本发明公开了一种双高度照明傅里叶叠层显微成像方法，属于光学技术领域。实现该方法的成像系统光路包括螺旋高度调节架、LED阵列、被测样品、显微物镜、成像透镜、相机、显微镜。本发明通过改变样品与LED平面之间的距离，通过对两个高度下记录到的低分辨率强度像按照照明入射角依次增大的顺序共同进行重建迭代，可以增加低频部分采样率，进而在保持其它成像系统参数不变情况下，有效增大频谱中低频区域的交叠率和数据冗余度，进一步提高FPM的成像精度和收敛速度。
1.一种双高度照明傅里叶叠层显微成像方法，实现该方法的成像系统光路包括螺旋高度调节架、LED阵列、被测样品、显微镜中的显微物镜以及成像透镜、相机；螺旋高度调节架用来固定LED阵列，通过螺旋高度调节架调节LED阵列的照明高度；LED阵列依次点亮发光单元用于为被测样品提供不同角度的照明光；被测样品置于LED阵列和显微物镜之间，被测样品处于显微物镜的焦平面上；显微物镜和成像透镜共同组成一个4f系统，照明光束从LED阵列发出，经被测样品散射后通过该4f系统在成像透镜的后焦面上成像，并由相机记录；相机用来记录被测样品在不同高度照明下的低分辨率的强度像Imi(x,y)和Imi′(x,y)，i＝1，2,
3…N，N表示LED总个数；显微物镜、成像透镜均安装在显微镜上，显微镜的载物台用来固定样品；其特征在于：该方法包括在两个照明高度下的LED阵列发光单元作为点光源，分别拍摄低分辨率的强度像Imi(x,y)和Imi′(x,y)，将两个高度下得到的强度像根据入射角依次增大且顺时针方向进行排序编号，再通过再现算法按照照明入射角依次增大的顺序进行迭代重建，得到恢复出的高分辨率强度和相位像；
S1调节螺旋高度调节架使LED阵列与被测样品之间的距离为h1，依次点亮LED阵列上的各个发光单元；对应于每个发光单元，不同角度的照明光束从LED发光单元发出，经被测样品散射后通过由显微物镜和成像透镜组成的4f系统在成像透镜的后焦面上成一个低分辨率的强度像Imi(x,y)，并由相机记录；
S2通过调节螺旋高度调节架使LED阵列与被测样品之间的距离为h2，重复步骤S1，将相机在成像透镜后焦面上记录的低分辨率强度像记为Imi′(x,y)；
S3利用再现算法对记录到的低分辨率强度像Imi(x,y)和Imi′(x,y)进行重建。
2.根据权利要求1所述的一种双高度照明傅里叶叠层显微成像方法，其特征在于：重建过程分为以下四个步骤，S3.1在高度h1下，将LED阵列中心处发光单元的坐标记为(ξ0,η0),选择该发光单元照明下记录到的低分辨率强度像Im1(x,y)并用插值法扩大，生成猜测的高分辨率的初始光强分布Ih(x,y)，乘以猜测的随机相位 生成一幅猜测的样品高分辨率复振幅分布：将上式作傅里叶变换得到猜测的扩展频谱分布Uh(kx,ky)：
S3.2在高度h2下LED阵列中心发光单元(ξ0′,η0′)照明所记录的低分辨率强度像Im1′(x,y)，其中h2大于h1并将两个照明高度下拍到的所有低分辨率强度像Imi(x,y)和Imi′(x,y)按入射角从小到大顺时针排序,得到Imk(x,y)，k＝1,2,3,……2i-1，对应的入射角度为αk；
S3.3选择入射角为αk，此时k＝1，对应的频谱区域(-fc,fc)，作逆傅里叶变换得到猜测的低分辨率复振幅Ul(x,y):其中，fc＝NA/λ为成像系统的截止频率，NA为显微物镜的数值孔径，λ为LED发光单元的中心波长；保持相位 不变，将猜测的低分辨率复振幅Ul(x,y)的振幅Ilk(x,y)用实验记录的强度像Imk(x,y)替换，得到替换后的复振幅Ulm(x,y):再对其进行傅里叶变换，填回到对应的频谱区域(-fc,fc)中，更新扩展频谱的中心区域；
