的其它生物组分(即其它染色体和染色体外DNA和RNA以及蛋白质)基本上分离、分开得到或从其中纯化出来。因此，已经“分离”的核酸、肽和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白质。“分离的”核酸、肽和蛋白质可以是组合物的一部分，并且如果这样的组合物不是核酸、肽或蛋白质自身环境的一部分，则仍然是分离的。该术语还包括通过在宿主细胞中重组表达制备的核酸、肽和蛋白质以及化学合成的核酸。如本文所用，“分离的”抗体或抗原结合片段旨在意指基本上不含具有不同抗原特异性的其它抗体或抗原结合片段的抗体或抗原结合片段(例如，特异性地结合至BCMA的分离的抗体基本上不含特异性地结合除BCMA以外的抗原的抗体)。然而，特异性地结合至BCMA的表位、亚型或变体的分离的抗体可以与其它相关抗原，例如来自其它物种(诸如BCMA物种同源物)的抗原具有交叉反应性。

[0063] 同义地称为“核酸分子”、“核苷酸”或“核酸”的“多核苷酸”是指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，其可以是未修饰的RNA或DNA或者修饰的RNA或DNA。“多核苷酸”包括但不限于单链和双链的DNA、为单链区和双链区的混合物的DNA、单链和双链的RNA以及为单链区和双链区的混合物的RNA、包含可以是单链或更典型地是双链或者是单链区和双链区的混合物的DNA和RNA的杂合分子。另外，“多核苷酸”是指包含RNA或DNA或RNA和DNA两者的三链区。术语多核苷酸还包括含有一个或多个修饰的碱基的DNA或RNA，以及具有出于稳定性或其它原因而被修饰的主链的DNA或RNA。“修饰的”碱基包括例如三苯甲基化的碱基和稀有碱基诸如肌苷。可以对DNA和RNA进行多种修饰；因此，“多核苷酸”包括通常天然存在的多核苷酸的化学修饰、酶修饰或代谢修饰形式，以及病毒和细胞特有的DNA和RNA的化学形式。“多核苷酸”也包括相对短的核酸链，通常被称为寡核苷酸。

[0064] “基本上相同”的含义可根据使用该术语的上下文而不同。由于重链和轻链以及编码它们的基因之间可能存在的天然序列变异，预期在氨基酸序列或编码本文所述的抗体或抗原结合片段的基因中发现一定程度的变异，而对其独特的结合特性(例如，特异性和亲和力)产生的影响很小或没有影响。这种预期部分归因于遗传密码的简并性以及保守氨基酸序列变异的成功进化，但这不会明显改变所编码蛋白质的性质。因此，在核酸序列的上下文中，“基本上相同”意指两个或更多个序列之间具有至少65％的同一性。优选地，该术语是指两个或更多个序列之间具有至少70％的同一性，更优选至少75％的同一性，更优选至少80％的同一性，更优选至少85％的同一性，更优选至少90％的同一性，更优选至少91％的同一性，更优选至少92％的同一性，更优选至少93％的同一性，更优选至少94％的同一性，更优选至少95％的同一性，更优选至少96％的同一性，更优选至少97％的同一性，更优选至少
98％的同一性，以及更优选至少99％或更高的同一性。两个序列之间的百分比同一性是序列所共有的相同位置数目的函数(即，同源性％＝相同位置的数目/位置总数×100)，考虑到空位的数目和每个空位的长度，需要引入这些参数用于两个序列的最佳比对。两个核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性可以例如采用E.Meyers和W.Miller，
Comput.Appl.Biosci 4，11‑17(1988)的算法(该算法已经并入ALIGN程序(版本2.0)中)，使用PAM120加权残基表、空位长度罚分12和空位罚分4来确定。此外，两个氨基酸序列之间的百分比同一性可以使用Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48,444‑453(1970)的算法来确定。

[0065] 在蛋白质的氨基酸序列中可能发生的对蛋白质功能没有实质性影响的变异程度远低于核酸序列的变异程度，因为相同的简并性原则不适用于氨基酸序列。因此，在抗体或抗原结合片段的上下文中，“基本上相同”意指与所述抗体或抗原结合片段具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的抗体或抗原结合片段。其它实施方案包括具有框架、支架或其它非结合区的BCMA特异性抗体或抗原结合片段，其不与本文所述的抗体和抗原结合片段具有显著的同一性，但确实并入一个或多个CDR或赋予与本文所述的这类序列具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的结合所需的其它序列。

[0066] “载体”是复制子，诸如质粒、噬菌体、粘粒或病毒，其中可以可操作地插入另一核酸区段以引起该区段的复制或表达。

[0067] “克隆”是来源于单细胞或共同祖细胞通过有丝分裂产生的细胞群。“细胞系”是能够在体外稳定生长许多代的原代细胞的克隆。在本文提供的一些示例中，通过用DNA转染细胞来转化细胞。

[0068] 术语“表达”和“产生”在本文中同义使用，并且是指基因产物的生物合成。这些术语涵盖基因到RNA的转录。这些术语还涵盖RNA到一个或多个多肽的翻译，并且还涵盖所有天然存在的转录后和翻译后修饰。抗体或其抗原结合片段的表达或产生可以在细胞的细胞质内，或者在细胞外环境中诸如细胞培养物的生长培养基中。

[0069] 术语“治疗”(“treating”或“treatment”)是指在减轻或改善损伤、病变或病症方面取得的任何成功或成功迹象，包括任何客观或主观参数，诸如症状减轻、缓解、削弱或使患者更能耐受病症，减缓退变或衰退速率，使退变终点衰竭程度降低，改善受治疗者的身体或心理健康，或延长存活时间。可以通过客观或主观参数评估治疗；包括体格检查、神经学检查或精神评价的结果。

[0070] “有效量”或“治疗有效量”是指在所需剂量和时间段内有效实现所需治疗结果的量。BCMA×CD3抗体的治疗有效量可根据因素诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及抗体在个体中引发所需应答的能力而变化。治疗有效量也是其中抗体或抗体部分的治疗有益效应远远超过任何毒性或有害效应的量。

[0071] 除非另有说明，否则“抗体”是指包括各种单体、聚合和嵌合形式的免疫球蛋白的所有同种型(IgG、IgA、IgE、IgM、IgD和IgY)。术语“抗体”具体地涵盖多克隆抗体、单克隆抗体(mAb)和抗体样多肽，诸如嵌合抗体和人源化抗体。

[0072] “抗原结合片段”是可以对特定抗原表现出结合亲和力的任何蛋白质性结构。抗原结合片段包括通过任何已知技术诸如酶切割、肽合成和重组技术提供的那些。一些抗原结合片段由完整抗体的保留亲本抗体分子的抗原结合特异性的部分组成。例如，抗原结合片段可包含已知结合特定抗原的抗体的至少一个可变区(重链可变区或轻链可变区)或者一个或多个CDR。合适的抗原结合片段的示例包括但不限于双体抗体和单链分子以及Fab、F(ab’)2、Fc、Fabc和Fv分子；单链(Sc)抗体；单个抗体轻链；单个抗体重链；抗体链或CDR与其它蛋白质之间的嵌合融合体；蛋白质支架；重链单体或二聚体；轻链单体或二聚体；由一条重链和一条轻链组成的二聚体；由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；或如WO2007059782中所述的单价抗体；包含由铰链区的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；
基本上由V.sub.H和C.sub.H1结构域组成的Fd片段；基本上由抗体的单臂的VL结构域和VH结构域组成的Fv片段；基本上由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人，Nature 341,544‑546(1989))，并且也被称为结构域抗体(Holt等人，Trends Biotechnol.，2003年11月，21(11):
484‑90)；羊驼或纳米抗体(Revets等人，Expert Opin Biol Ther.，2005年1月，5(1):111‑
24)；分离的互补决定区(CDR)等。所有抗体同种型均可用于产生抗原结合片段。另外，抗原结合片段可包括非抗体蛋白质性框架，其可成功地以赋予感兴趣的给定抗原(诸如蛋白质支架)亲和力的取向并入多肽区段。抗原结合片段可重组产生或通过对完整抗体的酶切割或化学切割产生。短语“抗体或其抗原结合片段”可用于表示给定的抗原结合片段并入该短语中提及的抗体的一个或多个氨基酸区段。

[0073] 术语“表位”是指能够与抗体特异性结合的蛋白决定簇。表位通常由分子的表面基团诸如氨基酸或糖侧链组成，并且通常具有特定的三维结构特征，以及比电荷特征。构象表位和非构象表位的区别在于与前者而不是后者的结合在变性溶剂存在的情况下会丧失。表位可包含直接参与结合的氨基酸残基和不直接参与结合的其它氨基酸残基，诸如被特异性抗原结合肽有效阻断或覆盖的氨基酸残基(换句话说，氨基酸残基在特异性抗原结合肽的足迹内)。

[0074] 当在抗体或抗体片段的上下文中使用时，“特异性结合”或“免疫特异性结合”或其衍生术语表示通过由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段编码的结构域结合至感兴趣的蛋白质的一个或多个表位，而不优先结合含有混合分子群的样品中的其它分子。通常，‑8通过表面等离振子共振测定或细胞结合测定所测量，抗体以小于约1×10 M的Kd结合至同源抗原。短语诸如“[抗原]特异性”抗体(例如，BCMA特异性抗体)意在表达所述抗体特异性地结合所述抗原。

[0075] 如本文所用，术语“KD”是指特定抗体‑抗原相互作用的解离平衡常数。

[0076] 术语“受治疗者”是指人和非人动物，包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物诸如非人灵长类动物、小鼠、兔、绵羊、狗、猫、马、牛、鸡、两栖动物和爬行动物。在所述方法的许多实施方案中，受治疗者是人。

[0077] 如本文所用，术语“样品”是指与受治疗者分离的类似流体、细胞或组织(例如，手术切除的肿瘤组织、活体组织切片，包括细针抽吸组织)以及存在于受治疗者中的流体、细胞或组织的集合。在一些实施方案中，样品是生物流体。生物流体通常是在生理温度下的液体，并且可包括存在于受治疗者或生物来源中，从受治疗者或生物来源中抽取、表达或以其它方式提取的天然存在的流体。某些生物流体来源于特定组织、器官或局部区域，并且某些其它生物流体可更全身性或系统性地位于受治疗者或生物来源中。生物流体的示例包括血液，血清和浆膜液，血浆，淋巴液，尿液，唾液，囊液，泪液，粪便，痰，分泌组织和器官的粘膜分泌物，阴道分泌物，腹水诸如与非实体肿瘤相关的那些，胸膜、心包、腹膜、腹部和其它体腔的流体，通过支气管灌洗收集的流体等。生物流体还可包括与受治疗者或生物来源接触的液体溶液，例如细胞和器官培养基，包括细胞或器官条件培养基、灌洗液等。如本文所用，术语“样品”涵盖从受治疗者中取出的物质或存在于受治疗者中的物质。

[0078] “已知标准品”可以是具有已知量或已知浓度的BCMA的溶液，其中这种溶液可以是天然存在的溶液，诸如来自已知患有早期、中度、晚期、进行性或静态癌症的患者的样品；或者这种溶液可以是合成溶液，诸如其中稀释了已知量的BCMA的缓冲水溶液。本文所述的已知标准品可包括从受治疗者中分离的BCMA、重组或纯化的BCMA蛋白质或与疾病病症相关的BCMA浓度值。

[0079] 如本文所用的术语“BCMA”涉及人B细胞成熟抗原，也称为BCMA、CD269和TNFRSF17(UniProt Q02223)，是优先在分化的浆细胞中表达的肿瘤坏死受体超家族的成员。人BCMA的细胞外结构域根据UniProt由第1‑54位(或第5‑51位)氨基酸组成。如本文所用的术语“针对BCMA的抗体、抗‑BCMA抗体”涉及免疫特异性地结合BCMA的抗体。

[0080] 术语“CD3”是指人CD3蛋白质多亚基复合体。CD3蛋白质多亚基复合体由6个不同的多肽链构成。这些多肽链包括CD3γ链(SwissProt P09693)、CD3δ链(SwissProt P04234)、两条CD3ε链(SwissProt P07766)和一条CD3ζ链同源二聚体(SwissProt 20963)，并且该复合体与T细胞受体α和β链缔合。除非另有说明，否则术语“CD3”包括由细胞(包括T细胞)天然表达或者可以在用编码那些多肽的基因或cDNA转染的细胞上表达的任何CD3变体、同种型和物种同源物。

[0081] “BCMA×CD3抗体”为多特异性抗体，任选为双特异性抗体，其包含两个不同的抗原结合区，其中一个结合区特异性地结合至抗原BCMA，并且其中另一个结合区特异性地结合至CD3。多特异性抗体可以是双特异性抗体、双体抗体或类似分子(关于双体的描述，参见例如PNAS USA，90(14),6444‑8(1993))。除了BCMA的一部分之外，本文提供的双特异性抗体、双体抗体等可以结合任何合适的靶。术语“双特异性抗体”应理解为具有由不同抗体序列限定的两个不同抗原结合区的抗体。这可以被理解为不同的靶结合，但也包括结合至一个靶中的不同表位。

[0082] “参照样品”是可以与另一个样品诸如测试样品进行比较以表征所比较样品的样品。参照样品将具有一些特征属性，作为与测试样品进行比较的基础。例如，参照样品可用作指示受治疗者患有癌症的BCMA水平的基准。参照样品不一定必须与测试样品并行分析，因此在一些情况下，参照样品可以是先前确定用于表征给定条件的数值或范围，诸如指示受治疗者患有癌症的BCMA水平。该术语还包括已知与生理状态或疾病病症(诸如BCMA表达型癌症)相关但具有未知量的BCMA的用于比较目的的样品。

[0083] 如在BCMA表达型癌症的进展的上下文中使用的术语“进展”包括癌症从不太严重状态到较严重状态的变化。这可包括肿瘤的数量或严重性、癌细胞转移程度、癌症生长或扩散的速度等增大。例如，“结肠癌的进展”包括这种癌症从不太严重状态到较严重状态的进展，诸如从I期到II期、从II期到III期等的进展。

[0084] 如在BCMA表达型癌症的消退的上下文中使用的术语“消退”包括癌症从较严重状态到不太严重状态的变化。这可包括肿瘤的数量或严重性、癌细胞转移程度、癌症生长或扩散的速度等减小。例如，“结肠癌的消退”包括这种癌症从较严重状态到不太严重状态的消退，诸如从III期到II期、从II期到I期等的进展。

[0085] 如在稳定的BCMA表达型癌症的上下文中使用的术语“稳定”旨在描述疾病病症在临床相关时间段内未或尚未出现显著变化以被认为是进展性癌症或消退性癌症。

[0086] 本文所述的实施方案并不限于特定的方法、试剂、化合物、组合物或生物系统，这些方法、试剂、化合物、组合物或生物系统当然可以变化。

[0087] BCMA特异性抗体和抗原结合片段

[0088] 本文描述了特异性地结合BCMA的重组单克隆抗体或抗原结合片段。抗体分子的一般结构包括抗原结合结构域，该结构域包含重链和轻链以及Fc结构域，并发挥多种功能(包括补体固定和结合抗体受体)。

[0089] 所述BCMA特异性抗体或抗原结合片段包括所有同种型IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，以及四链免疫球蛋白结构的合成多聚体。所述抗体或抗原结合片段也包括通常存在于母鸡或火鸡血清和母鸡或火鸡蛋黄中的IgY同种型。

[0090] BCMA特异性抗体和抗原结合片段可通过重组方法来源于任何物种。例如，抗体或抗原结合片段可以是小鼠、大鼠、山羊、马、猪、牛、鸡、兔、羊驼、驴、人或其嵌合型式。为适于施用于人，非人源抗体或抗原结合片段可以在施用于人类患者时被基因或结构改变成抗原性较低。

[0091] 在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段是嵌合的。如本文所用，术语“嵌合”是指抗体或其抗原结合片段的至少一个可变结构域的至少某些部分来源于非人哺乳动物、啮齿动物或爬行动物的抗体氨基酸序列，而抗体或其抗原结合片段的其余部分来源于人。

[0092] 在一些实施方案中，抗体是人源化抗体。人源化抗体可以是含有来源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(诸如Fv、Fab、Fab'、F(ab’)2或抗体的其它抗原结合亚序列)。在很大程度上，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体的互补决定区(CDR)中的残基由具有所需特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠或兔的CDR中的残基替换。一般来讲，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个，且一般是两个可变结构域，其中所有或基本上所有的CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些CDR区，并且所有或基本上所有的框架区是人免疫球蛋白序列的那些框架区。人源化抗体可包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。

[0093] 本文所述的抗体或抗原结合片段可以多种形式存在，但将包含表1所示的抗体CDR中的一者或多者。

[0094] 本文描述了免疫特异性地结合至BCMA的重组抗体和抗原结合片段。在一些实施方案中，BCMA特异性抗体或抗原结合片段是人IgG或其衍生物。虽然本文例示的BCMA特异性抗体或抗原结合片段是人的，但是所例示的抗体或抗原结合片段也可以是嵌合的。

[0095] 在一些实施方案中，提供了BCMA特异性抗体或其抗原结合片段，它们包含含有表1所述抗体中的任一抗体的CDR1、CDR2和CDR3的重链。在一些实施方案中，提供了BCMA特异性抗体或其抗原结合片段，它们包含含有表1所述抗体中的任一抗体的CDR1、CDR2和CDR3的重链以及含有表1所述抗体中的任一抗体的CDR1、CDR2和CDR3的轻链。

[0096] 在一些实施方案中，BCMA特异性抗体和抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:4的重链CDR1、含有SEQ ID NO:5的重链CDR2以及含有SEQ ID NO:6的重链CDR3。在一些实施方案中，BCMA特异性抗体和抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:4的重链CDR1、含有SEQ ID NO:5的重链CDR2、含有SEQ ID NO:6的重链CDR3、含有SEQ ID NO:7的轻链CDR1、含有SEQ ID NO:8的轻链CDR2以及含有SEQ ID NO:9的轻链CDR3。该BCMA特异性抗体或抗原结合片段可包含人框架序列。该BCMA特异性抗体或抗原结合片段可以至少5.9nM的IC50阻断APRIL结合。在一些实施方案中，BCMA特异性抗体和抗原结合片段包含与SEQ ID NO:10基本上相同或相同的重链可变结构域。在一些实施方案中，BCMA特异性抗体和抗原结合片段包含与SEQ ID NO:
10基本上相同或相同的重链可变结构域以及与SEQ ID NO:11基本上相同或相同的轻链可变结构域。本段中所讨论的抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域适于包含在双特异性构建体中，其中一个臂是抗‑BCMA臂。

[0097] 在一些实施方案中，BCMA特异性抗体和抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:4的重链CDR1、含有SEQ ID NO:5的重链CDR2以及含有SEQ ID NO:6的重链CDR3。在一些实施方案中，BCMA特异性抗体和抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:7的重链CDR1、含有SEQ ID NO:5的重链CDR2、含有SEQ ID NO:6的重链CDR3、含有SEQ ID NO:24的轻链CDR1、含有SEQ ID NO:25的轻链CDR2以及含有SEQ ID NO:26的轻链CDR3。该BCMA特异性抗体或抗原结合片段可包含人框架序列。在一些实施方案中，BCMA特异性抗体和抗原结合片段包含与SEQ ID NO:57基本上相同或相同的重链可变结构域。在一些实施方案中，BCMA特异性抗体和抗原结合片段包含与SEQ ID NO:57基本上相同或相同的重链可变结构域以及与SEQ ID NO:28基本上相同或相同的轻链可变结构域。本段中所讨论的抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域适于包含在双特异性构建体中，其中一个臂是抗‑BCMA臂。

[0098] 在一些实施方案中，BCMA特异性抗体和抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:7的重链CDR1、含有SEQ ID NO:5的重链CDR2以及含有SEQ ID NO:6的重链CDR3。在一些实施方案中，BCMA特异性抗体和抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:7的重链CDR1、含有SEQ ID NO:5的重链CDR2、含有SEQ ID NO:6的重链CDR3、含有SEQ ID NO:24的轻链CDR1、含有SEQ ID NO:25的轻链CDR2以及含有SEQ ID NO:26的轻链CDR3。该BCMA特异性抗体或抗原结合片段可包含人框架序列。在一些实施方案中，BCMA特异性抗体和抗原结合片段包含与SEQ ID NO:34基本上相同或相同的重链可变结构域。在一些实施方案中，BCMA特异性抗体和抗原结合片段包含与SEQ ID NO:34基本上相同或相同的重链可变结构域以及与SEQ ID NO:28基本上相同或相同的轻链可变结构域。本段中所讨论的抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域适于包含在双特异性构建体中，其中一个臂是抗‑BCMA臂。

