一种热稳定性高的脂肪酶突变体TDL-mut及其编码基因

摘要

本发明属于蛋白质工程领域，涉及一种热稳定性高的脂肪酶突变体TDL‑mut及其编码基因。本发明所述的脂肪酶突变体TDL‑mut的突变位点为：突变位点为F12C，R42S，G43E，S44N，I45V，I98L，N99A，L100A，K103T，G104E，T231N和K237C，进而获得一种热稳定性提高的1，3位置特异性脂肪酶突变体TDL‑mut。该突变体TDL‑mut在80℃水浴5min后的酶活保留率为70％，而脂肪酶TDL在80℃水浴5min后的酶活保留率仅为18％。相对于脂肪酶TDL，突变体TDL‑mut耐热性的提高幅度为288％。因此，本发明的获得的脂肪酶突变体TDL‑mut具有良好的热稳定性，为其产业化应用奠定基础。

权利要求

1.一种热稳定性高的脂肪酶突变体TDL-mut，其特征在于，编码其氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.根据权利要求1所述的热稳定性高的脂肪酶突变体TDL-mut，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

3.根据权利要求2所述的热稳定性高的脂肪酶突变体TDL-mut，其特征在于，所述的脂肪酶突变体TDL-mut包含的突变位点为F12C，R42S，G43E，S44N，I45V，I98L，N99A，L100A，K103T，G104E，T231N和K237C。

4.根据权利要求2所述的热稳定性高的脂肪酶突变体TDL-mut，其特征在于，其最适反应pH均为8.0，最适反应温度为65℃。

5.一种获得权利要求1-4任一所述的热稳定性高的脂肪酶突变体TDL-mut的突变方法，其包括如下步骤：

1)脂肪酶TDL基因合成及克隆：将已公布的脂肪酶TDL基因，按照毕赤酵母密码子偏好性进行合成得到合成基因，然后以合成基因为模板，进行PCR扩增，将扩增得到的片段克隆到载体pPICzαA上，得到重组载体pPICzαA-tdl；

2)理性定点突变：以pPICzαA-tdl为模板，进行PCR扩增，根据琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果纯化回收PCR产物；使用限制性内切酶DpnI将纯化回收的pPICzαA-tdl质粒分解，将分解产物用热激法转入大肠杆菌Top10，通过菌液PCR验证重组转化子，提取验证正确的转化子的质粒进行测序，从而确定相应的突变体；将测序正确的突变体用SacI线性化，转入毕赤酵母X33。

6.根据权利要求5所述的获得热稳定性高的脂肪酶突变体TDL-mut的突变方法，其特征在于，所述步骤1)中PCR扩增引物为：5’端：5'–AGTCGAATTCTCTCCAGTCAGACGTG  AGGTT-3'；3’端：5'-TTCTCTAGA TTACAAACAAGTACCAATCAA-3'。

7.一种包含SEQ ID NO：2核苷酸序列的TDL-mut基因。

8.一种包含权利要求1所述的突变体TDL-mut基因的重组载体。

9.一种包含权利要求3所述的突变体TDL-mut基因的重组菌株。

说明书

一种热稳定性高的脂肪酶突变体TDL-mut及其编码基因

技术领域

[0001] 本发明涉及蛋白质工程领域，通过理性设计得到了热稳定性提高的1，3位置特异性脂肪酶突变体TDL-mut。

背景技术

[0002] 脂肪酶(EC 3.1.1.3)全称三酰基甘油酰水解酶，属于α/β折叠酶家族，是一种丝氨酸水解酶。脂肪酶不仅可以在油水界面上催化天然底物油脂水解，释放更少酯键的甘油酯或甘油及脂肪酸，而且在非水相体系中脂肪酶还可催化酸解、转酯和酯合成等反应。由于脂肪酶这种特殊的酶学特性使其广泛的应用于食品加工、饲料、洗涤、医药等领域。

[0003] 随着不同工业领域的发展，对脂肪酶的要求也越来越高，如油脂加工和饲料工业领域许多工艺环节涉及到高温环境，热稳定性差的脂肪酶在上述工艺中易失活变性，因此开发热稳定性脂肪酶具有重要意义。本实验室前期克隆、表达了1，3位置特异性脂肪酶TDL，该酶具有很强的水解活性并且作用底物广泛，但是TDL在高温环境下容易变性失活，不利于其产业化应用。本发明通过理性设计获得了热稳定性高的脂肪酶突变体TDL-mut，为脂肪酶TDL的产业化应用奠定基础。

