一种黄酮类化合物及其制备方法以及应用

摘要

本发明提供了一种黄酮类化合物，本发明提供的化合物可显著降低脂肪酸引起的LO2人正常肝细胞内脂滴含量升高。降低小鼠高脂饮食(HFD)诱导的LDL‑C/HDL‑C、ALT、AST升高，对肝细胞内脂质累积有明显抑制作用。有望开发成新的具有预防或治疗脂肪性肝损伤的保健品或药品。

权利要求

1.一种黄酮类化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：A)将辐状肋柱花与乙醇溶液混合，进行提取，得到提取液；

浓缩所述提取液，得到提取物；

B)将所述提取物与乙醇溶液混合增溶，去除不溶物，得到上清液；

C)将所述上清液依次经过大孔树脂吸附洗脱、LH-20凝胶柱层析、ODS中低压柱层析以及高效液相制备色谱分离，得到具有式I所示结构的黄酮类化合物：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述提取的方法选自冷浸法、渗漉法、微波提取法、超声提取法或回流提取法；

提取次数为2～3次，提取时间为1～2小时。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述回流提取法为连续回流提取法。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤A)中，所述乙醇溶液为乙醇水溶液，所述乙醇水溶液的体积浓度为20％～80％；

所述辐状肋柱花与乙醇溶液的质量体积比为1g：(5～12)ml；

所述步骤B)中，所述乙醇溶液的体积浓度为10％～50％。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述大孔树脂的型号包括HP-20、D101、AB-8、732阳离子交换树脂、HPD400或HPD100；

经过大孔树脂吸附洗脱的具体方法为：

将所述上清液上大孔树脂柱，依次采用水、体积浓度30％的乙醇溶液、体积浓度为50％的乙醇溶液、体积浓度为70％的乙醇溶液、体积浓度为95％的乙醇溶液洗脱，每个梯度洗脱

5个柱体积，得到5个馏分，取经过体积浓度为50％的乙醇溶液洗脱的馏分。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述LH-20凝胶柱层析的方法为：将经过体积浓度为50％的乙醇溶液洗脱的馏分经LH-20凝胶柱层析，用甲醇洗脱，依次得到20个馏分，取第12个馏分。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述ODS中低压柱层析的方法为：取经过LH-20凝胶柱层析的第12个馏分经过ODS中低压柱层析，用甲醇和水的混合液依次按体积比1:9、3:7、4:6、1:1、7:3、1:0洗脱，取甲醇和水的混合液体积比为4:6洗脱得到的馏分。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述高效液相制备色谱的色谱柱为C18色谱柱，流动相为体积百分比为10％～80％的甲醇水溶液或体积百分比为10％～40％的乙腈水溶液，流速为4～50ml/min。

说明书

一种黄酮类化合物及其制备方法以及应用

技术领域

[0001] 本发明属于医药技术领域，具体涉及一种黄酮类化合物及其制备方法以及应用。

背景技术

[0002] 辐状肋柱花为龙胆科肋柱花属草本植物辐状肋柱花Lomatogonium rotatum(L.)Fries ex Nym的干燥全草。辐状肋柱花分布于我国内蒙、西藏、云南、四川、青海、甘肃、新疆等地，是蒙医治疗肝胆疾病的主要传统药物，具有平息“协日”，清热，健胃，愈伤功能；用于“协日”热，瘟疫，流感，伤寒，中暑头痛，肝胆热，黄疸，胃协日，伤热等病症，临床疗效显著。然而，目前辐状肋柱花中主要活性成分不明，其肝部疾病的作用物质仍不清楚。