[0099] 在一些实施方案中，BCMA特异性抗体和抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:4的重链CDR1、含有SEQ ID NO:5的重链CDR2以及含有SEQ ID NO:19的重链CDR3。在一些实施方案中，BCMA特异性抗体和抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:4的重链CDR1、含有SEQ ID NO:5的重链CDR2、含有SEQ ID NO:19的重链CDR3、含有SEQ ID NO:24的轻链CDR1、含有SEQ ID NO:25的轻链CDR2以及含有SEQ ID NO:26的轻链CDR3。该BCMA特异性抗体或抗原结合片段可包含人框架序列。在一些实施方案中，BCMA特异性抗体和抗原结合片段包含与SEQ ID NO:39基本上相同或相同的重链可变结构域。在一些实施方案中，BCMA特异性抗体和抗原结合片段包含与SEQ ID NO:39基本上相同或相同的重链可变结构域以及与SEQ ID NO:28基本上相同或相同的轻链可变结构域。本段中所讨论的抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域适于包含在双特异性构建体中，其中一个臂是抗‑BCMA臂。

[0100] 在一些实施方案中，BCMA特异性抗体和抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:4的重链CDR1、含有SEQ ID NO:8的重链CDR2以及含有SEQ ID NO:6的重链CDR3。在一些实施方案中，BCMA特异性抗体和抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:4的重链CDR1、含有SEQ ID NO:8的重链CDR2、含有SEQ ID NO:6的重链CDR3、含有SEQ ID NO:24的轻链CDR1、含有SEQ ID NO:25的轻链CDR2以及含有SEQ ID NO:26的轻链CDR3。该BCMA特异性抗体或抗原结合片段可包含人框架序列。在一些实施方案中，BCMA特异性抗体和抗原结合片段包含与SEQ ID NO:40基本上相同或相同的重链可变结构域。在一些实施方案中，BCMA特异性抗体和抗原结合片段包含与SEQ ID NO:40基本上相同或相同的重链可变结构域以及与SEQ ID NO:28基本上相同或相同的轻链可变结构域。本段中所讨论的抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域适于包含在双特异性构建体中，其中一个臂是抗‑BCMA臂。

[0101] 在一些实施方案中，BCMA特异性抗体和抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:13的重链CDR1、含有SEQ ID NO:5的重链CDR2以及含有SEQ ID NO:19的重链CDR3。在一些实施方案中，BCMA特异性抗体和抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:13的重链CDR1、含有SEQ ID NO:5的重链CDR2、含有SEQ ID NO:19的重链CDR3、含有SEQ ID NO:24的轻链CDR1、含有SEQ ID NO:25的轻链CDR2以及含有SEQ ID NO:26的轻链CDR3。该BCMA特异性抗体或抗原结合片段可包含人框架序列。在一些实施方案中，BCMA特异性抗体和抗原结合片段包含与SEQ ID NO:58基本上相同或相同的重链可变结构域。在一些实施方案中，BCMA特异性抗体和抗原结合片段包含与SEQ ID NO:58基本上相同或相同的重链可变结构域以及与SEQ ID NO:28基本上相同或相同的轻链可变结构域。本段中所讨论的抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域适于包含在双特异性构建体中，其中一个臂是抗‑BCMA臂。

[0102] 在一些实施方案中，BCMA特异性抗体和抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:13的重链CDR1、含有SEQ ID NO:8的重链CDR2以及含有SEQ ID NO:19的重链CDR3。在一些实施方案中，BCMA特异性抗体和抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:13的重链CDR1、含有SEQ ID NO:8的重链CDR2、含有SEQ ID NO:19的重链CDR3、含有SEQ ID NO:24的轻链CDR1、含有SEQ ID NO:25的轻链CDR2以及含有SEQ ID NO:26的轻链CDR3。该BCMA特异性抗体或抗原结合片段可包含人框架序列。在一些实施方案中，BCMA特异性抗体和抗原结合片段包含与SEQ ID NO:43基本上相同或相同的重链可变结构域。在一些实施方案中，BCMA特异性抗体和抗原结合片段包含与SEQ ID NO:43基本上相同或相同的重链可变结构域以及与SEQ ID NO:28基本上相同或相同的轻链可变结构域。本段中所讨论的抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域适于包含在双特异性构建体中，其中一个臂是抗‑BCMA臂。

[0103] 在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段是IgG或其衍生物，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4同种型。在其中抗体是IgG1同种型的一些实施方案中，抗体包含IgG1Fc区(SEQ ID NO.74)。

[0104] SEQ ID NO.74

[0105] ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

[0106] 在其中抗体具有IgG4同种型的一些实施方案中，所述抗体在其Fc区中含有S228P、L234A和L235A置换(SEQ ID NO.73)。

[0107] SEQ ID NO.73

[0108] ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

[0109] 由上述段落中讨论的CDR和/或可变结构域序列限定的特异性抗体可包含这些IgG Fc区。

[0110] 本发明还公开了编码免疫特异性地结合至BCMA的抗体或抗原结合片段的分离的合成多核苷酸。能够编码本文提供的可变结构域区段的分离的多核苷酸可包括在相同或不同的载体上以产生抗体或抗原结合片段。

[0111] 编码重组抗原结合蛋白的多核苷酸也在本公开的范围内。在一些实施方案中，所述多核苷酸(及其编码的肽)包含前导序列。可以使用本领域已知的任何前导序列。前导序列可包含但不限于限制性位点或翻译起始位点。

[0112] 本文所述的BCMA特异性抗体或抗原结合片段包括这样的变体：其具有保留所述BCMA特异性抗体或抗原结合片段的生物特性(例如，结合亲和力或免疫效应子活性)的单个或多个氨基酸置换、缺失或添加。在本发明的上下文中，除非另有说明，否则以下符号用于描述突变；i)给定位置处氨基酸的置换被书写为例如K409R，其意指409位的赖氨酸被精氨酸置换；以及ii)对于特定变体，使用特定的三字母或单字母代码(包括代码Xaa和X)指示任何氨基酸残基。因此，精氨酸置换409位的赖氨酸表示为：K409R，或者任何氨基酸残基置换409位的赖氨酸表示为K409X。在409位的赖氨酸缺失的情况下，用K409*表示。技术人员可制备具有单个或多个氨基酸置换、缺失或添加的变体。

[0113] 这些变体可包括：(a)其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸置换的变体，(b)其中一个或多个氨基酸添加到多肽或从多肽缺失的变体，(c)其中一个或多个氨基酸包括取代基的变体，以及(d)其中多肽与另一种肽或多肽(诸如融合配偶体、蛋白质标签或其它化学部分)融合的变体，其可赋予多肽有用的特性，诸如例如抗体的表位、多组氨酸序列、生物素部分等。本文所述的抗体或抗原结合片段可包括这样的变体：其中来自一个物种的氨基酸残基在保守位置或非保守位置处置换为另一物种中的对应残基。在其它实施方案中，非保守位置处的氨基酸残基被保守或非保守残基置换。得到这些变体的技术，包括基因技术(缺失、突变等)、化学技术和酶技术，是本领域普通技术人员已知的。

[0114] 本文所述的BCMA特异性抗体或抗原结合片段可包括若干抗体同种型，诸如IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在一些实施方案中，抗体同种型为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型，优选为IgG1或IgG4同种型。抗体或其抗原结合片段的特异性主要是由CDR的氨基酸序列和排列决定的。因此，一种同种型的CDR可转变为另一种同种型而不改变抗原特异性。或者，已经建立技术使杂交瘤从产生一种抗体同种型转换到产生另一种同种型(同种型转换)而不改变抗原特异性。因此，这类抗体同种型在所述抗体或抗原结合片段的范围内。

[0115] 本文所述的BCMA特异性抗体或抗原结合片段对于APRIL结合具有至少5.9nM的IC50值。所述BCMA特异性抗体或抗原结合片段的IC50可通过本领域已知的多种方法诸如基于ELISA的方法或流式细胞术(FACS)来测定。用于通过ELISA测量IC50的测定在存在和不存在BCMA特异性抗体的情况下具有板结合的BCMA，并使用不同浓度的APRIL。阻断APRIL与BCMA结合的BCMA抗体是“通过ELISA所测量的阻断APRIL”。

[0116] 还提供了包含本文所述的多核苷酸的载体。载体可以是表达载体。因此，预期包含编码感兴趣多肽的序列的重组表达载体也在本公开的范围内。表达载体可含有一个或多个另外的序列，诸如但不限于调控序列(如启动子、增强子)、选择标记和聚腺苷酸化信号。用于转化多种宿主细胞的载体是熟知的，并且包括但不限于质粒、噬菌粒、粘粒、杆状病毒、杆粒、细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)以及其它细菌、酵母和病毒载体。

[0117] 本说明书范围内的重组表达载体包括合成的、基因组或cDNA衍生的核酸片段，这些片段编码可操作地连接至合适的调控元件的至少一种重组蛋白。此类调节元件可包含转录启动子、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列以及控制转录和翻译的终止的序列。表达载体，特别是哺乳动物表达载体还可包含一个或多个非转录元件，诸如复制起点、连接到待表达的基因的合适启动子和增强子、其它5'或3'侧翼非转录序列、5'或3'非翻译序列(诸如必需的核糖体结合位点)、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点或转录终止序列。也可并入赋予在宿主中复制能力的复制起点。

[0118] 用于转化脊椎动物细胞的表达载体中的转录和翻译控制序列可以由病毒源提供。示例性载体可如Okayama和Berg，3Mol.Cell.Biol.280(1983)所述那样构建。

[0119] 在一些实施方案中，将抗体编码序列或抗原结合片段编码序列置于强效组成型启动子(诸如用于以下基因的启动子：次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)、腺苷脱氨酶、丙酮酸激酶、β‑肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸等)的控制下。此外，许多病毒启动子在真核细胞中组成性地发挥功能，并适合与所述实施方案一起使用。这类病毒启动子包括但不限于细胞巨化病毒(CMV)立即早期启动子、SV40的早期和晚期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、马罗尼白血病病毒的长末端重复序列(LTR)、人免疫缺陷病毒(HIV)、EB病毒(EBV)、劳氏肉瘤病毒(RSV)和其它逆转录病毒，以及单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子。在一个实施方案中，将BCMA特异性抗体或其抗原结合片段编码序列置于诱导型启动子(诸如金属硫蛋白启动子、四环素诱导型启动子、多西环素诱导型启动子、含有一种或多种干扰素刺激的反应元件(ISRE)(诸如蛋白激酶R 2',5'‑寡腺苷酸合成酶、Mx基因、ADAR1等)的启动子)的控制下。

[0120] 本文所述的载体可含有一个或多个内部核糖体进入位点(IRES)。IRES序列包含在融合载体中可能有利于增强一些蛋白质的表达。在一些实施方案中，载体系统将包括一个或多个聚腺苷酸化位点(例如，SV40)，这些位点可在任何上述核酸序列的上游或下游。载体组分可连续地连接，或以提供用于表达基因产物的最佳间距的方式(即通过在ORF之间引入“间隔区”核苷酸)排列，或以另一种方式定位。调控元件诸如IRES基序也可被布置成提供用于表达的最佳间距。

[0121] 载体可包含本领域熟知的选择标记。选择标记包括阳性选择标记和阴性选择标记，例如抗生素抗性基因(例如新霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、四环素抗性基因、青霉素抗性基因、嘌呤霉素抗性基因、杀稻瘟菌素抗性基因)、谷氨酸合酶基因、HSV‑TK、用于更昔洛韦选择的HSV‑TK衍生物或用于6‑甲基嘌呤选择的细菌嘌呤核苷磷酸化酶基因(Gadi等人，7Gene Ther.1738‑1743(2000))。编码选择标记或克隆位点的核酸序列可以在编码感兴趣的多肽或克隆位点的核酸序列的上游或下游。

[0122] 本文所述的载体可用于用编码所述抗体或抗原结合片段的基因转化各种细胞。例如，所述载体可用于生成BCMA特异性抗体或产生抗原结合片段的细胞。因此，另一方面的特征是用包含编码特异性地结合BCMA的抗体或其抗原结合片段(诸如本文所描述和例示的抗体或抗原结合片段)的核酸序列的载体转化的宿主细胞。

[0123] 本领域已知用于将外来基因引入细胞中的多种技术，并且出于实施所述方法的目的，这些技术可用于根据本文所描述和例示的各种实施方案构建重组细胞。所使用的技术应当使得异源基因序列向宿主细胞稳定转移，以致异源基因序列是可遗传的并且可由细胞子代表达，从而受体细胞的必要发育和生理功能不被破坏。可以使用的技术包括但不限于染色体转移(例如细胞融合、染色体介导的基因转移、微细胞介导的基因转移)、物理方法(例如转染、原生质球融合、显微注射、电穿孔、脂质体载体)、病毒载体转移(例如，重组DNA病毒、重组RNA病毒)等(描述于Cline,29 Pharmac.Ther.69‑92(1985))。也可以使用磷酸钙沉淀和聚乙二醇(PEG)诱导的细菌原生质体与哺乳动物细胞的融合来转化细胞。

[0124] 适用于表达本文所述的BCMA特异性抗体或抗原结合片段的细胞优选是真核细胞，更优选是植物、啮齿动物或人来源的细胞，例如但不限于NS0、CHO、CHOK1、perC.6、Tk‑ts13、BHK、HEK293细胞、COS‑7、T98G、CV‑1/EBNA、L细胞、C127、3T3、HeLa、NS1、Sp2/0骨髓瘤细胞和BHK细胞系等。此外，可使用杂交瘤细胞完成抗体的表达。用于产生杂交瘤的方法是本领域中已良好建立的。

[0125] 可以选择或筛选用本文所述的表达载体转化的细胞用于本文所述的抗体或抗原结合片段的重组表达。扩增和筛选重组阳性细胞，筛选表现出所需表型(诸如高水平表达、增强的生长特性或例如由于蛋白质修饰或改变的翻译后修饰产生具有所需生化特征的蛋白质的能力)的亚克隆。这些表型可能是由于给定亚克隆的固有性质或由于突变造成的。突变可通过使用化学品、UV波长光、辐射、病毒、插入诱变剂、DNA错配修复的抑制或这些方法的组合来实现。

[0126] 使用BCMA特异性抗体进行治疗的方法

[0127] 本文提供了在治疗中使用的BCMA特异性抗体或其抗原结合片段。具体地讲，这些抗体或抗原结合片段可用于治疗癌症，诸如BCMA表达型癌症。因此，本发明提供了治疗癌症的方法，该方法包括施用如本文所述的抗体，诸如BCMA特异性抗体或抗原结合片段。例如，该用途可通过干扰BCMA‑受体相互作用或其中抗体缀合到毒素，从而将毒素靶向BCMA表达型癌症。在一些实施方案中，BCMA表达型癌症包括淋巴瘤诸如多发性骨髓瘤(MM)。用于这些方法的抗体包括上文所述的那些抗体，例如具有表1所述特征的BCMA特异性抗体或抗原结合片段，例如在这些抗体的进一步论述中的CDR或可变结构域序列。

[0128] 在本文所述的一些实施方案中，BCMA特异性抗体的免疫效应子特性可通过本领域技术人员已知的技术经由Fc修饰得到增强或沉默。例如，Fc效应子功能诸如C1q结合、补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)、细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)的下调等，可通过修饰促成这些活性的Fc中的残基来提供和/或控制。

[0129] “抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指细胞介导的反应，在这个反应过程中，表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上的结合抗体并随后致使靶细胞裂解。

[0130] 单克隆抗体诱导ADCC的能力可通过改造其寡糖组分来增强。人IgG1或IgG3在Asn297处被熟知的双分枝G0、G0F、G1、G1F、G2或G2F形式的大多数聚糖N‑糖基化。未工程化的CHO细胞所产生的抗体通常具有约至少85％的聚糖岩藻糖含量。从连接到Fc区的双分枝复合物型低聚糖去除核心岩藻糖，可经由改善的Fc.γ.RIIIa结合来增强抗体的ADCC，而不会改变抗原结合或CDC活性。此类mAb可使用据报道能引起具有双分枝复合物型Fc低聚糖的相对较高去岩藻糖基化抗体的成功表达的不同方法实现，诸如控制培养物渗透压(Konno等人，Cytotechnology，64:249‑65，2012)，应用变体CHO细胞系Lec13作为宿主细胞系(Shields等人，JBiol Chem，277:26733‑26740，2002)，应用变体CHO细胞系EB66作为宿主细胞系(Olivier等人，MAbs，2(4)，2010；Epub ahead of print；PMID：20562582)，应用大鼠杂交瘤细胞系YB2/0作为宿主细胞系(Shinkawa等人，J Biol Chem；278:3466‑3473；2003)，引入特异性针对α1,6‑岩藻糖基转移酶(FUT8)基因的小干扰RNA(Mori等人，Biotechnol Bioeng，88:901‑908，2004)，或共表达β‑1,4‑N‑乙酰氨基葡萄糖转移酶III和高尔基体α‑甘露糖苷酶II或强效α‑甘露糖苷酶I抑制剂，几夫碱(Ferrara等人，J Biol Chem，281:5032‑5036，2006；Ferrara等人，Biotechnol Bioeng，93:851‑861，2006；Xhou等人，Biotechnol Bioeng，99:652‑65，2008)。

[0131] 在本文所述的一些实施方案中，也可通过抗体Fc中的某些置换来增强由BCMA抗体引发的ADCC。示例性置换为例如在氨基酸位置256、290、298、312、356、330、333、334、360、378或430(根据EU索引对残基进行编号)处的置换，如美国专利6,737,056中所述。

[0132] 检测BCMA的方法

[0133] 本文提供了用于通过使样品与本文所述的抗体或其抗原结合片段接触来检测生物样品中的BCMA的方法。如本文所述，样品可来源于尿液、血液、血清、血浆、唾液、腹水、循环细胞、循环肿瘤细胞、非组织缔合的细胞(即游离细胞)、组织(例如手术切除的肿瘤组织、活体组织切片，包括细针抽吸组织)、组织学制备物等。在一些实施方案中，所述方法包括通过使样品与本文所述的任何BCMA特异性抗体或其抗原结合片段接触来检测生物样品中的BCMA。

[0134] 在一些实施方案中，样品可以与本文所述的BCMA特异性抗体或抗原结合片段中的多于一种接触。例如，样品可以与第一BCMA特异性抗体或其抗原结合片段接触，然后与第二BCMA特异性抗体或其抗原结合片段接触，其中第一抗体或抗原结合片段和第二抗体或抗原结合片段不是相同的抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，第一抗体或其抗原结合片段在接触样品之前可以附连至表面，诸如多孔板、芯片或类似的底物上。在其它实施方案中，第一抗体或其抗原结合片段在接触样品之前完全可以不附连或连接至任何物体。

[0135] 可以对所述BCMA特异性抗体和抗原结合片段进行可检测地标记。在一些实施方案中，通过本文所述的方法，标记的抗体和抗原结合片段可有利于检测BCMA。许多这样的标记是本领域技术人员容易知晓的。例如，合适的标记包括但不应当认为其限于放射标记、荧光111
标记、表位标签、生物素、发色团标记、ECL标记或酶。更具体地讲，所述标记包括钌、 In‑
111
DOTA、 In‑二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和β‑半乳糖苷酶、聚组氨酸(HIS标签)、吖啶染料、花青染料、荧光酮染料、噁嗪染料、菲啶染料、罗丹明染料、染料等。

[0136] 所述BCMA特异性抗体和抗原结合片段可用于多种测定中以检测生物样品中的BCMA。一些合适的测定包括但不应当认为其限于蛋白质印迹分析、放射性免疫测定、表面等离振子共振、免疫荧光测定、免疫沉淀、平衡透析、免疫扩散、电化学发光(ECL)免疫测定、免疫组织化学、荧光激活细胞分选(FACS)或ELISA测定。

[0137] 在本文所述的一些实施方案中，受治疗者中BCMA表达型癌细胞的检测可用于确定受治疗者是否可用针对BCMA的治疗剂进行治疗。

[0138] BCMA以可检测的水平存在于血液和血清样品中。因此，本文提供了用于通过使样品与特异性地结合BCMA的抗体或其抗原结合片段接触来检测来源于血液的样品(诸如血清样品)中的BCMA的方法。血液样品或其衍生物可以被稀释、分馏或以其它方式处理以得到可对其执行所述方法的样品。在一些实施方案中，可以通过本领域已知的任意数量的测定检测血液样品或其衍生物中的BCMA，这些测定诸如但不限于蛋白质印迹分析、放射性免疫测定、表面等离振子共振、免疫荧光测定、免疫沉淀、平衡透析、免疫扩散、电化学发光(ECL)免疫测定、免疫组织化学、荧光激活细胞分选(FACS)或ELISA测定。