发明内容

[0004] 本发明的目的是通过对1，3位置特异性脂肪酶TDL进行分子改造，使改造后的脂肪酶具有更好的热稳定性，符合工业化应用的要求。

[0005] 本发明的目的是提供热稳定性高的脂肪酶突变体TDL-mut及其基因。

[0006] 一种热稳定性高的脂肪酶突变体TDL-mut，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

[0007] 原始脂肪酶TDL的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。与脂肪酶TDL相比，突变体TDL-mut包含的突变位点为F12C，R42S，G43E，S44N，I45V，I98L，N99A，L100A，K103T，G104E，T231N和K237C。突变体TDL-mut在80℃水浴5min后的酶活保留率为70％，而脂肪酶TDL在80℃水浴5min后的酶活保留率仅为18％。相对于脂肪酶TDL，突变体TDL-mut耐热性的提高幅度为288％。因此，本发明的获得的脂肪酶突变体TDL-mut具有良好的热稳定性，为其产业化应用奠定基础。

[0008] 上述所述的热稳定性高的脂肪酶突变体TDL-mut，其最适反应pH均为8.0，最适反应温度为65℃。

[0009] 一种获得上述热稳定性高的脂肪酶突变体TDL-mut的突变方法，其包括如下步骤：

[0010] 1)脂肪酶TDL基因合成及克隆：将已公布的脂肪酶TDL基因(Genebank：AF123252)，按照毕赤酵母密码子偏好性进行合成得到合成基因，然后以合成基因为模板，进行PCR扩增，将扩增得到的片段克隆到载体pPICzαA上，得到重组载体pPICzαA-tdl；

[0011] 2)理性定点突变：以pPICzαA-tdl为模板，进行PCR扩增，根据琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果纯化回收PCR产物；使用限制性内切酶DpnI将原始质粒分解，将分解产物用热激法转入大肠杆菌Top10，通过菌液PCR验证重组转化子，提取验证正确的转化子的质粒进行测序，从而确定相应的突变体。将测序正确的突变体，用SacI线性化，转入毕赤酵母X33。

[0012] 如上所述的获得上述热稳定性高的脂肪酶突变体TDL-mut的突变方法中，所述步骤1)中PCR扩增引物为5’端(5'–agtcgaattcTCTCCAGTCAGACGTGAGGTT-3')和3’端(5'-ttctctagaTTACAAACAAGTACCAATCAA-3')。

[0013] 本发明还请求保护一种包含SEQ ID NO：2核苷酸序列的TDL-mut基因。

[0014] 本发明还请求保护一种包含权利要求1所述的突变体TDL-mut基因的重组载体。

[0015] 本发明还请求保护一种包含权利要求3所述的突变体TDL-mut基因的重组菌株。

[0016] 本发明突变体TDL-mut在80℃水浴5min后的酶活保留率为70％，而脂肪酶TDL在80℃水浴5min后的酶活保留率仅为18％。相对于脂肪酶TDL，突变体TDL-mut耐热性的提高幅度为288％。因此，本发明的获得的脂肪酶突变体TDL-mut具有良好的热稳定性，为其产业化应用奠定基础。

附图说明

[0017] 图1原始脂肪酶TDL和突变体TDL-mut的最适反应pH。

[0018] 图2原始脂肪酶TDL和突变体TDL-mut的pH稳定性。

[0019] 图3原始脂肪酶TDL和突变体TDL-mut的最适反应温度。

具体实施方式

[0020] 以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。实验材料和试剂：

[0021] 1、菌株与载体

[0022] 大肠杆菌菌株Topl0、毕赤酵母X33、载体pPICzαA，Zeocin购自Invitrogen公司。

[0023] 2、酶与试剂盒

[0024] Q5高保真Taq酶MIX购自NEB公司，质粒提取，胶纯化，限制性内切酶、试剂盒购自上海生工公司。

[0025] 3、培养基

[0026] 大肠杆菌培养基为LB(1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，pH7.0)。LBZ为LB培养基加25ug/mL Zeocin。

[0027] 酵母培养基为YPD(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)。酵母筛选培养基为YPDZ(YPD+100mg/L zeocin)

[0028] 酵母诱导培养基BMGY(I％酵母提取物、2％蛋白胨、1.34％YNB、0.00004％Biotin、1％甘油(V/V))和BMMY(除以0.5％甲醇代替甘油，其余成份相与BMGY相同)。