[0003] 非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指除酒精和其他已明确的肝损因素所致的肝细胞内脂肪过度沉积为主要病征的临床病理综合症，与胰岛素抵抗和遗传易感性密切相关的获得性代谢应激性肝损伤。随着肥胖及其相关代谢综合征全球化的流行趋势，非酒精性脂肪性肝病现已成为欧美等发达国家和我国富裕地区慢性肝病的重要病因，普通成人NAFLD患病率10％～30％，其中非酒精性脂肪性肝炎10年内肝硬化发生率高达25％。非酒精性脂肪性肝病除可直接导致失代偿期肝硬化、肝细胞癌和移植肝复发外，还可影响其他慢性肝病的进展，并参与Ⅱ型糖尿病和动脉粥样硬化的发病。代谢综合征相关恶性肿瘤、动脉硬化性心脑血管疾病以及肝硬化为影响非酒精性脂肪性肝病患者生活质量和预期寿命的重要因素。为此，非酒精性脂肪性肝病是当代医学领域的新挑战，其治疗药物的研究仍然是人类健康事业的必要方向与任务。

发明内容

[0004] 有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种黄酮类化合物及其制备方法以及应用，本发明提供黄酮类化合物可以有效的预防和治疗脂肪肝损伤。

[0005] 本发明提供了一种黄酮类化合物，具有式I所示结构：

[0006]

[0007] 本发明还提供了一种黄酮类化合物的制备方法，包括以下步骤：

[0008] A)将辐状肋柱花与乙醇溶液混合，进行提取，得到提取液；

[0009] 浓缩所述提取液，得到提取物；

[0010] B)将所述提取物与乙醇溶液混合增溶，去除不溶物，得到上清液；

[0011] C)将所述上清液依次经过大孔树脂吸附洗脱、LH-20凝胶柱层析、ODS中低压柱层析以及高效液相制备色谱分离，得到具有式I所示结构的黄酮类化合物：

[0012]

[0013] 优选的，所述提取的方法选自冷浸法、渗漉法、微波提取法、超声提取法、回流提取法或连续回流提取法；

[0014] 提取次数为2～3次，提取时间为1～2小时。

[0015] 优选的，步骤A)中，所述乙醇溶液为乙醇水溶液，所述乙醇水溶液的体积浓度为20％～80％；

[0016] 所述辐状肋柱花与乙醇溶液的质量体积比为1g：(5～12)ml；

[0017] 所述步骤B)中，所述乙醇溶液的体积浓度为10％～50％。

[0018] 优选的，所述大孔树脂的型号包括HP-20、D101、AB-8、732阳离子交换树脂、HPD400或HPD100；

[0019] 经过大孔树脂吸附洗脱的具体方法为：

[0020] 将所述上清液上大孔树脂柱，依次采用水、体积浓度30％的乙醇溶液、体积浓度为50％的乙醇溶液、体积浓度为70％的乙醇溶液、体积浓度为95％的乙醇溶液洗脱，每个梯度洗脱5个柱体积，得到5个馏分，取经过体积浓度为50％的乙醇溶液洗脱的馏分；

[0021] 优选的，所述LH-20凝胶柱层析的方法为：

[0022] 将经过体积浓度为50％的乙醇溶液洗脱的馏分经LH-20凝胶柱层析，用甲醇洗脱，依次得到20个馏分，取第12个馏分。

[0023] 优选的，所述ODS中低压柱层析的方法为：

[0024] 取经过LH-20凝胶柱层析的第12个馏分经过ODS中低压柱层析，用甲醇和水的混合液依次按体积比1:9、3:7、4:6、1:1、7:3、1:0洗脱，取甲醇和水的混合液体积比为4:6洗脱得到的馏分。

[0025] 优选的，所述高效液相制备色谱的色谱柱为C18色谱柱，流动相为体积百分比为10％～80％的甲醇水溶液或体积百分比为10％～40％的乙腈水溶液，流速为4～50ml/min。

[0026] 本发明还提供了一种上述黄酮类化合物在制备预防和治疗脂肪肝损伤药物和保健品中的应用。

[0027] 优选的，所述药物包括权利要求1所述的黄酮类化合物及其药学上可接受的载体，所述药物的剂型包括片剂、胶囊剂、注射剂、粉针剂、颗粒剂、脂肪乳剂、微囊、滴丸、脂质体或缓控释制剂。