[0139] 用于诊断癌症的方法

[0140] 本文提供了用于诊断受治疗者中BCMA表达型癌症的方法。在一些实施方案中，BCMA表达型癌症包括淋巴瘤诸如多发性骨髓瘤(MM)。在一些实施方案中，如上文所述，检测生物样品诸如血液样品或血清样品中的BCMA提供了诊断从其取得样品的受治疗者中癌症的能力。或者，在一些实施方案中，其它样品诸如组织学样品、细针抽吸样品、切除的肿瘤组织、循环细胞、循环肿瘤细胞等也可用于评估从其取得样品的受治疗者是否患有癌症。在一些实施方案中，可能已经知道从其取得样品的受治疗者患有癌症，但是可能尚未诊断出受治疗者所患癌症的类型或者初步诊断结果可能不清楚，因此检测获自受治疗者的生物样品中的BCMA可实现或明确癌症的诊断。例如，可能已知受治疗者患有癌症，但是可能不知道或可能不清楚受治疗者所患癌症是否是BCMA表达型的。

[0141] 在一些实施方案中，所述方法涉及通过测定来源于受治疗者的生物样品中存在的BCMA的量来评估受治疗者是否患有BCMA表达型癌症；并且将所观测到的BCMA的量与对照或参照样品中的BCMA的量进行比较，其中来源于受治疗者的样品中BCMA的量与对照或参照样品中BCMA的量之间的差值指示受治疗者患有BCMA表达型癌症。在另一个实施方案中，可将所观测到的获自受治疗者的生物样品中BCMA的量与已知与癌症的某些形式或阶段相关的BCMA水平进行比较，从而确定受治疗者所患癌症的形式或阶段。在一些实施方案中，通过使样品与免疫特异性地结合BCMA的抗体或其抗原结合片段(诸如本文所述的BCMA特异性抗体)接触来评估来源于受治疗者的样品中BCMA的量。评估其中BCMA的存在的样品可来源于尿液、血液、血清、血浆、唾液、腹水、循环细胞、循环肿瘤细胞、非组织缔合的细胞(即游离细胞)、组织(例如手术切除的肿瘤组织、活体组织切片，包括细针抽吸组织)、组织学制备物等。在一些实施方案中，BCMA表达型癌症包括血液学癌症诸如多发性骨髓瘤(MM)。在一些实施方案中，受治疗者是人。

[0142] 在一些实施方案中，诊断BCMA表达型癌症的方法将涉及：使受治疗者的生物样品与BCMA特异性抗体或其抗原结合片段(诸如可来源于表1中提供的抗体和片段的那些)接触；定量分析由抗体或其抗原结合片段结合的样品中存在的BCMA的量；将样品中存在的BCMA的量与已知标准品或参照样品进行比较；并确定受治疗者的BCMA水平是否落入与癌症相关的BCMA水平内。在另外的实施方案中，诊断方法之后可以是施用或给出癌症特异性治疗的附加步骤。在另一个实施方案中，诊断方法之后可以是传送测定结果以便于治疗癌症的附加步骤。在一些实施方案中，癌症特异性治疗可针对BCMA表达型癌症，诸如本文所述的BCMA×CD3多特异性抗体。

[0143] 在一些实施方案中，所述方法涉及通过测定获自受治疗者的血液或血清样品中存在的BCMA的量来评估受治疗者是否患有BCMA表达型癌症；并且将所观测到的BCMA的量与对照或参照样品中的BCMA的量进行比较，其中来源于受治疗者的样品中BCMA的量与对照或参照样品中BCMA的量之间的差值指示受治疗者患有BCMA表达型癌症。

[0144] 在一些实施方案中，对照或参照样品可来源于不患有BCMA表达型癌症的受治疗者。在一些实施方案中，对照或参照样品可来源于患有BCMA表达型癌症的受治疗者。在其中对照或参照样品来源于不患有BCMA表达型癌症的受治疗者的一些实施方案中，观察到的测试样品中存在的BCMA的量相对于观察到的对照或参照样品中BCMA的量有所增加，指示所评估的受治疗者患有BCMA表达型癌症。在其中对照样品来源于不患有BCMA表达型癌症的受治疗者的一些实施方案中，观察到的测试样品中存在的BCMA的量相对于观察到的对照或参照样品中BCMA的量有所减少或近似，指示所评估的受治疗者不患有BCMA表达型癌症。在其中对照或参照样品来源于患有BCMA表达型癌症的受治疗者的一些实施方案中，观察到的测试样品中存在的BCMA的量相对于观察到的对照或参照样品中BCMA的量近似，指示所评估的受治疗者患有BCMA表达型癌症。在其中对照样品或参照样品来源于患有BCMA表达型癌症的受治疗者的一些实施方案中，观察到的测试样品中存在的BCMA的量相对于观察到的对照或参照样品中BCMA的量有所减少，指示所评估的受治疗者不患有BCMA表达型癌症。

[0145] 在一些实施方案中，通过使样品与特异性地结合BCMA的抗体或其抗原结合片段(诸如本文所述的抗体)接触来评估来源于受治疗者的样品中BCMA的量。评估其中BCMA的存在的样品可来源于血液样品、血清样品、循环细胞、循环肿瘤细胞、非组织缔合的细胞(即游离细胞)、组织(例如手术切除的肿瘤组织、活体组织切片，包括细针抽吸组织)、组织学制备物等。

[0146] 在各个方面，通过使样品与特异性地结合BCMA的抗体或其抗原结合片段接触来测定BCMA的量。在一些实施方案中，样品可与特异性地结合BCMA的抗体或其抗原结合片段中的多于一种类型接触。在一些实施方案中，样品可与特异性地结合BCMA的第一抗体或其抗原结合片段接触，然后与特异性地结合BCMA的第二抗体或其抗原结合片段接触。BCMA特异性抗体或抗原结合片段，诸如本文所述的那些可用于这种功能中。

[0147] 可以使用BCMA特异性抗体和抗原结合片段的各种组合来提供“第一”和“第二”抗体或抗原结合片段以实施所述诊断方法。在一些实施方案中，BCMA表达型癌症包括淋巴瘤诸如多发性骨髓瘤(MM)。

[0148] 在某些实施方案中，通过蛋白质印迹分析、放射性免疫测定、免疫荧光测定、免疫沉淀、平衡透析、免疫扩散、电化学发光(ECL)免疫测定、免疫组织化学、荧光激活细胞分选(FACS)或ELISA测定来测定BCMA的量。

[0149] 在所述诊断方法的各种实施方案中，使用了对照样品或参照样品。该样品可以是确保所用测定正常工作的阳性或阴性测定对照样；例如，这种性质的测定对照样通常可用于免疫组织化学测定中。或者，该样品可以是来自健康受治疗者的生物样品中BCMA量的标准化参照样品。在一些实施方案中，可以将测试受治疗者的所观测到的BCMA水平与在来自已知患有BCMA表达型癌症的受治疗者的样品中所观测到的BCMA水平进行比较。在一些实施方案中，对照受治疗者可能患有感兴趣的特定癌症。在一些实施方案中，已知对照受治疗者患有早期癌症，其可能是或可能不是BCMA表达型癌症。在一些实施方案中，已知对照受治疗者患有中期癌症，其可能是或可能不是BCMA表达型癌症。在一些实施方案中，已知对照受治疗者患有晚期癌症，其可能是或可能不是BCMA表达型癌症。

[0150] 用于监测癌症的方法

[0151] 本文提供了用于监测受治疗者中BCMA表达型癌症的方法。在一些实施方案中，BCMA表达型癌症包括淋巴瘤诸如多发性骨髓瘤(MM)。在一些实施方案中，所述方法涉及通过测定来源于受治疗者的测试样品中存在的BCMA的量来评估BCMA表达型癌症是否正在进展、消退或保持稳定；并且将所观测到的BCMA的量与在较早时间点以类似方式获自受治疗者的生物样品中BCMA的量进行比较，其中测试样品与较早样品中BCMA的量之间的差值提供了癌症是否正在进展、消退或保持稳定的指示。就这一点而言，测试样品中BCMA的量相对于所观测到的较早样品中的量有所增加可指示BCMA表达型癌症的进展。相反，测试样品中BCMA的量相对于所观测到的较早样品中的量有所减少可指示BCMA表达型癌症的消退。

[0152] 因此，测试样品中BCMA的量相对于所观测到的较早样品中的量差别不明显可指示BCMA表达型癌症处于稳定疾病状态。在一些实施方案中，通过使样品与特异性地结合BCMA的抗体或其抗体片段(诸如本文所述的抗体)接触来评估来源于受治疗者的生物样品中BCMA的量。评估其中BCMA的存在的样品可来源于尿液、血液、血清、血浆、唾液、腹水、循环细胞、循环肿瘤细胞、非组织缔合的细胞(即游离细胞)、组织(例如手术切除的肿瘤组织、活体组织切片，包括细针抽吸组织)、组织学制备物等。在一些实施方案中，受治疗者是人。

[0153] 在一些实施方案中，监测BCMA表达型癌症的方法将涉及：使受治疗者的生物样品与BCMA特异性抗体或其抗原结合片段(诸如可来源于表1中所提供的抗体和片段的那些)接触；定量分析样品中存在的BCMA的量；将样品中存在的BCMA的量与在较早时间点以类似方式获自相同受治疗者的生物样品中所测定的BCMA的量进行比较；并确定受治疗者的BCMA水平是否随时间变化。测试样品中BCMA的量相对于所观测到的较早样品中的量有所增加可指示癌症的进展。相反，测试样品中BCMA的量相对于所观测到的较早样品中的量有所减少可指示BCMA表达型癌症的消退。因此，测试样品中BCMA的量相对于所观测到的较早样品中的量差别不明显可指示BCMA表达型癌症处于稳定疾病状态。在一些实施方案中，样品的BCMA水平可以单独与已知标准品或参照样品进行比较，或者样品的BCMA水平除与所观测到的在较早时间点评估的样品中的BCMA水平进行比较之外，也可以与已知标准品或参照样品进行比较。在另外的实施方案中，诊断方法之后可以是施用癌症特异性治疗的附加步骤。在一些实施方案中，癌症特异性治疗可针对BCMA表达型癌症，诸如本文所述的BCMA×CD3多特异性抗体。

[0154] 在各个方面，通过使样品与特异性地结合BCMA的抗体或其抗原结合片段接触来测定BCMA的量。在一些实施方案中，样品可与特异性地结合BCMA的抗体或其抗原结合片段中的多于一种类型的接触。在一些实施方案中，样品可与特异性地结合BCMA的第一抗体或其抗原结合片段接触，然后与特异性地结合BCMA的第二抗体或其抗原结合片段接触。抗体诸如本文所述的那些可用于这种功能中。

[0155] 可以使用表1中所述的抗体和抗原结合片段的各种组合来提供“第一”和“第二”抗体或抗原结合片段以实施所述的监测方法。在一些实施方案中，BCMA表达型癌症包括血液学癌症诸如急性骨髓性白血病(AML)。

[0156] 在某些实施方案中，通过蛋白质印迹分析、放射性免疫测定、免疫荧光测定、免疫沉淀、平衡透析、免疫扩散、电化学发光(ECL)免疫测定、免疫组织化学、荧光激活细胞分选(FACS)或ELISA测定来测定BCMA的量。

[0157] 用于检测BCMA的试剂盒

[0158] 本文提供了用于检测生物样品中的BCMA的试剂盒。这些试剂盒包括本文所述的BCMA特异性抗体或其抗原结合片段中的一种或多种，以及试剂盒的使用说明。

[0159] 所提供的BCMA特异性抗体或抗原结合片段可以在溶液中；被冻干；附连到底物、载体或板；或被可检测地标记。

[0160] 所述试剂盒还可包括用于实施本文所述方法的附加组分。举例来说，试剂盒可包括用于从受治疗者获得样品的装置、对照或参照样品(例如来自患有进展缓慢的癌症的受治疗者和/或不患癌症的受治疗者的样品)、一个或多个样品室和/或描述本发明方法的性能的说明材料、以及组织特异性对照或标准品。

[0161] 用于测定BCMA的水平的装置还可包括例如在用于测定BCMA水平的测定中使用的缓冲液或其它试剂。说明书可以是例如用于执行测定的印刷说明书和/或用于评价BCMA的表达水平的说明书。

[0162] 所述试剂盒还可包括用于从受治疗者分离出样品的装置。这些装置可包括可用于从受治疗者中获得流体或组织的设备或试剂中的一项或多项。用于从受治疗者中获得样品的装置还可包括用于从血液样品中分离出血液组分诸如血清的装置。优选的是，将试剂盒设计成与人类受治疗者一起使用。

[0163] 多特异性抗体

[0164] 本文所述的抗‑BCMA抗体的结合结构域识别在其表面上表达BCMA的细胞。如上文所述，BCMA表达可指示癌细胞。更特异性地靶向特定细胞亚群可通过制备结合至BCMA和另一个靶(诸如CD3)的双特异性分子(诸如抗体或抗体片段)来实现。这通过制备包含结合至BCMA的第一区和结合至另一个靶抗原的第二结合区的分子来实现。抗原结合区可采取允许靶的特异性识别的任何形式，例如结合区可以是或可包含重链可变结构域、Fv(重链可变结构域和轻链可变结构域的组合)、基于III型纤连蛋白结构域的结合结构域(诸如来自纤连蛋白或基于来自纤连蛋白的III型结构域的共有序列，或来自腱生蛋白或基于来自腱生蛋白的III型结构域的共有序列，诸如来自Janssen Biotech有限公司的Centyrin分子，参见例如WO2010/051274和WO2010/093627)。因此，提供了包含分别结合BCMA和另一抗原的两个不同抗原结合区的双特异性分子。

[0165] 本文所述的一些多特异性抗体包含分别结合BCMA和CD3的两个不同的抗原结合区。在优选的实施方案中，提供了结合BCMA和CD3的多特异性抗体(BCMA×CD3多特异性抗体)及其多特异性抗原结合片段。在一些实施方案中，BCMA×CD3多特异性抗体包含配对形成免疫特异性地结合BCMA的第一抗原结合位点的第一重链(HC1)和第一轻链(LC1)，以及配对形成免疫特异性地结合CD3的第二抗原结合位点的第二重链(HC2)和第二轻链(LC2)。在优选的实施方案中，BCMA×CD3多特异性抗体是包含BCMA特异性臂和CD3特异性臂的双特异性抗体，BCMA特异性臂包含配对形成免疫特异性地结合CD3的第一抗原结合位点的第一重链(HC1)和第一轻链(LC1)，CD3特异性臂包含配对形成免疫特异性地结合BCMA的第二抗原结合位点的第二重链(HC2)和第二轻链(LC2)。在一些实施方案中，本发明的双特异性抗体包括具有全长抗体结构的抗体。如本文所用，“全长抗体”是指具有两条全长抗体重链和两条全长抗体轻链的抗体。全长抗体重链(HC)包含重链可变结构域VH和重链恒定结构域CH1、CH2和CH3。全长抗体轻链(LC)包含轻链可变结构域VL和轻链恒定结构域CL。全长抗体可以在一条或两条重链中缺少C‑端赖氨酸(K)。术语“Fab臂”或“半分子”是指特异性地结合抗原的一个重链‑轻链对。在一些实施方案中，抗原结合结构域之一是基于非抗体的结合结构域，例如基于3型纤连蛋白结构域的结合结构域，如Centyrin。

[0166] 本文提供的多特异性抗体的BCMA结合臂可来源于上述BCMA特异性抗体中的任一种。在这类BCMA结合臂的一些示例性实施方案中，结合BCMA的第一抗原结合区包含来源于如表1中所述的抗体克隆的重链CDR1、CDR2和CDR3。在这类BCMA结合臂的一些示例性实施方案中，结合BCMA的第一抗原结合区包含来源于如表1中所述的抗体克隆的重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3。在这类BCMA结合臂的一些示例性实施方案中，结合BCMA的第一抗原结合区包含克隆BCMB69、BCMB117、BCMB123、BCMB128、BCMB129、BCMB176或BCMB177的重链CDR1、CDR2和CDR3。在这类BCMA结合臂的一些示例性实施方案中，结合BCMA的第一抗原结合区包含克隆BCMB69、BCMB117、BCMB123、BCMB128、BCMB129、BCMB176或BCMB177的重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3。在这类BCMA结合臂的一些示例性实施方案中，结合BCMA的第一抗原结合区包含来源于如表1中所述的抗体克隆的重链可变结构域。在这类BCMA结合臂的一些示例性实施方案中，结合BCMA的第一抗原结合区包含来源于如表1中所述的抗体克隆的重链可变结构域和轻链可变结构域。在这类BCMA结合臂的一些示例性实施方案中，结合BCMA的第一抗原结合区包含克隆BCMB69、BCMB117、BCMB123、BCMB128、BCMB129、BCMB176或BCMB177的重链可变结构域。在这类BCMA结合臂的一些示例性实施方案中，结合BCMA的第一抗原结合区包含克隆BCMB69、BCMB117、BCMB123、BCMB128、BCMB129、BCMB176或BCMB177的重链可变结构域和轻链可变结构域。

[0167] 表3提供了BCMA×CD3双特异性抗体的列表，该双特异性抗体具有特异于BCMA的一个重链和轻链对和特异于CD3的另一个重链和轻链对，其中列出了特定抗体ID以描述用于产生所述实施方案的抗原特异性抗体臂。

[0168] 表3：

[0169]

[0170] 在双特异性抗体的一些实施方案中，BCMA结合臂也结合食蟹猴BCMA，优选其细胞外结构域。

[0171] 在一些实施方案中，多特异性抗体的BCMA结合臂是IgG或其衍生物，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4同种型。在其中BCMA结合臂具有IgG4同种型的一些实施方案中，所述结合臂在其Fc区中包含S228P、L234A和L235A置换。

[0172] 在双特异性抗体的一些实施方案中，第二抗原结合臂结合人CD3。在一些优选的实施方案中，BCMA×CD3双特异性抗体的CD3特异性臂来源于结合并激活人原代T细胞和/或食蟹猴原代T细胞的CD3特异性抗体。在一些实施方案中，CD3结合臂结合至CD3ε的N端处的表位。在一些实施方案中，CD3结合臂接触包含CD3ε的六个N端氨基酸的表位。在一些实施方案中，双特异性抗体的CD3特异性结合臂来源于小鼠单克隆抗体SP34，一种小鼠IgG3/λ同种‑7型。在一些实施方案中，CD3结合臂包含抗体SP34的CDR。此类CD3结合臂可以5×10 M或更‑7 ‑8 ‑8 ‑9 ‑9
低，诸如1×10 M或更低、5×10 M或更低、1×10 M或更低、5×10 M或更低、或者1×10 M或更低的亲和力结合至CD3。CD3特异性结合臂可以是小鼠单克隆抗体SP34的臂的人源化型式。人框架适应(HFA)可用于人源化从其衍生CD3特异性臂的抗‑CD3抗体。在双特异性抗体的一些实施方案中，CD3结合臂包含选自表2的重链和轻链对。在双特异性抗体的其它实施方案中，CD3结合臂包含表2中所示的重链CDR1、CDR2和CDR3序列以及轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。例如，本文所述的双特异性抗体的CD3结合臂的一些实施方案的重链CDR序列和轻链CDR序列可包含以下氨基酸序列：HcCDR1，SEQ ID NO:59；Hc CDR2:SEQ ID NO:60；Hc CDR3，SEQ ID NO:61；Lc CDR1，SEQ ID NO:62；Lc CDR2:SEQ ID NO:63；和Lc CDR3，SEQ ID NO:
64。

[0173] 在一些实施方案中，CD3结合臂是IgG或其衍生物。在一些实施方案中，CD3结合臂是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在其中CD3结合臂具有IgG4同种型的一些实施方案中，所述结合臂在其Fc区中含有S228P、L234A、L235A、F405L和R409K置换。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段结合原代人T细胞上的CD3ε。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段结合原代食蟹猴T细胞上的CD3ε。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段结合原代人和食蟹猴T细胞上的CD3ε。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段激活原代人CD4+ T细胞。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段激活原代食蟹猴CD4+ T细胞。