[0029] 实施例1脂肪酶TDL基因合成及克隆

[0030] 将已公布的脂肪酶TDL基因(Genebank：AF123252)，按照毕赤酵母密码子偏好性进行合成。根据合成的基因分别在5’端(5'–agtcgaattcTCTCCAGTCAGACGTGAGGTT-3')和3’端(5'-ttctctagaTTACAAACAAGTACCAATCAA-3')设计PCR引物，以合成基因为模板，进行PCR扩增，将扩增得到的片段克隆到载体pPICzαA上，得到重组载体pPICzαA-tdl。

[0031] 实施例2理性定点突变

[0032] 以上述pPICzαA-tdl为模板，进行PCR扩增。琼脂糖电泳检测PCR扩增结果，纯化回收PCR产物。用限制性内切酶DpnI将原始质粒分解，将分解完的产物用热激法转入大肠杆菌Top10，通过菌液PCR验证重组转化子，提取验证正确的转化子的质粒进行测序，从而确定相应的突变体。将测序正确的突变体，用SacI线性化，转入毕赤酵母X33。

[0033] 实施例3筛选热稳定性提高的突变菌株

[0034] 将实施例2中的酵母重组转化子用牙签逐个挑至含有50mL BMGY培养基的250mL摇瓶中，30℃，220rpm培养24h左右，离心去上清。再分别加入BMMY培养基稀释菌体至OD600值为1.0。30℃，220rpm培养24h后，取样离心取上清，进行脂肪酶酶活及耐热性测定。脂肪酶酶活检测参照中华人民共和国国家标准《GB/T 23535-2009》进行测定。脂肪酶耐热检测方法如下：将稀释好的脂肪酶酶液加入10mL玻璃试管中，将装有酶液的玻璃试管在80℃条件下，水浴处理5min，参照国标《GB/T 23535-2009》测定剩余脂肪酶的酶活，以没有做热处理的脂肪酶，作为对照，进行剩余酶活计算。剩余酶活率以热处理样品酶活除以对照样品酶活，再乘以100％表示。

[0035] 实施例4原始脂肪酶TDL及脂肪酶单点突变体的热稳定性分析

[0036] 原始脂肪酶TDL及单点突变体的耐热性结果如表1所示，由表1可知脂肪酶TDL单点突变体在80℃水浴处理5min条件下的剩余酶活率的范围为19％-26％，相比原始脂肪酶酶的耐热性(18％)，具有一定程度的提高。

[0037] 表1 原始脂肪酶TDL和单点突变体热稳定性分析

[0038]编号 剩余酶活(％)
原始脂肪酶TDL 18
F12C 20
R42S 19
G43E 25
S44N 24
I45V 23
I98L 22
N99A 20
L100A 22
K103T 24
G104E 26
T231N 25
K237C 23

[0039] 实施例5组合突变

[0040] 将实施例4获得的单点突变体进行叠加组合，最终得到突变体TDL-mut，TDL-mut包括的突变位点有：F12C，R42S，G43E，S44N，I45V，I98L，N99A，L100A，K103T，G104E，T231N和K237C。TDL-mut的核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4所示。脂肪酶突变体TDL-mut在80℃水浴处理5min条件下的剩余酶活率为70％，而脂肪酶TDL在80℃水浴5min后的酶活保留率仅为18％。相对于脂肪酶TDL，突变体TDL-mut耐热性的提高幅度为
288％。

[0041] 实施例6脂肪酶TDL和突变体TDL-mut的最适反应pH

[0042] 参照国标法，测定脂肪酶TDL和突变体TDL-mut的最适反应pH。由图1可知，TDL和突变体TDL-mut的最适反应pH均为8.0，在pH6-9范围内相对酶活均大于70％。

[0043] 实施例7脂肪酶TDL和突变体TDL-mut的pH稳定性

[0044] 将脂肪酶TDL和突变体TDL-mut分别在pH4-10条件下室温处理4小时，然后参照国标法，测定脂肪酶TDL和突变体TDL-mut的剩余酶活，结果如图2所示。由图2可知脂肪酶TDL和突变体TDL-mut的pH稳定性基本一样，在pH5-9范围内很稳定，室温处理4小时后，剩余酶活均大于80％。

[0045] 实施例8脂肪酶TDL和突变体TDL-mut的最适反应温度

[0046] 参照国标法，测定脂肪酶TDL和突变体TDL-mut的最适反应温度，结果如图3所示。由图3可知，原始脂肪酶TDL的最适反应温度为60℃，而突变体TDL-mut的最适反应温度为65℃。