[0028] 与现有技术相比，本发明提供了一种黄酮类化合物，本发明提供的化合物可显著降低脂肪酸引起的LO2人正常肝细胞内脂滴含量升高。降低小鼠高脂饮食(HFD)诱导的LDL-C/HDL-C、ALT、AST升高，对肝细胞内脂质累积有明显抑制作用。有望开发成新的具有预防或治疗脂肪性肝损伤的保健品或药品。

附图说明

[0029] 图1为本发明提供的黄酮类化合物的结构式；

[0030] 图2为LZH对LO2细胞内脂滴含量的影响定量分析图；

[0031] 图3为LZH对LO2细胞内甘油三酯含量的影响定量分析图。

具体实施方式

[0032] 本发明提供了一种黄酮类化合物，具有式I所示结构：

[0033]

[0034] 本发明还提供了一种具有上述结构的黄酮类化合物的制备方法，包括以下步骤：

[0035] A)将辐状肋柱花与乙醇溶液混合，进行提取，得到提取液；

[0036] 浓缩所述提取液，得到提取物；

[0037] B)将所述提取物与乙醇混合增溶，去除不溶物，得到上清液；

[0038] C)将所述上清液依次经过大孔树脂吸附洗脱、LH-20凝胶柱层析、ODS中低压柱层析以及高效液相制备色谱分离，得到具有式I所示结构的黄酮类化合物。

[0039] 具体的，本发明以辐状肋柱花为原料进行黄酮类化合物提取，具体方法为：

[0040] 将辐状肋柱花与乙醇溶液混合，进行提取，得到提取液。

[0041] 其中，所述乙醇溶液为乙醇水溶液，所述乙醇水溶液的体积浓度为20％～80％，优选为30％～70％，更优选为70％。

[0042] 所述辐状肋柱花与乙醇溶液的质量体积比为1g：(5～12)ml，优选为1g：10ml；

[0043] 本发明对所述提取方法并没有特殊限制，优选为冷浸法、渗漉法、微波提取法、超声提取法、回流提取法或连续回流提取法。

[0044] 所述提取次数优选为2次，提取时间优选为1～2小时。

[0045] 将两次提取的液体合并，即可得到提取液。

[0046] 得到提取液后，将所述提取液进行浓缩，优选为减压浓缩，浓缩至乙醇完全去除即可，得到提取物。

[0047] 接着，将所述提取物与乙醇溶液混合增溶，去除不溶物，得到上清液。

[0048] 其中，所述乙醇溶液的体积浓度为10％～50％，优选为20％～40％。

[0049] 所述提取物与所述乙醇溶液的质量体积比为1g：(2～15)ml。

[0050] 得到上清液后，将所述上清液依次经过大孔树脂吸附洗脱、LH-20凝胶柱层析、ODS中低压柱层析以及高效液相制备色谱分离，得到具有式I所示结构的黄酮类化合物。

[0051] 所述大孔树脂的型号包括HP-20、D101、AB-8、732阳离子交换树脂、HPD400或HPD100，优选为HP-20型号大孔树脂；

[0052] 经过大孔树脂吸附洗脱的具体方法为：

[0053] 将所述上清液上大孔树脂柱，依次采用水、体积浓度30％的乙醇溶液、体积浓度为50％的乙醇溶液、体积浓度为70％的乙醇溶液、体积浓度为95％的乙醇溶液洗脱，每个梯度洗脱5个柱体积，得到5个馏分，取经过体积浓度为50％的乙醇溶液洗脱的馏分；

[0054] 其中，所述上清液与大孔树脂的质量为1:3(以上清液中药材与树脂质量比计)。

[0055] 接着，将上述经过体积浓度为50％的乙醇溶液洗脱的馏分经过LH-20凝胶柱层析。

[0056] 具体方法为：

[0057] 将经过体积浓度为50％的乙醇溶液洗脱的馏分经LH-20凝胶柱层析，用甲醇洗脱，依次得到20个馏分，取第12个馏分。

[0058] 然后，将经过LH-20凝胶柱层析的第12个馏分经过ODS中低压柱层析。

[0059] 具体方法为：

[0060] 取经过LH-20凝胶柱层析的第12个馏分经过ODS中低压柱层析，用甲醇和水的混合液依次按体积比1:9、3:7、4:6、1:1、7:3、1:0洗脱，取甲醇和水的混合液体积比为4:6洗脱得到的馏分。