[0174] 在一些实施方案中，提供了具有BCMA结合臂的BCMA×CD3双特异性抗体，所述BCMA结合臂包含抗体克隆BCMB69、BCMB117、BCMB123、BCMB128、BCMB129、BCMB176或BCMB177的重链。在一些实施方案中，提供了具有BCMA结合臂的BCMA×CD3双特异性抗体，所述BCMA结合臂包含抗体克隆BCMB69、BCMB117、BCMB123、BCMB128、BCMB129、BCMB176或BCMB177的重链和轻链。在一些实施方案中，提供了具有包含抗体克隆CD3B219的重链的CD3结合臂的BCMA×CD3双特异性抗体。在一些实施方案中，提供了具有包含抗体克隆CD3B219的重链和轻链的CD3结合臂的BCMA×CD3双特异性抗体。在一些实施方案中，提供了具有BCMA结合臂和CD3结合臂的BCMA×CD3双特异性抗体，所述BCMA结合臂包含抗体克隆BCMB69、BCMB117、BCMB123、BCMB128、BCMB129、BCMB176或BCMB177的重链，所述CD3结合臂包含抗体克隆CD3B219的重链。在一些实施方案中，提供了具有BCMA结合臂和CD3结合臂的BCMA×CD3双特异性抗体，所述BCMA结合臂包含抗体克隆BCMB69、BCMB117、BCMB123、BCMB128、BCMB129、BCMB176或BCMB177的重链和轻链，所述CD3结合臂包含抗体克隆CD3B219的重链和轻链。

[0175] 表9中提供了示例性的BCMA×CD3双特异性抗体。

[0176] 不同形式的双特异性抗体已有所描述，并且最近由Chames和Baty在Curr Opin Drug Disc Dev，2009年，第12卷，第276页中进行了综述。

[0177] 在一些实施方案中，本发明的双特异性抗体是通过受控Fab臂交换得到的双体抗体、交叉体或双特异性抗体，如本发明所述的那些。

[0178] 在一些实施方案中，双特异性抗体包括具有互补CH3结构域以强制发生异源二聚体化的IgG样分子；重组IgG样双靶向分子，其中该分子的两侧各自含有至少两种不同抗体的Fab片段的一部分或Fab片段；IgG融合分子，其中全长IgG抗体与额外的Fab片段或Fab片段的部分融合；Fc融合分子，其中单链Fv分子或稳定的双体抗体与重链恒定结构域、Fc区或其部分融合；Fab融合分子，其中不同的Fab片段融合在一起；基于ScFv和双体抗体的重链抗体(例如结构域抗体、纳米抗体)，其中不同的单链Fv分子或不同的双体抗体或不同的重链抗体(例如结构域抗体、纳米抗体)彼此融合或与另一蛋白或载体分子融合。

[0179] 在一些实施方案中，具有互补CH3结构域分子的IgG样分子包括Triomab/Quadroma(Trion Pharma/Fresenius Biotech)、纽扣结构(Knobs‑into‑Holes)(Genentech)、CrossMAbs(Roche)和静电配对体(electrostatically‑matched)(Amgen)、LUZ‑Y(Genentech)、链交换工程结构域体(Strand Exchange Engineered Domain body)
(SEEDbody)(EMD Serono)、Biclonic(Merus)和 (Genmab A/S)。

[0180] 在一些实施方案中，重组IgG样双靶向分子包括双重靶向(DT)‑Ig(GSK/Domantis)、二合一抗体(Genentech)、交联Mabs(Karmanos Cancer Center)、mAb2(F‑Star)和CovX体(CovX/Pfizer)。

[0181] 在一些实施方案中，IgG融合分子包括双重可变结构域(DVD)‑Ig(Abbott)、IgG样双特异性抗体(InnClone/Eli Lilly)、Ts2Ab(MedImmune/AZ)和BsAb(Zymogenetics)、HERCULES(Biogen Idec)以及TvAb(Roche)。

[0182] 在一些实施方案中，Fc融合分子包括ScFv/Fc融合体(Academic Institution)、SCORPION(Emergent BioSolutions/Trubion,Zymogenetics/BMS)、双亲和性再靶向技术(Fc‑DART)(MacroGenics)以及Dual(ScFv).sub.2‑Fab(中国国家抗体医药研究中心(National Research Center for Antibody Medicine‑‑China))。

[0183] 在一些实施方案中，Fab融合双特异性抗体包括F(ab)2(Medarex/AMGEN)、Dual‑Action或Bis‑Fab(Genentech)、Dock‑and‑Lock(DNL)(ImmunoMedics)、二价双特异性抗体(Biotecnol)和Fab‑Fv(UCB‑Celltech)。基于ScFv的、基于双体抗体的结构域抗体包括但不限于双特异性T细胞衔接器(BITE)(Micromet)、串联双体抗体(Tandab)(Affimed)、双亲和性再靶向分子(DART)(MacroGenics)、单链双体抗体(Academic)、TCR样抗体(AIT,ReceptorLogics)、人血清白蛋白ScFv融合体(Merrimack)和COMBODY(Epigen Biotech)、双靶向纳米抗体(Ablynx)、仅双重靶向重链结构域抗体。

[0184] 本发明的全长双特异性抗体可以例如使用两个单特异性二价抗体之间的Fab臂交换(或半分子交换)通过下列方式产生：在每个半分子中的重链CH3交界处引入置换以促成两个在体外无细胞环境中或使用共表达而具有不同特异性的抗体半分子的异源二聚体形成。Fab臂交换反应是二硫键异构化反应和CH3结构域解离‑缔合的结果。亲本单特异性抗体的铰链区中的重链二硫键减少。亲本单特异性抗体之一的所得游离半胱氨酸与第二亲本单特异性抗体分子的半胱氨酸残基形成重链间二硫键，同时亲本抗体的CH3结构域通过解离‑缔合而释放和重新形成。可以将Fab臂的CH3结构域改造成促成异源二聚化而非同源二聚化。所得产物是具有两个Fab臂或半分子的双特异性抗体，这两个Fab臂或半分子各自结合不同的表位，即BCMA上的表位和CD3上的表位。

[0185] 如本文所用，“同源二聚化”是指具有相同CH3氨基酸序列的两条重链的相互作用。如本文所用，“同源二聚体”是指具有含有相同CH3氨基酸序列的两条重链的抗体。

[0186] 如本文所用，“异源二聚化”是指具有不同CH3氨基酸序列的两条重链的相互作用。如本文所用，“异源二聚体”是指具有含有不同CH3氨基酸序列的两条重链的抗体。

[0187] “钮扣”技术(参见，例如PCT国际公布WO 2006/028936)可用于产生全长双特异性抗体。简而言之，在人IgG中形成CH3结构域的交界的选定氨基酸可在影响CH3结构域相互作用的位置处突变，从而促进异源二聚体形成。将具有小侧链(扣)的氨基酸引入特异性地结合第一抗原的抗体的重链中，并将具有大侧链(钮)的氨基酸引入特异性地结合第二抗原的抗体的重链中。在两种抗体共表达后，由于具有“扣”的重链与具有“钮”的重链的优先相互作用而形成异源二聚体。形成钮和扣的示例性CH3置换对(表示为第一重链的第一CH3结构域中的修饰位置/第二重链的第二CH3结构域中的修饰位置)是：T366Y/F405A、T366W/F405W、F405W/Y407A、T394W/Y407T、T394S/Y407A、T366W/T394S、F405W/T394S和T366W/T366S_L368A_Y407V。

[0188] 还可使用其它技术，诸如通过在一个CH3表面置换带正电荷的残基并在另一CH3表面置换带负电荷的残基使用静电相互作用促进重链异源二聚化，如美国专利公布US2010/0015133；美国专利公布US2009/0182127；美国专利公布US2010/028637或美国专利公布US2011/0123532中所述。在其它技术中，可通过下面的置换(表示为第一重链的第一CH3结构域中的修饰位置/第二重链的第二CH3结构域中的修饰位置)促进异源二聚化：L351Y_F405AY407V/T394W、T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V、T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V、L351Y_Y407A/T366A_K409F、L351Y_Y407A/T366V K409F Y407A/T366A_K409F或T350V_L351Y_F405A Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W，如美国专利公布US2012/0149876或美国专利公布US2013/0195849中所述。

[0189] 除上述方法之外，本发明的双特异性抗体也可在体外无细胞环境中通过下列方式产生：在两种单特异性同源二聚抗体的CH3区中引入不对称突变，并在还原条件下由两种亲本单特异性同源二聚抗体形成双特异性异源二聚抗体，从而根据国际专利公布W02011/131746中所述的方法允许二硫键异构化。在所述方法中，将第一单特异性二价抗体(例如，抗‑BCMA抗体)和第二单特异性二价抗体(例如，抗‑CD3抗体)改造为在CH3结构域处具有促进异源二聚体稳定性的某些置换；将这些抗体在足以使铰链区中的半胱氨酸发生二硫键异构化的还原条件下一起温育；从而通过Fab臂交换产生双特异性抗体。温育条件最佳可恢复到非还原条件。可使用的示例性还原剂为2‑巯基乙胺(2‑MEA)、二硫苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇(DTE)、谷胱甘肽、三(2‑羧乙基)膦(TCEP)、L‑半胱氨酸和β‑巯基乙醇，优选地为选自2‑巯基乙胺、二硫苏糖醇和三(2‑羧乙基)膦的还原剂。例如，可使用如下条件：在至少25mM 2‑MEA的存在下或至少0.5mM二硫苏糖醇的存在下，在5‑8的pH例如pH7.0或pH7.4，至少20℃的温度下，温育至少90分钟。

[0190] 除了所述BCMA×CD3多特异性抗体之外，还提供了能够编码所述BCMA×CD3多特异性抗体的多核苷酸序列。还提供了包含所述多核苷酸的载体，以及表达本文提供的BCMA×CD3多特异性抗体的细胞。还描述了能够表达所公开的载体的细胞。这些细胞可以是哺乳动物细胞(诸如293F细胞、CHO细胞)、昆虫细胞(诸如Sf7细胞)、酵母细胞、植物细胞或细菌细胞(诸如大肠杆菌)。所述抗体也可以由杂交瘤细胞产生。

[0191] 治疗组合物和使用多特异性抗体及其多特异性抗原结合片段进行治疗的方法[0192] 上文所述的BCMA双特异性抗体，例如上文所述的BCMA×CD3双特异性抗体可用于治疗中。具体地讲，BCMA双特异性抗体可用于治疗癌症。本文还提供了用于治疗哺乳动物中过度增殖性障碍的治疗组合物，该组合物包含治疗有效量的本文所述的多特异性抗体或多特异性抗原结合片段和药学上可接受的载体。在优选的实施方案中，多特异性抗体为如本文所述的BCMA×CD3多特异性抗体或其多特异性抗原结合片段，更优选为如本文所述的BCMA×CD3双特异性抗体或其BCMA×CD3双特异性抗原结合片段。在一个实施方案中，所述药物组合物用于治疗BCMA表达型癌症，包括(但不限于)以下癌症：BCMA表达型B细胞癌症，诸如多发性骨髓瘤(MM)；以及其中表达BCMA的其它尚待确定的癌症。可用于治疗癌症(诸如血液学癌症，包括上文所述的特定癌症)的特定双特异性抗体包括抗体BCMB69、BCMB117、BCMB123、BCMB128、BCMB129、BCMB176或BCMB177或CD3B219。可用于治疗癌症(诸如血液学癌症，包括这些特定癌症)的双特异性抗体的一个示例是BCMB72。

[0193] 本文提供的药物组合物包含：a)有效量的本发明的多特异性抗体或抗体片段，以及b)药学上可接受的载体，其可以是惰性或生理活性载体。在优选的实施方案中，多特异性抗体为如本文所述的BCMA×CD3多特异性抗体或其多特异性抗原结合片段，更优选为如本文所述的BCMA×CD3双特异性抗体或其BCMA×CD3双特异性抗原结合片段。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂等。合适的载体、稀释剂和/或赋形剂的示例包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等以及它们的任意组合中的一者或多者。在许多情况下，优选的是组合物中包含等渗剂，诸如糖、多元醇或氯化钠。具体地讲，合适的载体的相关示例包括：(1)pH为约7.4、含或不含约1mg/mL至25mg/mL人血清白蛋白的杜氏磷酸盐缓冲盐水，(2)0.9％盐水(0.9％w/v氯化钠(NaCl))，以及(3)5％(w/v)右旋糖；并且还可含有抗氧化剂诸如色胺和稳定剂诸如Tween

[0194] 本文的组合物还可含有对所治疗的特定障碍必需的另外治疗剂。优选的是，多特异性抗体或抗体片段和补充活性化合物将具有不会对彼此产生不利影响的互补活性。在一个优选的实施方案中，另外的治疗剂是阿糖胞苷、蒽环霉素、组胺二盐酸盐或白介素2。在一个优选的实施方案中，另外的治疗剂是化学治疗剂。

[0195] 本发明的组合物可具有多种形式。这些形式包括例如液体、半固体和固体剂型，但优选的形式取决于预期的施用模式和治疗应用。典型的优选组合物为可注射或可输注溶液的形式。优选的施用方式是肠胃外施用(例如静脉内施用、肌内施用、腹膜内施用、皮下施用)。在一个优选的实施方案中，本发明的组合物通过推注静脉内施用或通过在一段时间内连续输注施用。在另一个优选的实施方案中，这些组合物通过肌内、皮下、关节内、滑膜内、肿瘤内、肿瘤周围、病灶内或病灶周围途径注射，以发挥局部以及全身治疗效果。

[0196] 用于肠胃外施用的无菌组合物可通过下列方式制备：将所需量的本发明的抗体、抗体片段或抗体缀合物掺入合适的溶剂中，然后通过微滤技术进行灭菌。可使用水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等以及它们的组合作为溶剂或媒介物。在许多情况下，优选的是组合物中包含等渗剂，诸如糖、多元醇或氯化钠。这些组合物还可含有辅助剂，尤其是润湿剂、等渗剂、乳化剂、分散剂和稳定剂。用于肠胃外施用的无菌组合物也可制备成无菌固体组合物的形式，其在使用时可溶解于无菌水或任何其它可注射的无菌介质中。

[0197] 多特异性抗体或抗体片段也可以口服施用。作为用于口服施用的固体组合物，可使用片剂、丸剂、粉剂(明胶胶囊、小药囊)或颗粒剂。在这些组合物中，根据本发明的活性成分与一种或多种惰性稀释剂(诸如淀粉、纤维素、蔗糖、乳糖或二氧化硅)在氩气流下混合。这些组合物还可包含除稀释剂之外的物质，例如一种或多种润滑剂(诸如硬脂酸镁或滑石)、着色剂、包衣(糖衣片)或釉料。

[0198] 作为用于口服施用的液体组合物，可使用含有惰性稀释剂(诸如水、乙醇、甘油、植物油或石蜡油)的药学上可接受的溶液、混悬剂、乳剂、糖浆剂和酏剂。这些组合物可包含除稀释剂之外的物质，例如润湿、增甜、增稠、矫味或稳定产品。

[0199] 这些物质的剂量取决于期望的效应、治疗持续时间和所用的施用途径；对于成人来说，通常每日口服5mg和1000mg之间的这些物质，单位剂量在1mg至250mg活性物质范围内。一般来讲，医生将根据年龄、体重和待治疗的受治疗者特有的任何其它因素来确定合适的剂量。

[0200] 本文还提供了通过向对其此需要的患者施用结合所述BCMA并能够募集T细胞来杀伤所述BCMA+细胞(即T细胞重定向)的多特异性抗体来杀伤BCMA+细胞的方法。本发明的多特异性抗体或抗体片段中的任一种可以治疗方式使用。例如，在一个实施方案中，BCMA×CD3多特异性抗体BCMB72可以治疗方式用于治疗受治疗者的癌症。

[0201] 在一个优选的实施方案中，本发明的多特异性抗体或抗体片段用于治疗哺乳动物中的过度增殖性障碍。在一个更优选的实施方案中，含有本发明的多特异性抗体或抗体片段的上文所公开的药物组合物之一用于治疗哺乳动物中的过度增殖性障碍。在一个实施方案中，该障碍是癌症。具体地讲，所述癌症是BCMA表达型癌症，包括(但不限于)以下癌症：BCMA表达型B细胞癌症，诸如多发性骨髓瘤(MM)；以及其中表达BCMA的其它尚待确定的癌症。在优选的实施方案中，多特异性抗体为如本文所述的BCMA×CD3多特异性抗体或其多特异性抗原结合片段，更优选为如本文所述的BCMA×CD3双特异性抗体或其BCMA×CD3双特异性抗原结合片段。

[0202] 因此，本发明的药物组合物可用于治疗或预防多种癌症，这些癌症包括(但不限于)以下：BCMA表达型癌症，包括(但不限于)以下癌症：BCMA表达型B细胞癌症，诸如多发性骨髓瘤(MM)；以及其中表达BCMA的其它尚待确定的癌症。

[0203] 类似地，本文还提供了用于抑制所选细胞群的生长的方法，该方法包括在外周血单核细胞(PBMC)的存在下使BCMA表达型靶细胞或含有此类靶细胞的组织与有效量的本发明的多特异性抗体或抗体片段单独接触，或使BCMA表达型靶细胞或含有此类靶细胞的组织接触有效量的本发明的多特异性抗体或抗体片段与其它细胞毒性剂或治疗剂的组合。在优选的实施方案中，多特异性抗体为如本文所述的BCMA×CD3多特异性抗体或其多特异性抗原结合片段，更优选为如本文所述的BCMA×CD3双特异性抗体或其BCMA×CD3双特异性抗原结合片段。在一个优选的实施方案中，另外的治疗剂是阿糖胞苷、蒽环霉素、组胺二盐酸盐或白介素2。在一个优选的实施方案中，另外的治疗剂是化学治疗剂。用于抑制所选细胞群的生长的方法可以在体外、体内或离体执行。

[0204] 体外使用的示例包括在移植到同一患者中之前处理自体骨髓以杀伤患病细胞或恶性细胞；在移植之前处理骨髓以杀伤感受态T细胞并预防移植物抗宿主病(GVHD)；处理细胞培养物以杀伤除不表达靶抗原的所需变体之外的所有细胞；或杀伤表达不期望抗原的变体。本领域的普通技术人员易于确定非临床体外使用的条件。

[0205] 临床离体使用的示例是在癌症治疗中在自体移植之前除去骨髓中的肿瘤细胞。处理可按照下列步骤进行。从患者或其它个体中采集骨髓，然后在含有向其中加入本发明的细胞毒性剂的血清的培养基中温育。浓度范围为约10μM至1μM，在约37℃下温育约30分钟至约48小时。本领域的普通技术人员易于确定浓度和温育时间的确切条件，即剂量。温育后，用含有血清的培养基洗涤骨髓细胞，并且将这些骨髓细胞根据已知方法通过静脉内输注返回患者身上。在患者接受其它治疗(诸如在骨髓采集时间和处理过的细胞再输注时间之间的消融化疗或全身放疗的过程)的情况下，使用标准医疗设备将处理过的骨髓细胞冷冻保存在液氮中。

[0206] 对于临床体内使用，将治疗有效量的多特异性抗体或抗原结合片段施用于对其有需要的受治疗者。例如，BCMA×CD3多特异性抗体及其多特异性抗原结合片段可用于治疗对其有需要的受治疗者中的BCMA表达型癌症。在一些实施方案中，BCMA表达型癌症是B细胞癌症，诸如多发性骨髓瘤(MM)。在优选的实施方案中，多特异性抗体为如本文所述的BCMA×CD3多特异性抗体或其多特异性抗原结合片段，更优选为如本文所述的BCMA×CD3双特异性抗体或其BCMA×CD3双特异性抗原结合片段。在一些实施方案中，受治疗者是哺乳动物，优选是人。在一些实施方案中，多特异性抗体或抗原结合片段将以经测试其无菌性的溶液形式施用。

[0207] 调节上述治疗方法和用途中的剂量方案以提供最佳的期望响应(例如治疗响应)。例如，可施用单次推注，可随着时间推移施用若干分份剂量，或如由治疗情况的紧急指示可按比例减少或增加剂量。肠胃外组合物可配制成易于施用且剂量一致的剂量单位形式。

[0208] 多特异性抗体和片段的有效剂量和剂量方案取决于待治疗的疾病或病症，并且可由本领域技术人员确定。本发明的化合物的治疗有效量的示例性、非限制性范围为约0.001‑10mg/kg，诸如约0.001‑5mg/kg(如约0.001‑2mg/kg)，诸如约0.001‑1mg/kg(例如约
0.001mg/kg、约0.01mg/kg、约0.1mg/kg、约1mg/kg或约10mg/kg)。

[0209] 本领域中具有普通技能的医师或兽医可容易地确定和开出所需药物组合物的有效量。例如，医师或兽医开始在药物组合物中使用的多特异性抗体或片段的剂量的水平可以低于为了达到期望的治疗效果所需的水平，然后逐渐增加剂量直至达到所需的效果。通常，本发明的双特异性抗体的合适日剂量将是有效产生治疗效果的最低剂量的化合物的量。施用方式可为例如肠胃外施用，诸如静脉内、肌内或皮下。在一个实施方案中，多特异性2
抗体或片段可通过以mg/m计算的每周剂量输注来施用。根据下式：剂量(mg/kg)×70:1.8，这样的剂量可例如基于以上提供的mg/kg剂量。这样的施用可重复如1至8次，诸如3至5次。
可通过在2至24小时(诸如2至12小时)的时间段内连续输注进行施用。在一个实施方案中，多特异性抗体或片段可通过长时间(诸如多于24小时)的缓慢连续输注来施用，以便减少毒副作用。

[0210] 在一个实施方案中，多特异性抗体或片段可以作为固定剂量计算的每周剂量方式施用多达八次，诸如当每周施用一次时为四至六次。这样的方案可根据需要例如在六个月或十二个月后重复一次或多次。这样的固定剂量可例如基于以上提供的mg/kg剂量，其中体重估计为70kg。可通过测量本发明的双特异性抗体在通过例如取出生物样品施用时在血液中的量并且使用靶向本发明的多特异性抗体的BCMA抗原结合区的抗独特型抗体来测定或调节剂量。

[0211] 在一个实施方案中，多特异性抗体或片段可通过维持疗法施用，诸如例如每周一次，持续六个月或更长时间。

[0212] 还可以预防性地施用多特异性抗体或片段，以便降低罹患癌症的风险、延迟癌症进展中事件的发作和/或在癌症缓解后降低复发的风险。

[0213] 如本文所述的多特异性抗体及其片段还可以组合疗法施用，即与待治疗的疾病或病症相关的其它治疗剂组合。因此，在一个实施方案中，含抗体的药物用于与一种或多种另外的治疗剂(诸如化学治疗剂)组合。在一些实施方案中，其它治疗剂是阿糖胞苷、蒽环霉素、组胺二盐酸盐或白介素2。这种组合施用可以任何顺序同时、分开或顺序进行。对于同时施用，这些治疗剂可作为一种组合物施用或作为单独的组合物施用，视情况而定。

[0214] 在一个实施方案中，提供了一种用于治疗受治疗者中涉及表达BCMA的细胞的障碍的方法，该方法包括向对其有需要的受治疗者施用治疗有效量的多特异性抗体或片段(诸如本文所述的BCMA×CD3双特异性抗体)以及放射疗法。在一个实施方案中，提供了一种用于治疗或预防癌症的方法，该方法包括向对其有需要的受治疗者施用治疗有效量的多特异性抗体或片段(诸如本文所述的BCMA×CD3抗体)以及放射疗法。放射疗法可包括辐射或向患者施用相关放射性药物。辐射源可以在被治疗患者的外部或内部(辐射治疗可以是例如体外放射治疗(EBRT)或短距离放射治疗(BT)的形式)。可用于实施此类方法的放射性元素包括例如镭、铯‑137、铱‑192、镅‑241、金‑198、钴‑57、铜‑67、锝‑99、碘‑123、碘‑131和铟‑111。

[0215] 试剂盒

[0216] 本文还提供了试剂盒，该试剂盒包括例如所述的多特异性抗体或其抗原结合片段以及使用所述抗体或片段杀伤特定类型细胞的说明书。在优选的实施方案中，多特异性抗体为如本文所述的BCMA×CD3多特异性抗体或其多特异性抗原结合片段，更优选为如本文所述的BCMA×CD3双特异性抗体或其BCMA×CD3双特异性抗原结合片段。说明书可包括在体外、体内或离体使用多特异性抗体或其抗原结合片段的说明。

[0217] 通常，试剂盒将具有包含多特异性抗体或其抗原结合片段的隔室。多特异性抗体或其抗原结合片段可以是冻干形式、液体形式或适于包括在试剂盒中的其它形式。试剂盒也可包括实施试剂盒中说明书上所述方法所需的其它元件，例如用于复原冻干粉末的无菌溶液、用于在施用于患者之前与多特异性抗体或其抗原结合片段组合的其它试剂以及有助于向患者施用多特异性抗体或其抗原结合片段的工具。

[0218] 诊断用途

[0219] 本文所述的多特异性抗体和片段也可用于诊断目的。因此，还提供了包含如本文定义的多特异性抗体或片段的诊断组合物及其用途。在优选的实施方案中，多特异性抗体为如本文所述的BCMA×CD3多特异性抗体或其多特异性抗原结合片段，更优选为如本文所述的BCMA×CD3双特异性抗体或其BCMA×CD3双特异性抗原结合片段。在一个实施方案中，本发明提供了用于诊断癌症的试剂盒，该试剂盒包括容纳双特异性BCMA×CD3抗体和用于检测抗体与BCMA的结合的一种或多种试剂的容器。试剂可包括例如荧光标签、酶标签或其它可检测标签。试剂还可包括用于酶反应的二级或三级抗体或试剂，其中酶反应生成能够可视化的产物。例如，本文所述的多特异性抗体或其抗原结合片段可以用放射标记物、荧光111 111
标记物、表位标签、生物素、发色团标记物、ECL标记物、酶、钌、 In‑DOTA、 In‑二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和β‑半乳糖苷酶，或者聚组氨酸或本领域已知的类似此类标记物进行标记。

[0220] 所述主题的示例性实施方案

[0221] 为了更好和更全面地描述本文的主题，本部分提供了所提出的主题的枚举的示例性实施方案。

[0222] 枚举的实施方案：

[0223] 1.一种免疫特异性地结合至BCMA的重组抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体具有重链和轻链，所述重链包含：

[0224] a.具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的重链CDR3；

[0225] b.具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的重链CDR3；

[0226] c.具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的重链CDR3；

[0227] d.具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的重链CDR3；

[0228] e.具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的重链CDR3；

[0229] f.具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的重链CDR3；

[0230] g.具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的重链CDR3。

[0231] 2.根据实施方案1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体还包含具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的轻链CDR1，具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的轻链CDR3。

[0232] 3.根据实施方案1所述的抗体或抗原结合片段，其中(a)的所述抗体的重链包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列；(b)的所述抗体的重链包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列；(f)的所述抗体的重链包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；(k)的所述抗体的重链包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；(l)的所述抗体的重链包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列；(m)的所述抗体的重链包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列，或者(n)的所述抗体的重链包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列。

[0233] 4.根据实施方案2或实施方案3所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体的轻链包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列。

[0234] 5.根据实施方案1至4中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段结合至人BCMA的细胞外结构域。

[0235] 6.根据实施方案1至5中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是人抗体或抗原结合片段。

[0236] 7.根据实施方案1至6中任一项所述的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段是Fab片段、Fab2片段或单链抗体。

[0237] 8.根据实施方案1至7中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段抑制BCMA和APRIL的相互作用。

[0238] 9.根据实施方案8所述的抗体或抗原结合片段，其中通过ELISA所测量，所述抗体或抗原结合片段表现出对于BCMA和APRIL的相互作用的约5.9nM的IC50。

[0239] 10.根据实施方案1至9中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是IgG。

[0240] 11.根据实施方案1至10中任一项所述的抗体或抗原结合片段是IgG4同种型。

[0241] 12.根据实施方案11所述的抗体，其中IgG4在其Fc区中具有S228P置换、L234A置换和L235A置换。

[0242] 13.根据实施方案1至12中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段免疫特异性地结合人BCMA并与食蟹猴BCMA交叉反应。

[0243] 14.根据实施方案1至13中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段结合人骨髓瘤细胞的表面上的BCMA。

[0244] 15.根据实施方案1至14中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段结合人多发性骨髓瘤细胞的表面上的BCMA。

[0245] 16.一种重组细胞，所述细胞表达根据实施方案1至15中任一项所述的抗体或抗原结合片段。

[0246] 17.根据实施方案16所述的细胞，其中所述细胞是杂交瘤。

[0247] 18.根据实施方案16所述的细胞，其中所述抗体是重组产生的。

[0248] 19.一种重组BCMA×CD3双特异性抗体或其BCMA×CD3双特异性结合片段，包含：

[0249] a)第一重链(HC1)；

[0250] b)第二重链(HC2)；

[0251] c)第一轻链(LC1)；以及

[0252] d)第二轻链(LC2)，

[0253] 其中HC1与LC1缔合并且HC2与LC2缔合，并且其中HC1包含SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:61并且LC1包含SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:64以形成免疫特异性地结合CD3的第一抗原结合位点，并且其中HC2包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6a并且LC2包含SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26以形成免疫特异性地结合BCMA的第二抗原结合位点。

[0254] 20.根据实施方案19所述的重组BCMA×CD3双特异性抗体或其片段，包含含有SEQ ID NO:55的HC1、含有SEQ ID NO:56的LC1、含有SEQ ID NO:65的HC2和含有a)SEQ ID NO:66或b)SEQ ID NO:76的LC2。

[0255] 21.根据实施方案20所述的BCMA×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段，其中所述抗体或双特异性结合片段是IgG。

[0256] 22.根据实施方案19、实施方案20或实施方案21中任一项所述的BCMA×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段，其中所述抗体或双特异性结合片段是IgG4同种型。

[0257] 23.根据实施方案19至22所述的BCMA×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段，其中通过表面等离振子共振所测量，所述抗体或双特异性结合片段以至少0.22nM的亲和力免疫特异性地结合人BCMA。

[0258] 24.根据实施方案19至23所述的BCMA×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段，其中所述抗体或其双特异性结合片段结合人骨髓瘤细胞的表面上的BCMA。

[0259] 25.根据实施方案19至24所述的BCMA×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段，其中所述抗体或其双特异性结合片段结合人多发性骨髓瘤细胞的表面上的BCMA。

[0260] 26.根据实施方案19至25所述的BCMA×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段，其中所述抗体或双特异性结合片段以小于约0.37nM的EC50诱导人T细胞体外活化。

[0261] 27.根据实施方案19至26所述的BCMA×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段，其中所述抗体或双特异性结合片段以小于约0.45nM的EC50诱导BCMA表达型细胞在体外的T细胞依赖性细胞毒性。

[0262] 28.根据实施方案19至27所述的BCMA×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段，其中所述抗体或双特异性结合片段不是BCMA激动剂。

[0263] 29.根据实施方案19至28所述的BCMA×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段，其中所述抗体或双特异性结合片段在低于10nM的浓度下不改变NF‑κB活化。

[0264] 30.一种重组细胞，所述细胞表达根据实施方案19至29中任一项所述的抗体或双特异性结合片段。

[0265] 31.根据实施方案30所述的细胞，其中所述细胞是杂交瘤。

[0266] 32.一种用于治疗患有癌症的受治疗者的方法，所述方法包括向对其有需要的受治疗者施用治疗有效量的根据实施方案19至29中任一项的BCMA×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段足以治疗癌症的时间。

[0267] 33.一种用于抑制癌细胞的生长或增殖的方法，所述方法包括施用治疗有效量的根据实施方案19至29中任一项所述的BCMA CD3双特异性抗体或双特异性结合片段以抑制癌细胞的生长或增殖。

[0268] 34.一种将T细胞重定向至BCMA表达型癌细胞的方法，所述方法包括施用治疗有效量的根据实施方案19至29中任一项所述的BCMA×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段以将T细胞重定向至癌症。

[0269] 35.根据实施方案32、33或34所述的方法，其中所述癌症为血液学癌症。

[0270] 36.根据实施方案35所述的方法，其中所述血液学癌症是BCMA表达型B细胞癌症。

[0271] 37.根据实施方案36所述的方法，其中所述BCMA表达型B细胞癌症是多发性骨髓瘤。

[0272] 38.根据实施方案32所述的方法，还包括施用第二治疗剂。

[0273] 39.根据实施方案38所述的方法，其中所述第二治疗剂是化学治疗剂或靶向抗癌治疗剂。

[0274] 40.根据实施方案39所述的方法，其中所述化学治疗剂是阿糖胞苷、蒽环霉素、组胺二盐酸盐或白介素2。

[0275] 41.一种药物组合物，包含根据实施方案19至29中任一项所述的BCMA×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段以及药学上可接受的载体。

[0276] 42.一种方法，所述方法用于通过培养根据实施方案30至31中任一项所述的细胞来生成根据实施方案19至29中任一项的BCMA×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段。

[0277] 43.一种分离的合成多核苷酸，所述多核苷酸编码根据实施方案19至29中任一项所述的BCMA×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段的HC1、HC2、LC1或LC2。

[0278] 44.一种试剂盒，包括如根据实施方案19至29中任一项所述的BCMA×CD3双特异性抗体或双特异性结合片段和/或如根据权利要求44所述的多核苷酸及其包装。

附图说明

[0279] 图1A和图1B：用于克隆人BCMA(图1A)和食蟹猴BCMA(图1B)的载体。

[0280] 图2A至图2D：BCMB69表位位置以及人BCMA和BCMB69之间的相互作用。(图2A)表位位置的概述。BCMB69结合至BCMA的凹表面(黑色区域)。(图2B)示出BCMA和BCMB69之间的直接接触的相互作用图。来自除CDR‑L1外的所有CDR的残基接触BCMA。范德华相互作用以虚线示出，H键为带箭头实线(指示主链H键并指向主链原子)。同时与BCMB69和APRIL接触的BCMA残基具有黑框。使用 的截断距离鉴定接触残基(H键的 距离阈值)。(图2C和图2D)BCMA与BCMB69轻链(图2C)和重链(图2D)的主要相互作用的近视图。H键以虚线示出，距离单位为埃。

[0281] 图3：BCMB69的表位残基和互补位残基。表位残基和互补位残基被遮蔽，CDR区用下划线标出(Kabat定义)，并且与人不同的BCMA残基以粗斜体表示。仅示出BCMB69 Fab序列和胞外BCMA序列。

[0282] 图4A和图4B：BCMB69 Fab和APRIL(图4A)和BCMB69 FabBAFF(图4B)之间的碰撞区。将BCMA/BCMB69复合物结构覆盖在BCMA/APRIL和BCMA/BAFF复合物上，显示出Fab和配体之间的碰撞区。显示BCMA的溶剂可及表面。Fab分子和配体分子分别显示为灰色和黑色动画。
通过在两种复合物中叠加等量的BCMA Cα原子实现覆盖(APRIL复合物的RMSD为 BAFF复合物的RMSD为 )。

[0283] 图5：BCMB72的SPR数据表明该分子具有与人、食蟹猴和小鼠BCMA的结合。与人BCMA相比，食蟹猴和小鼠BCMA的平均KD分别约为36倍和402倍。

[0284] 图6：BCMB72结合在BCMA+细胞系上的EC50测定。使用BCMB72将BCMA的细胞系染色。示出了BCMB72与细胞结合的几何平均荧光强度。在图例中标出EC50。在约100nM的浓度处达到饱和。平均荧光强度被认为用于导出以下细胞的EC50值：U2932细胞(EC50＝7.92nM)、MM1R细胞(EC50＝8.74nM)、H929细胞(EC50＝14.7nM)、EJM细胞(EC50＝17.5nM)和LP1细胞(EC50＝
22.3nM)。使用具有可变斜率(四个参数)函数的非线性回归在GraphPad Prism 6中完成数据的作图和拟合。

[0285] 图7：全血中BCMB72结合特征。用针对BCMA或BCMB72的单克隆或多克隆抗体对来自三个正常人供体的全血进行染色。使用标准细胞特异性标记进行门控分析以鉴定白细胞群体中的淋巴细胞。在图中示出一个代表性供体的染色强度，其中黑色实线是感兴趣的抗体，并且具有填充灰色的虚线是对应的同种型。在三个正常供体的淋巴细胞、单核细胞、粒细胞或类浆细胞DC中没有观察到BMCA表达。BCMB72显示与所有三个供体中的CD3+ T细胞的结合，其中供体之间强度不同。BCMB72不与本测定中测试的任何其它细胞类型结合。

[0286] 图8A至图8E：存在各种MM细胞系时BCMB72依赖性T细胞活化。使H929细胞(图9A)、MM.1R细胞(图9B)、RPMI 8226细胞(图9C)、U266细胞(图9D)和Mv4‑11细胞(图9E)经受在来自六个正常供体(示出了供体平均值±SEM)的T细胞存在下的所指示抗体和Fc阻断剂(2mg/mL)持续48小时。在所述图上示出了EC50值。统计分析：除了模型收敛的简单事实之外，关于LogEC50的95％置信区间的宽度被认为用于评价拟合适当。(使用关于LogEC50的置信区间是因为它是对称的；而关于EC50本身的置信区间则不是)。小于+/‑2的区间(或总的95％置信区间宽度小于4)被认为是足够的。

[0287] 图9：使用来自多个正常供体的T细胞进行的两个独立实验得出的EC50和最大T细胞活化值的汇总。示出每个细胞系和每个实验的单独供体值和供体平均值。没有数据＝未测试；无拟合＝软件无法生成曲线；

[0288] 图10A至图10E：各种多发性骨髓瘤细胞系的T细胞介导的BCMB72依赖性细胞毒性。使H929细胞(图11A)、MM.1R细胞(图11B)、RPMI 8226细胞(图11C)、U266细胞(图11D)和Mv4‑
11细胞(图11E)经受在来自六个正常供体(示出了供体平均值±SEM)的T细胞存在下的所指示抗体浓度和Fc阻断剂(2mg/mL)持续48小时。在所述图上示出了EC50值。统计分析：除了模型收敛的简单事实之外，关于LogEC50的95％置信区间的宽度被认为用于评价拟合适当。(使用关于LogEC50的置信区间是因为它是对称的；而关于EC50本身的置信区间则不是)。小于+/‑2的区间(或总的95％置信区间宽度小于4)被认为是足够的。

[0289] 图11：使用来自多个正常供体的T细胞进行的两个独立实验得出的EC50和最大裂解值的汇总。示出每个细胞系和每个实验的单独供体值和供体平均值。没有数据＝未测试；无拟合＝软件无法生成曲线；

[0290] 图12：H929细胞中的细胞毒性和T细胞活化。在T细胞介导的细胞毒性测定中测试BCMA×CD3双特异性抗体(BCMB72的突变体分子)。在来自正常供体的外源人T细胞(供体ID：M5763和M6576)的存在下，将BCMA阳性细胞系(H929)与各种浓度的抗体一起温育48小时。温育48小时后，通过基于流式细胞术的方法(FACS)测量细胞杀伤，并在图12A中以细胞毒性％报告。图12B示出了T细胞活化，通过在T细胞表面上的CD25上调所评估。一般来讲，数据点沿所生成的拟合曲线紧密对准，并且T细胞供体和重复研究之间几乎没有变异性。

[0291] 图13：BCMB72介导的细胞因子释放的EC50值的汇总。使用基于MSD的多重测定收集来自细胞毒性实验(参见实施例12，图8)的RPMI8226细胞上清液并针对六种不同的细胞因子水平进行分析。以各种浓度使用BCMB72(BCMA×CD3)和对照抗体(BCMA×空白和空白×CD3)。

[0292] 图14A和图14B：使用BCMA阳性H929细胞系进行T细胞介导的BCMB72依赖性细胞毒性测定。使细胞经受在来自多个正常供体(将三个供体M7197、M5137和M6457的汇总作为代表示出)的T细胞存在下不同浓度的BCMB72和Fc阻断剂(2mg/mL)持续48小时。效应子/靶细胞(E/T)比率为5:1。图14A示出了细胞毒性潜力，而图14B在右侧示出了BCMB72各批次之间相似的T细胞活化曲线。

[0293] 图15：用BCMB72(BCMA×CD3)和对照抗体(BCMA×空白和空白×CD3)以上述图中X轴上所示的剂量处理H929细胞30分钟，并使用根据按照ProteinSimple用户手册的标准方案的Simple Western分析方法分析总蛋白。使用肌动蛋白作为管家基因对数据进行归一化，并将比率绘制在Y轴上。如所预期的，APRIL和BAFF诱导P38的磷酸化，并且抗体在任何测试浓度下都没有刺激效应。

[0294] 图16A至图16F：用TNFα和各种浓度的APRIL或BCMB72刺激表达BCMA的HEK‑NFκB细胞(图16A、图16C和图16E)或亲本细胞(图16B、图16D和图16F)。分析三个时间点，16小时(图16A和图16B)、24小时(图16C和图16D)和48小时(图16E和图16F)。TNFα诱导的HEK‑Nf‑kB亲本细胞和HEK‑NF‑kB‑BCMA细胞二者中的NF‑kB活化，而APRIL诱导仅在BCMA特异性细胞类型中可见。BCMB72对亲本细胞系没有效应，并且在BCMA表达型细胞中仅在高浓度时显示活化。