[0061] 最后，取甲醇和水的混合液体积比为4:6洗脱得到的馏分经过高效液相制备色谱分离，得到具有式I所示结构的黄酮类化合物。

[0062] 其中，所述高效液相制备色谱的色谱柱为C18色谱柱，流动相为体积百分比为10％～80％的甲醇水溶液，优选为20％～60％，更优选为22％；或体积百分比为10％～40％的乙腈水溶液，优选为20％～30％，流速为4～50ml/min，优选为10～40ml/min。

[0063] 本发明还提供了一种上述具有式I所示结构的黄酮类化合物在制备预防和治疗脂肪肝损伤药物和保健品中的应用。

[0064] 其中，所述药物包括具有式I所示结构的黄酮类化合物及其药学上可接受的载体，所述药物的剂型包括片剂、胶囊剂、注射剂、粉针剂、颗粒剂、脂肪乳剂、微囊、滴丸、脂质体以及缓控释制剂。

[0065] 本发明提供了一种黄酮类化合物，本发明提供的化合物可显著降低脂肪酸引起的LO2人正常肝细胞内脂滴含量升高。降低小鼠高脂饮食(HFD)诱导的LDL-C/HDL-C、ALT、AST升高，对肝细胞内脂质累积有明显抑制作用。有望开发成新的具有预防或治疗脂肪性肝损伤的保健品或药品。

[0066] 为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的黄酮类化合物及其制备方法以及应用进行说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。

[0067] 实施例1

[0068] (1)取干燥的肋柱花药材，加入10倍量的浓度70％乙醇提取两次，时间分别为2小时、1小时，过滤，合并提取液，减压浓缩至无醇味，得到提取物；

[0069] (2)取步骤(1)的提取物加入95％乙醇调节含醇浓度为20％，滤过，除去不溶物，得到上清液。

[0070] (3)取步骤(2)得到的上清液上样于HP-20型号大孔树脂柱(样品：树脂＝1：3)，分别采用水、30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇、95％乙醇洗脱，每个梯度洗脱5个柱体积，得到5个馏分；取50％乙醇洗脱馏分用甲醇溶解，经LH-20凝胶柱层析，用甲醇洗脱，得到20个馏份。取馏分12经ODS中低压柱层析(50mm×400mm，50μm)，用甲醇和水的混合液依次按体积比1:9、3:7、4:6、1:1、7:3、1:0洗脱，取甲醇和水的混合液体积比为4:6洗脱得到的流份，最后用制备高效液相色谱，色谱条件为：ODS-C18色谱柱，甲醇-水22:88为流动相，保留时间为
75min，最后分离得到纯的化合物(纯度99.3％)，结构式为

[0071]

[0072] 结构解析：

[0073] 主要利用光谱技术，包括紫外、红外、质谱、核磁共振(1H-NMR、13C-NMR、2D-NMR)鉴定其结构，再经TOF高分辨质谱精确确定其分子量及分子式。

[0074] 其波谱数据如下：

[0075] (1)化合物为黄色无定形粉末。其Q-TOF-MS在m/z＝598.1814[M+H]+，其对应于分子式C27H32O15。1H NMR谱在δ7.36(1H，d，J＝9.1Hz，H-3)，6.85(1H，d，J＝9.1Hz，H-2)6.77(1H，d，J＝2.3Hz，H-7)和6.76(1H，d，J＝2.4Hz，H-5)显示两个AB偶合。另外，1H NMR谱显示在δ3.89(3H，s，-OCH3)，3.89(3H，s，-OCH3)，3.81(3H，s，-OCH3)上有三个甲氧基的特征信号和在δ4.90(1H，d，J＝7.7Hz，H-1')和δ4.18(1H，d，J＝7.6Hz，H-1″)的两个糖端基质子信号。13C NMR谱显示27个碳信号，其中十三个为山酮骨架(δC 174.76,164.61,159.31,157.68,152.91,146.27,141.73,116.96,114.02,108.44,106.10,100.94,95.46)，并且显示存在β-D-木糖(δC104.6,77.0,73.8,70.0,66.1)，β-D-葡萄糖(δC103.1,76.3,76.3,73.9,70.2,
69.1)。然后结合HMBC，HSQC等二维核磁共振波谱数据，确定化合物的最终结构，如图1所示。