[0295] 图17A和图17B：T细胞不表现出sBCMA介导的和BCMB72依赖性活化。在各种剂量的可溶性BCMA ECD存在下，用来自两个正常供体(M7077和M5137)的T细胞滴定BCMB72(图17A)和空白×CD3对照抗体(图17B)。数据：平均值±SEM。

[0296] 图18A至图18F：可溶性因子sBCMA、APRIL和BAFF对BCMB72在H929细胞中的T细胞活化和T细胞介导的细胞毒性潜力的效应。使细胞经受使用供体T细胞(M7077和M6521)和BCMB72的杀伤测定48小时。目标细胞毒性描绘于左侧的图中，并且T细胞活化显示于右侧的图中(n＝2)。在图例中示出了每种治疗的EC50值。示出了在sBCMA(图18A)、APRIL(图18B)和BAFF(图18C)存在下的细胞毒性。示出了在sBCMA(图18D)、APRIL(图18E)和BAFF(图18F)存在下的T细胞活化。数据：平均值±SEM。

[0297] 图19A和图19B：在不存在竞争抗体的情况下，将来自两个独立实验的信号归一化为BCMA‑Fc结合APRIL和BAFF的最大信号。将BCMA与APRIL(图19A)和BAFF(图19B)的结合作为BCMB72和对照抗体(空白×CD3)浓度的函数来作图。

[0298] 图20A至图20E：BCMB72对人原代MM浆细胞的细胞毒性效力。使用来自五个不同患者的冷冻骨髓来源的单核细胞(MM240BM(图20A)、MM259BM(图20B)、MM270BM(图20C)、MM276BM(图20D)和MM277BM(图20E))与IgG4同种型(CNTO9412，左图)对照、浆细胞细胞毒性(中图)和T细胞活化(右图)相比来评估BCMB72结合。对于细胞毒性测定，将来自M7077正常健康供体的T细胞外源添加至患者BMMC样品并与BCMB72(BCMA×CD3)、BC3B4(BCMA×空白)或CNTO 7008(空白×CD3)一起温育48小时。BCMB72以剂量依赖性方式结合至所有供体样品的浆细胞，并且在Y轴上记录平均荧光强度。注意到响应于BCMB72处理，活的浆细胞(CD138+)损失并且T细胞上的CD25同时上调。图上示出了T细胞活化的EC50值。

[0299] 图21：BCMB72在H929预防模型中的体内功效。

[0300] 图22：H929异种移植小鼠中的血清可溶性BCMA水平。使用人BCMA ELISA试剂盒(R&D Systems)检测血清可溶性BCMA浓度。与PBS对照相比，用1μg/小鼠和0.5μg/小鼠的BCMB72处理的小鼠中可溶性BCMA水平显著较低，所述PBS对照与这些动物中的肿瘤负荷很好地相关。较低剂量的BCMB72(0.1μg/小鼠)对sBCMA水平或肿瘤大小没有效应。

[0301] 实施例

[0302] 提供了以下实施例以补充现有公开并提供对本文所述主题的更好理解。不应将这些实施例视为限制所描述的主题。而应当理解，本文所述的实施例和实施方案只是为了进行示意性的说明，根据其的各种变型或改变对于本领域技术人员将是显而易见的并且包括在本发明真实范围内，并可在不脱离本发明真实范围的情况下进行各种变型或改变。

[0303] 实施例1：材料

[0304] BCMA ECD分子

[0305] 对应于hBCMA的第1至54位氨基酸(SEQ ID NO:1)的重组人(h)BCMA‑Fc融合蛋白(目录号193‑BC‑050)和对应于mBCMA的第1至49位氨基酸(SEQ ID NO:2)的重组小鼠(m)BCMA‑Fc融合蛋白(目录号593‑BC‑050)获自R&D Systems。由基因合成技术获得的cDNA制备重组食蟹猴BCMA蛋白(美国专利6,670,127；美国专利6,521,427)。在使用之前测试所有蛋白质的内毒素，并生物素酰化该蛋白质以进行噬菌体淘选研究。这些材料也用于结合和亲和力测量。

[0306] 可溶性人BCMA获自AB Biosciences(目录号P011Xp，批号033‑013)并用于表征研究。

[0307] APRIL、BAFF、BAFF‑R和TACI分子

[0308] 可溶性hAPRIL(目录号DY884)、hBAFF(目录号2149‑BF)、对应于hBAFF‑R的第7至71位氨基酸的hBAFF‑R(目录号1162‑BR)以及对应于TACI的第2至166位氨基酸的hTAC1获自R&D Systems。生物素酰化BAFF‑R和TAC1以用于SPR研究。

[0309] BCMA细胞系的生成

[0310] 使用标准方法将呈递人BCMA(图1A)和食蟹猴BCMA(图1B)的载体瞬时转染到HEK293expi细胞中。选择转染的293F贴壁细胞进行稳定的质粒整合，然后使用抗‑人BCMA‑PE标记的抗体(R&D Systems FAB193P)通过FACS定量分选的单细胞和BCMA表面受体表达。

[0311] 实施例2：人BCMA单克隆抗体表达型杂交瘤的分离

[0312] 人免疫球蛋白转基因大鼠品系( OMT有限公司)用于培养人BCMA单克隆抗体表达型杂交瘤细胞。 含有嵌合人/大鼠IgH基因座(包含22个人VH，全部的人
D和JH片段以天然构型连接至大鼠CH基因座)连同完整人IgL基因座(连接至Jκ‑Cκ的12个Vκ和连接至Jλ‑Cλ的16个Vλ)。(参见例如，Osborn等人，2013年，J Immunol，第190卷，第4期，第
1481‑1490页)。因此，大鼠表现出大鼠IgM或κ的表达降低，并且响应于免疫，引入的人重链和轻链转基因经历类别转换和体细胞突变以产生高亲和力的人IgG单克隆抗体。授予Bruggemann等人的PCT公布WO 14/093908中描述了 的制备和用途以及由这些大
鼠携带的基因组修饰。

[0313] 当用重组人BCMA(rhBCMA)免疫时，这种转基因大鼠产生特异于人BCMA的人IgG抗体。

[0314] 免疫方案如下进行：用hBCMA‑Fc融合体免疫六只大鼠。21天免疫方案后，收获来自免疫大鼠的脾和淋巴结并用于产生四个总杂交瘤文库。将文库滴定并通过ELISA测定以鉴定表现出与生物素酰化hBCMA结合的mAb。在MSD链霉抗生物素蛋白板上捕获mAb。在进一步的确认筛选后，对表现出特异于人BCMA和食蟹猴BCMA的结合的杂交瘤上清液进行测序、克隆和表达并转化为人IgG1和IgG4两者。

[0315] 实施例3：BCMA抗体的纯化

[0316] 通过MabSelect SuRe蛋白A树脂捕获澄清的培养上清液中的BCMA抗体，并用100mM乙酸钠(pH 3.5)洗脱。合并含有抗体的级分，并用2.5M Tris HCl(pH 7.2)迅速中和，然后如有指定，则缓冲液交换到1xD‑PBS或其它所需的缓冲液中。通过在NanoDrop分光光度计上测量OD280并使用其吸光系数计算来确定蛋白质浓度。通过SDS‑PAGE和SE‑HPLC评估抗体的纯度和均质性。如果单体低于每SE‑HPLC 95％，则进行使用Superdex 200的SEC抛光步骤。

[0317] 实施例4：结合至BCMA的BCMA抗体细胞的表征

[0318] 使用MSD(Mesoscale)细胞结合测定和流式细胞术评估BCMA抗体与经改造的BCMA表达型细胞和癌细胞系U2392、EJM、MMIR、U266、OPM2和RPMI‑18226的结合。筛选测定的目的是鉴定与表达BCMA的细胞结合的抗体以及与表达食蟹猴BCMA的细胞的交叉反应性。

[0319] 对于MSD细胞结合测定，将细胞固定并且一式三份测定BCMA抗体样品。简而言之，将纯化的BCMA抗体的表达上清液归一化为10μg/mL。将每孔5000个细胞接种到384孔板(MA6000，产品目录号L21XB，MSD)中并使其附着2小时。然后将细胞用20％FBS的PBS溶液(Gibco)阻断15分钟。接着加入抗体上清液，并在室温下放置1小时。用PBS洗涤细胞3次，然后以1μg/mL加入钌标记的二抗(Jackson Immuno Research)，并在室温下温育1h。然后施加另外的洗涤步骤，接着加入35μL/孔的MSD读取缓冲液T(不含表面活性剂)，并温育30分钟进行检测。随后使用MSD Sector 6000读取板。将数据归一化为对照并使用GraphPad Prism第5版作图。将信号为背景3倍的阳性结合物确定为命中。重复测定过程以确保数据一致性，并选择优异结合物进行进一步扩展测定。

[0320] 对于流式细胞术，将细胞与活力染色剂一起温育，并将100,000个细胞加入U形底板并离心以沉淀细胞。将滴定的BCMA抗体加入细胞中。温育期后，将细胞沉淀并洗涤。将AlexaFluor 647标记的物种特异性二抗加入细胞中并使其温育。将细胞沉淀并洗涤数次。将细胞重悬于适量的运行缓冲液中并使用FACS CantoII进行分析。通过对比FSC‑A与SSC‑A对细胞的大小进行门控，通过对比SSC‑A与SSC‑H对细胞的单峰和活力染色进行门控。如果可能的话，即如果曲线完全是S形，则将活细胞群的geoMFI值作图并用于计算EC50值。

[0321] 抑制APRIL配体结合

[0322] 在APRIL结合竞争ELISA中筛选BCMA抗体组。可溶性人April购自R&D systems(目录号DY884)，评价抗‑BCMA抗体阻断April与固定化BCMA结合的能力。

[0323] 简而言之，用100μL的0.5μg/mL在PBS中制备的BCMA‑ECD处理96孔透明maxisorb板，并在室温下温育过夜。然后将板用含有0.05％Tween‑20 n PBS的ELISA洗涤缓冲液(R&D Systems，目录号WA126)洗涤三次，接着用300μL/孔在PBS中含有1％BSA5的试剂稀释剂(R&D Systems，目录号DY995)阻断。为了竞争性结合，将BCMA抗体以100μL体积加入板中并在加入APRIL之前温育30分钟。30分钟后，每孔加入1ng的APRIL，并将板在4℃下温育过夜。用ELISA洗涤缓冲液洗涤未结合的APRIL，并使用SA‑HRP缀合物以450nm的光密度检测结合的生物素酰化的APRIL。

[0324] 实施例5：命中评价和选择

[0325] 表征实验完成后，确定来源于命名为BCMB69‑的M2杂交瘤的抗体具有以下特征：

[0326] ·结合至重组人BCMA

[0327] ·结合至重组食蟹猴BCMA

[0328] ·表现出对小鼠BCMA的弱结合

[0329] ·通过流式细胞术所测量，与表达HEK的人BCMA和表达HEK的食蟹猴BCMA均结合[0330] ·结合至表达BCMA的人癌细胞系(U2392、EJM、MMIR、U266、OPM2和RPMI‑18226)[0331] ·以IC50＝5.9nM阻断APRIL结合

[0332] 结果，为了制备BCMA×CD3双特异性抗体的目的，表达并纯化BCMB69(表4和表5)。

[0333] 表4：BCMB69的CDR序列(相关SEQ ID NO在括号中提供)

[0334]

[0335] 表5：BCMB69的VH和VL序列

[0336]

[0337] 实施例6：抗‑BCMA Fab的晶体结构

[0338] 一种抗‑BCMA抗体(BCMB69)的晶体结构以游离Fab形式以及当与人BCMA结合时确定，以表征原子细节中的抗体/抗原相互作用，增加我们对抗体作用机制的理解，并且支持任何所需的抗体工程改造。

[0339] 材料

[0340] 将带His标签的BCMA Fab(SEQ ID NO:75和SEQ ID NO:76；下文简称为BCMB69 Fab)在HEK293细胞中表达，并使用亲和色谱法和尺寸排阻色谱法纯化。将Fab接收在130mM NaCl，20mM MES(pH 7.4)中。

[0341] 将具有C端His标签的人BCMA胞外区(SEQ ID NO:1的第5‑51位残基；下文简称为BCMA)用杆状病毒系统表达并通过亲和色谱法和尺寸排阻色谱法纯化。将蛋白质接收在50mM NaCl，20mM Tris(pH 8)中。

[0342] 结晶

[0343] BCMA/BCMB69 Fab复合物

[0344] 通过将BCMA与BCMB69 Fab以3.8:1的摩尔比(过量BCMA)在4℃下混合约16小时同时将缓冲液交换至20mM Hepes(pH 7.5)中来制备Fab/抗原复合物。然后以溶于20mM Hepes(pH 7.5)中的51‑63mM NaCl的梯度从monoS 5/50柱上洗脱复合物，并将其浓缩至17mg/mL。在20℃下，使用坐滴蒸气扩散法以微接种从25％PEG 3kDa，0.2M MgCl2，0.1M Mes pH 6.5获得适于X‑射线衍射的晶体。

[0345] BCMB69 Fab

[0346] 不经进一步纯化将BCMB69 Fab浓缩至9mg/mL。在20℃下，使用坐滴蒸气扩散法从2M(NH4)2SO4，5％MPD，0.1M Mes pH 6.5获得适于X‑射线衍射的晶体。

[0347] X射线数据收集和结构测定

[0348] 为了进行X射线数据收集，将晶体在含有冷冻保护剂溶液的对应母液(补充有20％甘油)中浸泡数秒，然后在液氮中快速冷冻。在加拿大光源(CLS)的光束线CMCF‑08ID处用Rayonix 300HS CCD检测器收集BCMA/BCMB69复合物的X射线衍射数据，同时在位于阿贡国家实验室的先进光子源(APS)的光束线17‑ID处用Dectris Pilatus 6M像素阵列检测器收集游离BCMB69 Fab的X射线数据。用程序HKL(Otwinowski,Z.和Minor,W.，1997年，“Processing of X‑ray diffraction data collected in oscillation mode.”，Methods in Enzymology，第276卷，第307‑326页)处理衍射数据。

[0349] 使用Phaser通过分子替换(MR)解析结构(Read,R.J.，2001年，“Pushing the boundaries of molecular replacement with maximum likelihood.”，Acta Crystallogr D Biol Crystallogr，第57卷，第1373‑1382页)。就游离Fab结构而言，MR的搜索模型是抗流感血凝素5j8Fab(PDB代码：4M5Y)。就BCMA/Fab复合物而言，MR的搜索模型是BCMA(PDB代码：1XU2)和BCMB69游离Fab结构的晶体结构。使用PHENIX(Adams,P.D.,Gopal,K.,Grosse‑Kunstleve,R.W.,Hung,L.W.,Ioerger,T.R.,McCoy,A.J.,Moriarty,N.W.,Pai,R.K.,Read,R.J.,Romo,T.D.,Sacchettini,J.C.,Sauter,N.K.,Storoni,L.C.&
Terwilliger,T.C.，2004年，“Recent developments in the PHENIX software for automated crystallographic structure determination.”，J Synchrotron Radiat，第
11卷，第53‑55页)对结构进行精修，并使用COOT(Emsley P.&Cowtan,K.，2004年，“Coot:
Model building tools for molecular graphics.”，Acta Crystallogr.，第D60卷，第
2126‑2132页)进行模型调整。所有其它晶体学计算均使用CCP4套件程序执行
(Collaborative Computational Project Number 4,1994)。所有分子图形利用PyMol(DeLano,W.，2002年，“The PyMOL molecular graphics system.”，Palo Alto,CA,USA；
Delano Scientific)生成。

[0350] 表6中示出了BCMB69游离Fab结构和复合物的数据统计。

[0351] 表6：BCMA/BCMB69 Fab复合物和游离BCMB69 Fab的晶体学数据。

[0352]

[0353]

[0354] 表位、互补位及相互作用

[0355] BCMB69识别由BCMA的β‑发夹(残基Y13‑H19)和螺旋‑环‑螺旋(残基L26、R27和N31‑L35)区中的残基构成的构象表位(图3和图4)。所述BCMB69表位包含在BCMA上的约 的面积并含有配体结合DXL基序(在β‑发夹的I型转角中的残基D15‑L18)，其突出到内衬有抗体互补决定区(CDR)的一个浅腔中。在DXL转角末端的亮氨酸17完全被埋在抗体腔中并且与BCMB69具有广泛的相互作用。另一个普遍的表位残基是Arg27，其位于310‑螺旋h1上并与重链CDR形成若干氢键接触。

[0356] BCMB69互补位由除CDR‑L1外的所有CDR中的残基构成(图2和图3)。与轻链相比，重链与BCMA的接触次数是其两倍。CDR‑H3环末端中的小侧链(102‑GAVAG‑106)(SEQ ID NO:77)促进CDR‑H3插入BCMA中并建立广泛的抗体/抗原接触(由CDR‑H3进行全部接触的40％)。
BCMB69 CDR通过由CDR‑L2(残基Y48、D52、P54、S55)、CDR‑H1(残基G32‑Y34)和CDR‑H3(D101,A103,V104,Y110)接触由h1螺旋和h1h2环形成的“座位”而装到BCMA椅状结构的凹表面上，而CDR‑L3(残基W90、S92、D95)、CDR‑H1(F35)、CDR‑H2(Y54,Y60)和CDR‑H3(H100,G102,A103,A105)与由BCMAβ‑发夹形成的“背部”相互作用。Leu35是“椅子腿”(h2螺旋)中唯一的表位残基，与CDR‑L2残基D52具有范德华接触。

[0357] BCMA具有小的(约50个残基)和紧凑的细胞外结构域。可用于将非竞争性抗体或配体与BCMA结合的表面有限。大多数BCMB69表位残基也是APRIL的结合残基(14个表位残基中的12个)和BAFF的结合残基(14个残基中的9个)。就APRIL(其为BCMA的最高亲和力配体)而言，不共享的仅有表位残基是F14和S16(图2B)，而对于BAFF而言，不共享的残基是F14、L26、T32、P33和L35。DXL环被两个配体和BCMB69包埋。

[0358] 提出的BCMB69的作用机理

[0359] BCMB69是将T细胞重定向至MM癌细胞的候选物。预期由BCMB69×抗‑CD3双特异性抗体介导的杀伤癌细胞不会受BCMB69表位的结构和位置的损害。表位的可接近位置允许BCMB69 Fab臂与膜结合的BCMA结合，而另一Fab臂仍与T细胞膜中的CD3结合。

[0360] BCMB69还可通过空间阻塞和直接竞争BCMA结合位点来破坏浆细胞中的APRIL和BAFF信号传导通路。在BCMA/APRIL和BCMA/BAFF结构上覆盖BCMA/BCMB69结构(Liu,Y.,Hong,X.,Kappler,J.,Jiang,L.,Zhang,R.,Xu,L.,Pan,C.H.,Martin,W.E.,Murphy,R.C.,Shu,H.B.,Dai,S.&Zhang,G.，2003年，Nature，第423卷，第49‑56页；Hymowitz,S.G.,Patel,D.R.,Wallweber,H.J.A.,Runyon,S.,Yan,M.,Yin,J.,Shriver,S.K.,Gordon,N.C.,Pan,B.,Skelton,N.J.,Kelley,R.F.&Starovasnik,M.A.，2005年，J.Biol.Chem.第280卷，第7218‑7227页)显示了BCMB69和APRIL、BAFF(图2B以及图4A和图4B)之间的碰撞区，使得BCMA不可能同时结合抗体和天然配体。APRIL和BAFF可使用其它受体诸如TACI和BAFF‑R发送信号，并且BCMA敲除小鼠仍然是活的。因此，通过BCMA阻塞阻断APRIL和BAFF活性可能对MM患者不会有严重毒性。

[0361] 实施例7：BCMB69突变体的基于结构的设计

[0362] 对未结合BCMB69可变结构域的翻译后修饰基序和聚集风险的计算评估显示，对于D101‑G102残基(CDR‑H3)和可能造成聚集风险的CDR区中 疏水片的中度异构化风险。疏水片中暴露最多的疏水残基是I58(CDR‑H2)、F35(CDR‑H1)和V104(CDR‑H3；V104在Fv同源模型中相关，但在Fab晶体结构中不相关)。为了消除BCMB69可变结构域中的异构化和聚集风险，合理地设计了各种突变(表7)。

[0363] 表7：BCMB69突变体组

[0364]

[0365] 分别在表8和表9中描述了基于结构的BCMB69突变体的CDR序列以及VH和VL序列。

[0366] 表8：BCMB69突变体的CDR序列(相关SEQ ID NO在括号中提供)

[0367]

[0368]

[0369] 表9：BCMB69突变体的Vh和V1序列

[0370]

[0371]

[0372]

[0373]

[0374]

[0375] 因此，除了BCMB69之外，28个突变体如实施例3中所述进行表达和纯化，并且如实施例4中所述通过流式细胞术表征其与BCMA表达型细胞的结合。28个突变体中的七个与表达BCMA的细胞结合并向前移动以制备BCMA×CD3双特异性组。

[0376] 实施例8：在IgG4 S228P、L234A、L235A中以双特异性形式制备BCMA和CD3抗体[0377] BCMA抗体表达为IgG4，具有Fc置换S228P、L234A和L235A(根据EU索引编号)。还生成了单特异性抗‑CD3抗体CD3B19，其包含分别具有SEQ ID NO:55的序列和SEQ ID NO:56的序列的重链和轻链。

[0378] 通过使用蛋白A柱(HiTrap MabSelect SuRe柱)的标准方法纯化单特异性抗体。洗脱后，将收集物透析至D‑PBS(pH 7.2)。

[0379] 通过在体外Fab臂交换中组合单特异性CD3 mAb和单特异性BCMA mAb来生成双特异性BCMA×CD3抗体(如WO2011/131746中所述)。简而言之，将约1‑20mg/mL的抗‑BCMA/抗‑CD3抗体(或在一些情况下，6％额外的一种亲本抗体以除去另一种抗体)的PBS溶液(pH 7‑7.4)和75mM 2‑巯基乙醇胺(2‑MEA)以摩尔比1:1混合在一起并在31℃下温育5小时，然后采用标准方法通过透析、渗滤、切向流过滤和/或旋转细胞过滤除去2‑MEA。通过阳离子交换(CEX)HPLC或疏水相互作用色谱(HIC)HPLC分析双特异性BCMA×CD3抗体的形成。如果需要，双特异性BCMA×CD3抗体通过制备型CEX或HIC抛光以除去残留的亲本。

[0380] 代表性BCMA×CD3双特异性抗体的重链和轻链示于下表10中。当与CD3臂组合时，BCMB178表达不佳，因此没有进行进一步表征。

[0381] 表10：双特异性抗体的重链和轻链序列

[0382]

[0383]

[0384]

[0385]

[0386]

[0387]

[0388]

[0389] 实施例9：BCMA抗体和BCMA×CD3双特异性抗体的BCMA亲和力测定

[0390] 表面等离振子共振(SPR)用于测量用于生成CD3双特异性抗体的BCMA抗体的人BCMA亲和力值。SPR遵循的方案类似于实施例4中所述的方案。表11中所示的结果表明，所有样品都以不同的亲和力与单体BCMA抗原结合。亲本mAb(BCMB69)具有约1.4nM的结合亲和力。BCMB117和BCMB128具有在BCMB69的范围内的亲和力，而BCMB123、BCMB129、BCMB176和BCMB177由于更快的解离速率而具有相对较弱的亲和力(1/3至1/15)。为了评估数据再现性，将所有样品至少一式三份地进行实验，并报告标准偏差。

[0391] 表11：通过SPR测定抗‑BCMA mAb与单体人BCMA的结合亲和力

[0392]

[0393] SPR也用于测量BCMA×CD3双特异性抗体对人和食蟹猴BCMA的亲和力值。表12中的结果表明所有样品以不同的亲和力与Fc‑BCMA抗原结合。BC3B7和BC3B9具有在人BCMA的BCMB72范围内的亲和力，而其余的双特异性抗体与BCMB72相比具有1/2‑1/3的较弱亲和力。对于食蟹猴Fc‑BCMA，BC3B7和BC3B9具有为BCMB72的2‑3倍的更紧密亲和力(分别为KD 
0.65‑0.37nM)，而其余的mAb保留与BCMB72类似的结合(KD～0.8‑1.2nM)。为了评估数据再现性，将所有样品至少一式三份地进行实验，并报告标准偏差。

[0394] 表12：通过SPR测定BCMA×CD3抗体对Fc‑BCMA的结合亲和力

[0395]

[0396]

[0397] 使用Biacore T200系统(GE Healthcare,NJ)通过表面等离振子共振(SPR)测量抗‑BCMA×CD3双特异性抗体(BCMB72)与Fc‑融合BCMA蛋白(人、食蟹猴和小鼠)的结合亲和力。

[0398] 将链霉抗生物素蛋白衍生化的传感器芯片(GE Healthcare；产品编号BR‑1005‑31)的流动池2、3和4分别用生物素酰化的Fc‑融合人、食蟹猴或小鼠BCMA固定(BCMA固定化水平在12‑16个响应单位(RU)之间；Fc‑BCMA蛋白质：人(R&D Systems；产品编号193‑FC)、食蟹猴(内部；目录号BCMW6.001)和小鼠(R&D Systems；产品编号593‑BC)被内部生物素酰化)。流动池1上没有固定蛋白质并被用作参考表面。25℃下，在运行缓冲液(PBS pH 7.4，
0.005％P20，3mM EDTA)中进行结合动力学实验。BCMB72在运行缓冲液中以5倍稀释液从
100nM至0.16nM制备。这些溶液以50μL/分钟注射5分钟(缔合期)，然后通过使运行缓冲液流动来监测解离15分钟。芯片表面通过以100μL/分钟短时注射甘氨酸(pH 1.5)和运行缓冲液再生。BCMB72与Fc‑BCMA的相互作用的结合动力学分析通过从分析物注射的参考扣除曲线减去通过缓冲液注射生成的曲线所得数据的双重参考来进行。通过Biacore T200评价软件(GE Healthcare,NJ)使用双态结合模型进行传感图的宏观动力学拟合。来自双态结合模型的针对不同BCMA物种的结合亲和力结果被报告为第一复合物(KD1)和最终复合物(KD)(图
5)。

[0399] 实施例10：在存在多发性骨髓瘤背景的无限增殖化细胞系的情况下BCMA×CD3抗体的靶特异性T细胞活化和细胞毒性效力

[0400] 评价由BCMA×CD3抗体介导的T细胞活化。简而言之，在PBS中将BCMB72(BCMA×CD3)和对照抗体(BCMA×空白和空白×CD3)稀释至800μg/ml。滴定液在96孔U形底板中用PBS中的4倍系列稀释度制备。最后一列留作单独的PBS(媒介物对照)。

[0401] 将靶细胞在补充有GlutaMAX、10％FBS和25mM HEPES(培养基)的无抗生素RPMI 1640培养基中培养。在开始当天(第1天)，对靶细胞计数并将1000万个细胞以1350rpm离心3分钟，之后弃去上清液。将CellTrace FCSE增殖染色剂在18μl无菌DMSO中复原，然后将1μl溶液稀释在10ml无菌PBS中。将细胞沉淀物重悬于1ml的CFSE稀释液中，并在室温下避光温育8分钟。温育后，将1ml的HI FBS加入细胞悬浮液中以淬灭多余的CFSE。将细胞在含有10％FBS的RPMI‑1640中洗涤两次。在10ml的RPMI中复原后，对细胞进行计数并将细胞活力记录在电子表格中。将细胞稀释至2.2×10^5/ml并在37℃下温育直至使用。

[0402] 将来自正常供体的Pan T细胞在37℃水浴中解冻，之后将冷冻小瓶的内容物转移至50ml锥形小瓶中并在15ml冷培养基中复原。然后以1350rpm在4℃下将细胞离心3分钟。弃去上清液，并将细胞沉淀物在5ml至10ml的培养基中复原。对T细胞进行计数并记录活力。然后将细胞在培养基中复原至1.1×10^6/ml。

[0403] 将2×10^5个靶细胞加入96孔U形底板的孔中，然后加入Fc阻断剂(至最终浓度为2mg/ml)。将所有细胞系在室温下温育10分钟以阻断Fc受体活性。向孔中加入1×10^5个T细胞(5:1的效应子:靶比率)。在混合靶细胞和T细胞后，将20μl的BCMA×CD3抗体稀释液加入每个孔中。将板在37℃下用5％CO2温育48小时。

[0404] 两天后，将板在4℃下以1350rpm离心3分钟，并将100μl上清液转移至单独的板并储存于‑80℃以用于细胞因子释放测定。将细胞在200μl的PBS中洗涤并在室温下在50μl的近红外Live/Dead染色剂(1:200稀释度)和抗‑CD25 PE抗体(1:50稀释度)中温育20分钟。然后，将细胞在200μl的FACS缓冲液中洗涤一次，并且最后在150μl的FACS缓冲液中复原。使用FACSCanto II和FlowJo 7.6分析细胞的靶细胞毒性(靶％)和T细胞活化CD25+(活T细胞％)。使用具有可变斜率(四个参数)函数的非线性回归并使用最小二乘法在GraphPad Prism 6中完成数据的作图和拟合。

[0405] 图8示出了BCMB72促进一致的靶特异性T细胞活化，通过在T细胞表面上的CD25上调所评估。Fc阻断剂用于阻止抗体与靶细胞的Fc受体依赖性结合。一般来讲，数据点沿所生+成的拟合曲线紧密对准，并且T细胞供体之间几乎没有变异性。对于BCMA 细胞实现了45％‑‑
85％的最大活化，而对于BCMA 细胞实现了4％‑10％的最大活化(相当于背景水平)。图9中示出了使用来自多个正常供体的T细胞进行的两个独立实验得出的EC50和最大T细胞活化值的汇总。

[0406] 图10示出了BCMB72对BCMA+细胞系具有始终很强的细胞毒性。Fc阻断剂用于阻止BCMB72与靶细胞的Fc受体依赖性结合。一般来讲，数据点沿所生成的拟合曲线紧密对准，并+且T细胞供体之间几乎没有变异性。对于BCMA 细胞实现了62％‑97％的最大裂解，而对于‑
BCMA细胞实现了4％‑18％的最大裂解。图11中示出了使用来自多个正常供体的T细胞进行的两个独立实验得出的EC50和最大裂解值的汇总。

[0407] 其它六种BCMA×CD3抗体对于BCMA+H929细胞显示出83％至93％的最大细胞毒性(图12A)，以及使用两种不同的供体T细胞时74％至83％范围内的T细胞活化(图12B)。这六种BCMA×CD3抗体分子以0.04nM至0.09nM范围内的EC50值有效地杀伤BCMA+靶细胞。

[0408] 实施例11：BCMB72在BCMA+细胞系上的结合效率

[0409] 评估BCMB72与恶性背景的各种BCMA+细胞系结合的EC50值。简而言之，双特异性抗体BCMB72(BCMA×CD3)在PBS中稀释至750μg/ml。在96孔U形底板中用PBS中的3倍系列稀释度制备滴定液。最后一列留作单独的PBS(媒介物对照)。

[0410] 将H929靶细胞在补充有GlutaMAX、10％FBS和25mM HEPES(培养基)的无抗生素RPMI 1640培养基中培养。对于该测定，测量靶细胞密度和活力，然后将细胞在4℃下以1000rpm离心5分钟。接着将细胞沉淀物在10ml的PBS中洗涤并再次以1000rpm离心5分钟。将
5
细胞以5.5×10个细胞/ml重悬于PBS中，并将90μl的细胞悬浮液等分至96孔U形底板的每孔中，随后加入10μl/孔的BCMB72稀释液。将板在黑暗中在4℃温育1小时，然后以1000rpm离心5分钟并弃去上清液。将细胞沉淀物在200μl的FACS缓冲液中洗涤两次。PE标记的针对人IgG4Fc的二抗以1:25溶于FACS缓冲液中，并将50μl的混合物加入对应的孔中。将样品在4℃下温育20分钟，如上所述在FACS缓冲液中洗涤，并在150μl的FACS缓冲液中复原以用于在FACSCanto II上分析。使用FlowJo 7.6分析BCMB72结合的数据，然后使用具有可变斜率函数的非线性回归并使用最小二乘法在GraphPad Prism 6中完成数据的作图和拟合。

[0411] 从图6看出，BCMB72能够结合至所有被检查的BCMA+细胞系。结合至H929细胞的EC50为14.7nM，结合至MM.1R细胞的EC50为9.74nM，结合至EJM细胞的EC50为17.5nM，结合至LP1细胞的EC50为22.3nM，以及结合至U‑2932细胞的EC50为7.92nM。

[0412] 实施例12：来自正常人供体的离体全血中BCMA表达和BCMB72结合的分析

[0413] 评估来自三个正常人供体的离体全血中BCMA和BCMB72在白细胞上的结合表达。简而言之，在实验之前，将来自正常人供体的新鲜外周血储存在肝素涂布的管中。将血液以100μl等分试样移液到96孔U形底板中。如实验电子表格中所示，在主混合物中制备染色抗体。将主混合物与针对BCMA或BCMB72的抗体一起直接加入血液中。在室温下温育30分钟后，将含血的板在4℃下以1350rpm离心3分钟。弃去上清液血浆并对沉淀物进行四轮连续的RBC裂解，每次洗涤之间进行5分钟的温育。裂解完成后，将沉淀物用PBS洗涤一次，然后在含有
1:200Live/Dead近红外染色剂和1:50抗‑IgG4 PE(仅用于含有BCMB72的孔)的PBS中染色。
将板在室温下另外温育15分钟。随后用200μl的FACS缓冲液洗涤样品，最后在150μl的FACS缓冲液中复原以用于在LSRFortessa上分析。每孔收集大约100,000个事件。分析在FlowJo 
7.6中完成。

[0414] 如图7所示，在三个正常供体的淋巴细胞、单核细胞、粒细胞或类浆细胞DC中没有观察到BMCA表达。BCMB72显示与所有三个供体中的CD3+ T细胞的结合，其中供体之间强度不同。BCMB72不与本测定中测试的任何其它细胞类型结合。

[0415] 实施例13：BCMB72对细胞因子谱的效应

[0416] 使用BCMB72和对照抗体评估来自T细胞介导的杀伤测定的上清液中的细胞因子谱。如在T细胞介导的细胞毒性测定中一样，接种T细胞和抗体(参见实施例10)。温育48小时后，收获细胞上清液，并使用基于MSD的ELISA测量不同的(10/30Plex)细胞因子。细胞因子水平表示为pg/mL，并且使用具有可变斜率(四个参数)函数的非线性回归在GraphPad Prism 6中完成数据的作图和拟合。图13示出了使用六种T细胞供体的来自RPMI8226细胞系的六种细胞因子的EC50值。数据显示由T细胞活化引起的显著的细胞因子释放。采用对照抗体观察到低/无细胞因子释放(数据未示出)。

[0417] 实施例14：在T细胞活化和T细胞介导的靶细胞杀伤中HEK‑产生的和CHO‑产生的(瞬时和稳定细胞系)BCMB72的功能比较

[0418] 在不同细胞和不同表达模式下产生的双特异性抗体可能在活性上有所不同。因此，评价了在HEK细胞(瞬时表达)或CHO细胞(瞬时或稳定表达)中产生的BCMB72的体外功效。

[0419] 在PBS中将BCMB72稀释至800μg/ml。如在每个实验中所指出的，在96孔U形底板中以PBS中的3倍或4倍系列稀释度制备滴定液。最后一列留作单独的PBS(媒介物对照)。

[0420] 将H929靶细胞在补充有GlutaMAX、10％FBS和25mM HEPES(培养基)的无抗生素RPMI 1640培养基中培养。在开始当天(第1天)，对细胞进行计数并将1000万个细胞以1350rpm离心3分钟，之后弃去上清液。将CellTrace FCSE增殖染色剂在18μl的无菌DMSO中复原，然后将1μl的溶液稀释在10ml的无菌PBS中。将H929细胞沉淀物重悬于1ml的CFSE稀释液中，并在室温下避光温育8分钟。温育后，将1ml的HI FBS加入细胞悬浮液中以淬灭多余的CFSE。将细胞在含有10％FBS的1640 RPMI中洗涤两次。在10ml的RPMI中复原后，对细胞进行计数并将细胞活力记录在电子表格中。将细胞稀释至指定浓度，并在37℃下温育直至使用。

[0421] 将来自正常供体的T细胞在37℃水浴中解冻，之后将小瓶的内容物转移至50ml锥形小瓶中并在15ml的冷培养基中复原。以1350rpm在4℃下将细胞离心3分钟。弃去上清液，并将细胞沉淀物在5ml至10ml的培养基中复原。对T细胞进行计数并在培养基中复原至适当浓度(参见每个实验的电子表格)。

[0422] 向孔中加入H929细胞，然后加入T细胞(5:1的效应子:靶比率)。在这组研究中没有使用Fc阻断剂。在混合靶细胞和T细胞后，将20μl的BCMB72稀释液加入每个孔中。将板在37℃下用5％CO2温育48小时。2天后，将含有细胞的板离心，并且将上清液弃去或储存用于细胞因子释放测定。将细胞在200μl的PBS中洗涤并在室温下在50μl的近红外Live/Dead染色剂(1:200稀释度)和抗‑CD25 PE抗体(1:50稀释度)中温育20分钟。然后，将细胞在200μl的FACS缓冲液中洗涤一次，并且最后在150μl的FACS缓冲液中复原。在使用FACSCanto II的同一天通过流式细胞术运行细胞，并在FlowJo 7.6中分析靶细胞毒性(靶％)和T细胞活化CD25+(活T细胞％)。使用具有可变斜率(四个参数)函数的非线性回归和最小二乘法在GraphPad Prism 6中完成数据的作图和拟合。

[0423] 从图14看出，根据对靶细胞的细胞毒性和对T细胞的刺激，在HEK细胞中产生的BCMB72和在CHO细胞中产生的BCMB72在T细胞重定向测定中表现几乎相同。一般达到85％的最大杀伤率和80％的T细胞活化。细胞毒性的平均EC50值对于在HEK细胞中产生的BCMB72为0.29nM，并且对于在CHO细胞中产生的BCMB72为0.42‑0.47nM。T细胞活化的平均EC50值对于在HEK细胞中产生的BCMB72为0.28nM，对于在CHO细胞中产生的BCMB72的EC50值为0.37‑
0.41nM。使用学生t检验的比较分析显示EC50值之间没有统计意义上的显著性。

[0424] 实施例15：通过BCMB72激活P38信号传导

[0425] BAFF和APRIL均与两种受体BCMA(B细胞成熟抗原，TNFRSF17)和TACI(跨膜活化剂和CAML相互作用物，TNFRSF13b)结合。BCMA的接合激活JNK和P38 MAPK信号传导通路。BCMA×CD3双特异性抗体BCMB72可能对BCMA发挥激动效应。这项研究包括两部分。1.开发Simple Western分析测定以监测APRIL或BAFF处理后H929或MM1.R细胞中的P38a MAPK变化。2.使用新开发的测定来检查BCMB72是否对BCMA具有任何激动效应。

[0426] 细胞处理

[0427] 在处理前，将H929或MM1.R细胞在37℃、在5％CO2存在下以1.5e6/ml接种在无血清RPMI培养基中24小时。在处理当天，将细胞离心并以1.5e6/ml重悬于无血清RPMI中。对于时间进程测定，将细胞等分到10支管，每管5ml。在37℃，在5％CO2存在下，用1000ng/ml的APRIL(R&D Systems，目录号5860‑AP‑010)或1000ng/ml的BAFF(R&DSystems，目录号2149‑BF‑010)将每管的细胞分别处理0分钟、5分钟、15分钟、30分钟和60分钟。温育后，立即将细胞沉淀并在‑80℃下冷冻以制备细胞裂解物。对于BCMB72激动剂效应测定，在表13中列出H929细胞处理组。进行两次BCMB72激动剂效应测定。

[0428] 表13：BCMB72激动剂效应测定的处理组

[0429]样品 处理(15分钟)
1 APRIL 0ng/ml
2 APRIL 1000ng/ml
3 BAFF 0ng/ml
4 BAFF 1000ng/ml
5 BCMB72 0ng/ml
6 BCMB72 10ng/ml
7 BCMB72 100ng/ml
8 BCMB72 1000ng/ml
9 BCMB72 10000ng/ml

[0430] 用于Simple Western分析的细胞裂解物制备

[0431] 将细胞用含有磷酸酶和蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液裂解。使用BioRad DC蛋白测定(BioRad#500‑0112)和牛血清白蛋白标准品，在SpectraMax Plus 384微板读数器(Molecular Devices,Sunnyvale,CA,USA)上测量蛋白浓度。