[0076] 1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ:3.89,3.89,3.81(each3H，s，-OCH3),7.36(1H，d，J＝9.1Hz，H-3)，6.85(1H，d，J＝9.1Hz，H-2)6.77(1H，d，J＝2.3Hz，H-7),6.76(1H，d，J＝2.4Hz，H-5),4.90(1H，d，J＝7.7Hz，H-1'),4.18(1H，d，J＝7.6Hz，H-1″),2.27(6H,s,2×N-CH3),
7.20(1H,s,H-2),7.84(1H,s,H-5),7.51(1H,m,H-6),7.55(1H,m,H-7),9.84(1H,d,J＝
8.6Hz,H-8),7.64(1H,d,J＝9.1Hz,H-9),7.85(1H,d,J＝8.9Hz,H-10),3.16(1H,m,H-11),
2.58(2H,t,J＝7.5Hz,H-12),4.86(1H,d,J＝7.0Hz,H-1′),2.98(1H,m,H-2′),3.33(1H,m,H-3′),3.22(1H,m,H-4′),3.62(1H,m,H-5′),3.96(1H,m,H-6′a),3.66(1H,m,H-6′b),4.18(1H，d，J＝7.6Hz，H-1″),3.40(1H,m,H-2″),3.09(1H,m,H-3″),3.27(1H,m,H-4″),3.68(1H,m,H-5″b),3.01(1H,m,H-5″a)；

[0077] 13C NMR(150MHz,DMSO-d6)δ:152.4(C-1),116.5(C-2),105.6(C-3),141.3(C-4),95.0(C-5),158.8(C-6),100.5(C-7),164.1(C-8),145.8(C-4a),157.2(C-4b),108.0(C-
8a),113.5(C-8b),174.3(CO),103.1(C-1′),73.9(C-2′),76.3(C-3′),70.2(C-4′),76.3(C-5′),69.1(C-6′),104.6(C-1″),73.8(C-2″),77.0(C-3″),70.0(C-4″),66.1(C-5″),。

[0078] 实施例2药效实验研究

[0079] 一、实验材料

[0080] 1.药物、试剂、动物、细胞

[0081] 人正常肝细胞株(上海慧颖生物科技有限公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，RPMI Medium 1640培养基(Solarbi公司),油酸(OA,O7501)、棕榈酸(PA,P9767)均购自SIGMA公司，生化检测试剂盒(南京建成生物工程研究所有限公司)，胰酶-EDTA消化液(Solarbio公司)，谷丙转氨酶测定试剂盒(R1、R2)(日本和光纯药工业株式会社)、谷草转氨酶测定试剂盒(R1、R2)(日本和光纯药工业株式会社)。

[0082] 2.实验仪器

[0083] 倒置显微镜(Olympus-ckx41)，生物安全柜(Heal Force)，AL204型电子分析天平(Mettler Toledo仪器(上海)有限公司)，MTV—100型多管漩涡混合仪(杭州奥盛仪器有限公司)，日立7180型全自动生化分析仪(日立公司)。

[0084] 二、实验方法

[0085] 1.该化合物对LO2细胞内脂质水平的影响

[0086] 1.1细胞培养

[0087] L-02细胞用含有5％胎牛血清的1640培养液,于37℃、含5％CO2的培养箱中培养48h,细胞70％～80％融合时,用于实验。将油酸或棕榈酸溶解于异丙醇中，制备为500mM的储存液。将细胞种于96孔板中，每孔约10000个细胞，培养24h,吸去旧的培养基，然后将细胞随机分成5组：空白组，模型组(200mM FFAs，油酸∶棕榈酸＝2∶1)，给药组(高中低剂量)，每组6个复孔，空白组加100μl新的培养液，模型组及给药组加入100μl含有200mMFFAs的培养液，继续培养24h，吸去培养液，空白组及模型组加100μl新的培养液，给药高中低剂量组分别加入100μl含有1，2，4μg/ml的该化合物培养液，继续培养24h。

[0088] 1.2脂滴油红O染色检测

[0089] 细胞内用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤LO2细胞或大鼠肝细胞两次，用4％多聚甲醛固定30分钟，然后用油红O溶液在室温下染色1小时。吸去染色液，用纯水冲洗两次，每孔加入150μL二甲基亚砜，振摇，在510nm波长下用酶标仪测量吸光度。

[0090] 1.2甘油三酯含量的测定

[0091] 收集各处理组细胞，组织细胞酶法测定肝细胞甘油三酯含量。具体操作步骤按试剂盒说明书进行。

[0092] 2动物实验和血清分析

[0093] 将5周龄的ICR小鼠置于温度(22±2℃)和湿度受控(50％±5％)的房间内。常规饮食(RD；10％kcal％脂肪)和HFD(60％kcal％脂肪；)实验饮食购自Research Diets(美国新泽西州)，给予过量食物和饮用水。适应1周后，将小鼠随机分成以下组：RD喂养组(n＝7)，HFD喂养组(n＝7)和三个治疗组(n＝7，HFD加实施例1制备的具有式I结构的化合物250mg/kg(LZH250)组，HFD加实施例1制备的具有式I结构的化合物500mg/kg(LZH500)组和HFD加二甲双胍(MET)300mg/kg组作为阳性对照组)。给小鼠口服给予媒介物或相应的药物，剂量为每日一次，持续12周，每天测量体重。处理12周后，将小鼠禁食过夜并取血。收集血液样品后，使血液在室温下凝固，然后在4℃以2,000r/min离心10分钟制备血清。血清储存在-75℃以备后用。使用试剂盒(Stanbio Laboratory，Boerne，USA)及全自动生化分析仪测定血清高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)，低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)，丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)的水平。

[0094] 三、实验结果

[0095] 1该化合物对LO2细胞内脂质水平的影响

[0096] 油红O染色检测结果如图2所示，与正常组相比较，游离脂肪酸作用于LO2细胞24h后，细胞内脂滴含量显著增加(P<0.05)，图2中，*代表与模型组相比较，差异显著(*P<0.05)。与模型组相比较，给药组显著降低细胞内脂滴含量。肝细胞内三酰甘油含量，给药组较模型组显著降低(P＜0.05)，如图3所示，图3中，*代表与模型组相比较，差异显著(*P<
0.05)。

[0097] 2动物实验结果

[0098] 实验结果显示该化合物显着提高HDLC水平，同时防止HFD喂养引起的LDL-C水平升高。与HFD组相比，该化合物组LDL-C与HDL-C的比例显着降低。250、500mg/kg组与HFD组比较，小鼠血清ALT、AST水平显著降低。具体实验结果见表1。

[0099] 表1对ICR小鼠高脂饮食(HFD)诱导的变化的影响。(mean±SD，n＝7)

[0100]

[0101] 注：*代表与模型组相比较，差异显著(*P<0.05)，**代表与模型组相比较，差异极显著(**P<0.01)。

[0102] 以上实验结果表明，本发明提供的化合物可显著降低脂肪酸引起的肝细胞内脂滴含量及甘油三酯含量升高，降低小鼠高脂饮食(HFD)诱导的LDL-C/HDL-C、ALT、AST升高，对肝细胞内脂质累积有明显抑制作用。有望开发成新的具有预防或治疗脂肪性肝损伤作用的保健品或药品。

[0103] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。