[0432] Simple Western分析

[0433] 根据ProteinSimple用户手册，使用Wes‑Rabbit(12‑230KDa)主试剂盒(ProteinSimple#PS‑MK01)进行Simple Western分析。简而言之，将细胞裂解物样品与主混合物混合至1x样品缓冲液、1x荧光分子量标记和40mM二硫苏糖醇(DTT)的最终浓度，然后在
95℃加热5分钟。还将样品、阻断试剂、一抗荧光体‑p38 MAPK(ThermoFisher:VWR#MA5‑
15182)或肌动蛋白‑β(Cell Signaling,#8457S)、HRP缀合的二抗、化学发光底物以及分离和堆积基质(separation and stacking matrices)分配到Simple Wes微孔板的指定孔中，在装载板之后，分离电泳和免疫检测步骤发生在毛细管系统中并且完全自动化。在电泳过程中，蛋白质通过堆积和分离基质以分子量为基础分离，并使用专门的光敏捕获化学法(photoactivated  capture  chemistry)固定在毛细管壁上。用抗体稀释剂II
(ProteinSimple#042‑203)以1:50稀释一抗。靶蛋白用一抗免疫探测60分钟，接着用HRP缀合的二抗免疫探测。Simon‑simple Western分析在室温下进行，并使用仪器默认设置。用Compass软件(ProteinSimple)分析数字图像，并且将检测到的蛋白质的定量数据报告为分子量、信号/峰值强度和峰面积。

[0434] 结果

[0435] 基于从时间进程研究获得的信息，使用15分钟温育终点，用H929细胞进行BCMB72激动剂测定。通过人β肌动蛋白信号归一化p38 MAPK信号。来自两种测定的归一化p38 MAPK信号的平均值示于图15中。BCMB72激动剂测定表明，BCMB72在H929细胞中对BCMA没有激动效应。

[0436] 实施例16：通过BCMB72的NFκB信号传导

[0437] BCMA是一种表面受体，其可以响应于内源性配体而引发NF‑κB信号传导。使用在NFκB启动子下表达碱性磷酸酶(SEAP)的BCMA表达型报告细胞系评价BCMB72与BCMA结合对NF‑κB通路激活的效应。

[0438] 将细胞在补充有GlutaMAX和10％FBS(培养基)的DMEM培养基中培养。在实验之前的晚上，通过胰蛋白酶化(在于37℃下预热的0.25％胰蛋白酶中5分钟)收获细胞，并在30ml的培养基中洗涤。然后将细胞在4℃下以1,000rpm离心5分钟，接着以2.5×10^5个细胞/ml在无血清DMEM(含GlutaMax)中复原。将5×10^4个细胞加入96孔平底板的孔中，然后在37℃下温育16小时。

[0439] 第二天早上，将各种刺激试剂(TNFα、APRIL、BCMB72)加入对应的孔中(参见实验中的孔板布局图)，然后将板在37℃下另外温育16小时、24小时或48小时，这分别表示信号传导的早期、中期和晚期时间点。在每个时间点后，从孔中收集10μl的条件培养基，转移至SEAP试剂盒(Cayman,600272)中提供的96孔实心板中，并用盖子覆盖。SEAP标准品通过在无血清DMEM(含GlutaMax)中以1:10稀释标准原液(5U/ml)，然后制备1:2系列稀释度来制备；稀释范围为50‑0.78mU/ml。将含有样品的板在65℃下温育30分钟，以使内源性碱性磷酸酶失活；在这种测定中表达的SEAP在这些温育条件下是稳定的。将板在室温下温育后，将10μl的标准稀释液加入适当的孔中。向所有孔中加入50μl的底物溶液，并简单搅动样品以将溶液分配在孔中。将样品温育20‑30分钟，并且使用PerkinElmer EnVision 2104多标记读取器(PerkinElmer EnVision 2104 Multilabel Reader)评估化学发光。基于标准曲线将所有发光读数转换为活性单位浓度，然后在Microsoft Excel 2010中分析这些值并将其导入Graph Prism 6中用于图形分析。

[0440] 图16表明，尽管APRIL能够以低至0.46nM的浓度刺激BCMA，但通常，在低于10nM的浓度下，BCMB72在BCMA转导的细胞中不激活NF‑κB通路。在高(44‑133nM)BCMB72浓度下观察到适度的BCMB72依赖性活化。

[0441] 实施例17：在不存在靶细胞的情况下外源性添加BCMA的细胞外结构域对T细胞活化的效应

[0442] BCMA细胞外结构域(ECD)可在溶液中形成三聚体。因此，存在多种双特异性抗体可结合BCMA ECD三聚体并在靶细胞不存在时交联TCR复合物的可能性。这可继而以独立于靶的方式激活T细胞。本研究检查了BCMA的外源性添加的ECD是否在不与靶细胞相互作用的情况下触发CD25表达水平下的T细胞活化。

[0443] 在PBS中将BCMB72(BCMA×CD3)和对照(空白×CD3)稀释至800μg/ml。在96孔U形底板中用PBS中的3倍系列稀释度制备滴定液。最后一列留作单独的PBS(媒介物对照)。

[0444] 在PBS中将可溶性BCMA ECD(sBCMA)稀释至36μg/ml(6.67μM)。在96孔U形底板中用PBS中的3倍系列稀释度制备滴定液。顶部的孔留作单独的PBS(媒介物对照)。

[0445] 将来自正常供体的Pan T细胞在37℃水浴中解冻，之后将冷冻小瓶的内容物转移至50ml锥形小瓶中并在30ml的冷培养基中复原。以1350rpm在4℃下将细胞离心3分钟。弃去上清液，并将细胞沉淀物在10ml的培养基中复原。对T细胞进行计数并记录活力。然后将细胞在培养基中复原至0.525×10^6/ml。

[0446] 向孔中加入1×10^5个T细胞(190μl)，然后加入5μl的sBCMA稀释液和5μl的BCMB72稀释液。将板在37℃下用5％CO2温育48小时。

[0447] 两天后，将板在4℃以1500rpm离心3分钟并弃去上清液。将细胞沉淀物在200μl的PBS中洗涤并在室温下在50μl的近红外Live/Dead染色剂(1:200稀释度)和抗‑CD25 PE抗体(1:50稀释度)中温育20分钟。然后，将细胞在200μl的FACS缓冲液中洗涤一次，最后在150μl的FACS缓冲液中复原。使用FACSCanto II和FlowJo 7.6分析细胞的T细胞活化CD25+(活T细胞％)。使用非线性回归与最小二乘拟合方法在GraphPad Prism 6中完成数据的作图和拟合。

[0448] 来自正常供体的T细胞在BCMB72存在下不表现出sBCMA ECD介导的活化。在高浓度(>40nM)的BCMB72下以sBCMA非依赖性方式观察到一小部分T细胞(10％‑15％)的弱活化(图17)。

[0449] 实施例18：BCMA、APRIL和BAFF的可溶性ECD对T细胞活化和BCMB72依赖性细胞毒性的效应

[0450] 可溶性BCMA ECD可用作BCMA×CD3抗体的汇点(sink)，而APRIL和BAFF可以是表面受体和BCMA×CD3抗体之间相互作用的竞争性抑制剂。在使用无限增殖化细胞系H929和来自正常供体M7077的pan T细胞的T细胞重定向测定中，评估了可溶性BCMA ECD和内源性配体APRIL和BAFF对BCMB72依赖性细胞杀伤的体外细胞毒性效力的效应。

[0451] 在PBS中将BCMB72稀释至800μg/ml。在96孔U形底板中用PBS中的3倍系列稀释度制备滴定液。最后一列留作单独的PBS(媒介物对照)。将可溶性BCMA ECD稀释至9μg/ml，并将APRIL和BAFF稀释至10μg/ml。在96孔U形底板中用PBS中的3倍系列稀释度制备两种试剂的滴定液。

[0452] 将H929靶细胞在补充有GlutaMAX、10％FBS和25mM HEPES(培养基)的无抗生素RPMI 1640培养基中培养。在开始当天(第1天)，对靶细胞进行计数并将1000万个细胞以1350rpm离心3分钟，之后弃去上清液。将CellTrace FCSE增殖染色剂在18μl的无菌DMSO中复原，然后将1μl的溶液稀释在10ml的无菌PBS中。将细胞沉淀物重悬于1ml的CFSE稀释液中，并在室温下避光温育8分钟。温育后，将1ml的HI FBS加入细胞悬浮液中以淬灭多余的CFSE。将细胞在含有10％FBS的RPMI‑1640中洗涤两次。在10ml的RPMI中复原后，对细胞进行计数并将细胞活力记录在电子表格中。将细胞稀释至2.2×10^5/ml并在37℃下温育直至使用。

[0453] 将来自正常供体的Pan T细胞在37℃水浴中解冻，之后将冷冻小瓶的内容物转移至50ml锥形小瓶中并在30ml的冷培养基中复原。以1350rpm在4℃下将细胞离心3分钟。弃去上清液，并将细胞沉淀物在10ml的培养基中复原。对T细胞进行计数并记录活力。然后将细胞在培养基中复原至1.1×10^6/ml。

[0454] 将2×10^5个H929细胞加入96孔U形底板的孔中；在这项研究中不需要用Fc阻断剂温育。向孔中加入1×10^5个T细胞(5:1的效应子:靶比率)。在将靶细胞和T细胞混合后，将20μl的sBCMA、APRIL或BAFF加入孔中，然后加入5μl的抗体稀释液。将板在37℃下用5％CO2温育48小时。

[0455] 两天后，将板在4℃以1500rpm离心3分钟并弃去上清液。将细胞在200μl的PBS中洗涤并在室温下在50μl的近红外Live/Dead染色剂(1:200稀释度)和抗‑CD25 PE抗体(1:50稀释度)中温育20分钟。然后，将细胞在200μl的FACS缓冲液中洗涤一次，最后在150μl的FACS缓冲液中复原。使用FACSCanto II和FlowJo 7.6分析细胞的靶细胞毒性(靶％)和T细胞活化CD25+(活T细胞％)。使用具有可变斜率(四个参数)函数的非线性回归并使用最小二乘法在GraphPad Prism 6中完成数据的作图和拟合。

[0456] 在存在可溶性BCMA ECD的情况下，BCMB72能够对H929细胞施加细胞毒性，在高剂量(>160nM)的sBCMA ECD下对EC50的效应很小(增加2倍)；T细胞活化类似地受到影响(参见图18A和图18D)。APRIL使细胞毒性和T细胞活化的EC50值在高剂量(46nM)下增加6倍，而在较低剂量下对测定影响最小(参见图18B和图18E)。最大杀伤率不受sBCMA或APRIL的影响。相反，外源性BAFF在高达51nM的浓度下对BCMB72介导的细胞毒性没有影响(参见图18C)。可以预知，所有情况下的T细胞活化潜力均与杀伤数据良好地相关(参见图18F)。

[0457] 实施例19：BCMB72、APRIL和BAFF在体外与BCMA结合的竞争

[0458] 两种TNF配体APRIL和BAFF可与BCMA结合并诱导引起细胞存活和增殖的信号级联。BCMA的细胞外结构域是与这两个配体结合的54个氨基酸的短片段以及针对该基序而产生的抗体。在此，评估了这些配体对BCMB72的竞争性质。

[0459] 该测定以基于ELISA的形式设定。在准备该竞争测定的过程中，BCMA‑Fc将用MSD SulfoTag来标记。将50μg小瓶的BCMA‑Fc在500μL PBS中复原以产生0.1mg/mL(3.125μM单体)。将150nmol NHS‑sulfoTag溶于50μL水中以产生3mM溶液。向500μL BCMA‑Fc(1.56nmol单体)中加入5.2μL 3mM NHS‑SulfoTag(15.6nmol)以进行10x过量标记反应。反应物在室温下于黑暗中静置2小时。加入50μL 1M tris以淬灭未反应的NHS。在PBS平衡的2mL 7k MWCO Zeba离心柱上通过缓冲液交换除去过量的Sulfotag和tris。最终体积为约630μL，因此最终的SulfoTag‑BCMA‑Fc用作2.5μM。

[0460] 对于竞争性测定，将抗‑BAFF(100μg)和抗‑APRIL(100μg)在200μL PBS中复原以产生0.5mg/mL储液。将30μL(6μg)的抗‑APRIL和抗‑BAFF各自在2.97mL PBS中稀释以产生2μg/mL溶液。向96孔MSD高结合板的每个孔中加入25μL 2μg/mL抗‑APRIL。向第二96孔MSD高结合板的每个孔中加入25μL 2μg/mL抗‑BAFF。将板保持在4℃过夜以固定抗体。将涂布有抗‑APRIL和抗‑BAFF的板倾倒，并加入300μL/孔SuperBlock。在室温下阻断1小时后，将板用PBS‑T洗涤3次。将10μg的每种重组的APRIL和BAFF重悬于100μL PBS中以产生0.1mg/mL溶液。通过在2.94mL SuperBlock中稀释60μL新鲜复原的蛋白来制备每种APRIL和BAFF的3mL 2μg/mL溶液。向抗‑APRIL涂布的板的每个孔中加入25μL 2μg/mL APRIL，并将25μL 2μg/mL BAFF加入抗‑BAFF涂布的板的每个孔中。在室温下捕获1小时后，将板用PBS‑T洗涤3次。在
1mL PBS中复原500μg抗‑BCMA(R&D Sys Mab193)以产生0.5mg/mL(3.3μM)的储液。将抗‑BCMA Mab193、BCMB72.004和对照抗体(空白×CD3)在superblock中稀释至1μM。通过在200μL SuperBlock中混合100μL抗体来制备11pt三倍系列稀释度系列。通过在5.928mL 
SuperBlock中稀释上述72μL蛋白制备6mL 30nM SulfoTag‑BCMA‑FC。根据以下图1中的孔板布局图将25μL来自步骤11的每种抗体加入APRIL/BAFF捕获板的每个孔中。将25μL 30nM Sulfotag‑BCMA‑Fc加入两块板的每个孔中。在室温下1小时后，将板用PBS‑T洗涤3次。将150μL 1x MSD读取缓冲液T加入每个孔中，并且在Sector 6000成像器中扫描板。完全按照上述方法重复实验，得到第二组独立的结果。

[0461] 从图19中可以看出，当用增加量的BCMB72而不是对照抗体(空白×CD3)温育时，BCMA‑Fc蛋白被阻止与板结合的APRIL和BAFF结合。两个独立实验的观察结果是一致的，每个实验有三个重复。

[0462] 实施例20：多发性骨髓瘤患者骨髓CD138阳性细胞的BCMB72结合和细胞毒性。

[0463] 为了评价BCMB72在来自多发性骨髓瘤患者的原代样品中的效力，我们使用来自5位患者的冷冻骨髓多发性骨髓瘤样品和来自健康供体的T细胞，在细胞毒性杀伤测定中测试了该抗体。还测量了抗体结合和T细胞活化潜力。

[0464] BCMB72结合测定：

[0465] 将100μl的细胞悬浮液等分至96孔U形底板的每个孔中，然后加入95μl的培养基。然后将5μl的BCMB72或对照的系列稀释度加入孔中，并将板在4℃下温育1小时。染色后，将细胞以1,200rpm离心3分钟并在200μl的PBS中洗涤一次。将细胞再次离心；弃去上清液，之后，将沉淀物在50μl的近红外Live/Dead染色剂(1:200稀释度)、抗‑人IgG4 Fc PE抗体(1:
50稀释度)、抗‑CD138(MI15 1:50和DL‑101 1:50稀释度)中复原，并在室温下于黑暗中温育
20分钟。然后将细胞离心并在200μl的FACS缓冲液中洗涤，最后在150μl的FACS缓冲液中复原。使用FACSCanto II和FlowJo 7.6针对CD138+MNC上的BCMB72结合强度分析样品。使用具有可变斜率(四个参数)函数的非线性回归并使用最小二乘法在GraphPad Prism 6中完成数据的拟合。

[0466] T细胞重定向测定

[0467] 将1×10^5个靶细胞加入96孔U形底板的孔中，然后加入1×10^5个T细胞(5:1的效应子:靶近似比率，假定骨髓来源的肥大细胞中浆细胞计数为平均20％)。在混合靶细胞和T细胞后，将5μl的BCMB72稀释液加入每个孔中。将板在37℃下用5％CO2温育48小时。

[0468] 两天后，将板离心并弃去上清液。将细胞在200μl的PBS中洗涤，并在室温下在具有近红外Live/Dead染色剂(1:200稀释度)、抗‑CD138(MI15 1:50和DL‑101 1:50稀释度)、抗‑TCRα/β(1:50稀释度)和抗‑CD25Pe(1:50稀释度)的50μl PBS中温育20分钟。然后，将细胞在200μl的FACS缓冲液中洗涤一次，最后在150μl的FACS缓冲液中复原。使用FACSCanto II和FlowJo 7.6分析细胞的浆细胞细胞毒性(死亡CD138+细胞％)和T细胞活化CD25+(活T细胞％)。使用具有可变斜率(四个参数)函数的非线性回归并使用最小二乘法在GraphPad Prism 6中完成数据的作图和拟合。

[0469] 结果

[0470] 图20示出BCMB72在48小时后以剂量依赖性方式结合并诱导杀伤所有患者样品，如+由CD138 浆细胞的损失所证明的。可以预知，T细胞活化数据与杀伤数据良好地相关。T细胞活化的平均EC50在1nM范围内。这些数据证实，BCMB72可在体外杀伤原代多发性骨髓瘤骨髓细胞。

[0471] 实施例21：BCMB72在PBMC‑人源化NSG小鼠中的H929人多发性骨髓瘤异种移植物的肿瘤发生预防中的抗肿瘤功效

[0472] 该研究评价BCMB72在预防PBMC(外周血单核细胞)‑人源化NSG(非肥胖型糖尿病/重症联合免疫缺陷/γ链)小鼠中H929人多发性骨髓瘤(MM)异种移植物的肿瘤发生中的功效。NSG小鼠是缺乏成熟功能T细胞、B细胞和自然杀伤(NK)细胞的免疫妥协品系。在研究的7
第7天，向年龄匹配的雌性NSG小鼠静脉内注射1×10个人PBMC。在PBMC接种后的第1天，在
6
每只小鼠右后背侧皮下(sc)植入H929人MM细胞(在200μL PBS中5×10 个细胞)，接着向每个动物静脉内(IV)施用PBS和0.1μg(0.005mg/kg)、0.5μg(0.025mg/kg)和1μg(0.05mg/kg)BCMB72。每隔一天或每隔三天施用PBS对照和BCMB72，共进行五次处理。早在肿瘤细胞植入后第8天，在PBS处理组和0.1μg BCMB72处理组中可检测到H929sc肿瘤。来自这两组的肿瘤
3
继续生长，直到第22天的平均肿瘤体积>500mm。到第24天，PBS对照组的平均肿瘤体积已超
3
过1000mm。有趣的是，scH929肿瘤在用0.5μg和1μg BCMB72处理的小鼠中不生长(图21)。因此，在用0.5μg/动物和1μg/动物处理的所有动物中，BCMB72抑制H929人MM异种移植物的肿瘤发生。

[0473] 实施例22：来自用BCMB72处理的PBMC‑人源化NSG小鼠中H929(人多发性骨髓瘤细胞)异种移植物的小鼠血清中的可溶性BCMA定量

[0474] 该研究被设计用于定量来自H929异种移植小鼠的血清中的可溶性BMCA水平，并将可溶性BCMA水平与这些动物中的肿瘤负荷相关联。

[0475] 简而言之，通过从R&D Systems获得的BCMA酶联免疫吸附测定(ELISA)来分析来自异种移植物研究样品的血清。将血清解冻并在试剂稀释剂中以1:50稀释，然后在4℃下温育过夜。BCMA ELISA根据制造商的方案进行。使用设置在450nm下的MD SpectraMax读板仪M5(Molecular Devices,Sunnyvale CA)分析ELISA板。ELISA中的每个孔对应于来自原始异种移植物研究中的一只小鼠的血清。

[0476] 当与单独的PBS或0.1μg/小鼠的BCMB72相比时，用1μg和0.5μg的BCMB72处理的小鼠的小鼠血清中的可溶性BCMA浓度显著降低(图22)。这些数据支持异种移植物研究，其中用1μg和0.5μg的BCMB72处理的小鼠没有肿瘤生长或具有最小的肿瘤生长。这些数据表明，血清样品中的可溶性BCMA可指示性地为评估多发性骨髓瘤适应症的潜在生物标记；考察可溶性BCMA可有助于监测疾病负荷。

[0477] 序列表简述

[0478]

[0479]

[0480]

[0481]

[0482]

[0483]

[0484]

[0485]

[0486]

[0487]

[0488]

[0489]

[0490]

[0491]