S3.4依次选择入射角为αk，此时k＝2,3,……2i-1，对应的频谱区域(-fc+fx,fc+fy)，其中fx、fy表示入射角为αk的照明光在频域kx,ky方向形成频移量fx、fy：其中，αkx和αky表示立体的入射角αk与x、y坐标轴形成的夹角；重复步骤S3.4，更新扩展频谱的其他区域；
重复步骤S3.3和步骤S3.4，直到频谱相邻区域重叠部分连续，达到收敛从而得到更新的扩展频谱；将这个扩展频谱作逆傅里叶变换就得到被测样品的高分辨率的复振幅分布。
一种双高度照明傅里叶叠层显微成像方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种双高度照明傅里叶叠层显微成像的方法，特别是涉及一种双平面照明傅里叶叠层提高成像精度和收敛速度的方法，属于光学技术领域。
背景技术
[0002] 光学显微镜在生物医学检测方面发挥着巨大应用，但是传统的光学显微镜存在两个缺陷：第一不能得到样品的相衬像；第二，当分辨率提高时，视场大幅度减小。而基于发光二极管(Light Emitting Diode，LED)阵列照明的傅里叶叠层显微(Fourier Ptychographic Microscopy,FPM)成像系统是在传统光学显微镜的基础上改造而成，二维的薄样品由来自不同角度的平面波照明，在物镜后焦面上样品的频谱被平移到对应的不同位置上，因此一些本来超出物镜数值孔径的频率成分被平移到物镜数值孔径以内，从而能够传递到成像面进行成像。通过重建程序将这些频率成分在频域进行合成得到样品的扩展频谱，作逆傅里叶变换就可以恢复样品的强度和相位分布。这种方法在样品的低频区域需要较高的频谱交叠率来满足图像重建的要求，但是单一高度下LED照明在频域形成的频谱交叠率存在中低频区域交叠率较低而高频区域交叠率较高的情况，为此可以通过改变样品与LED平面之间的距离，通过对两个高度下记录到的低分辨率强度像按照照明入射角依次增大的顺序共同进行重建迭代，可以增加低频部分采样率，进而在保持其它成像系统参数不变情况下，有效增大频谱中低频区域的交叠率和数据冗余度，进一步提高FPM的成像精度和收敛速度。
发明内容
[0003] 本发明的目的在于通过改变样品与LED平面之间的距离，通过对两个高度下记录到的低分辨率强度像按照照明入射角依次增大的顺序共同进行重建迭代，可以增加低频部分采样率，进而在保持其它成像系统参数不变情况下，有效增大频谱中低频区域的交叠率和数据冗余度，进一步提高FPM的成像精度和收敛速度。
[0004] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种双高度照明傅里叶叠层显微成像方法，实现该方法的成像系统光路包括螺旋高度调节架、LED阵列、被测样品、显微物镜、成像透镜、相机、显微镜。螺旋高度调节架用来固定LED阵列，通过螺旋高度调节架调节LED阵列的照明高度；LED阵列依次点亮发光单元用于为被测样品提供不同角度的照明光；被测样品置于LED阵列和显微物镜之间，被测样品处于显微物镜的焦平面上；显微物镜和成像透镜共同组成一个4f系统，照明光束从LED阵列发出，经被测样品散射后通过该4f系统在成像透镜的后焦面上成像，并由相机记录；相机用来记录被测样品在不同高度照明下的低分辨率的强度像Imi(x,y)和Imi′(x,y)，i＝1，2,3…N，N表示LED总个数；显微物镜、成像透镜均安装在显微镜上，显微镜的载物台用来固定样品。
[0005] 该方法包括在两个照明高度下的各个LED发光单元在同一高度下照明点光源，分别拍摄低分辨率的强度像Imi(x,y)和Imi′(x,y)，将两个高度下得到的强度像根据入射角依次增大且顺时针方向进行排序编号，再通过再现算法按照照明入射角依次增大的顺序进行迭代重建，得到恢复出的高分辨率强度和相位像。
[0006] 一种双平面照明傅里叶叠层显微成像方法，其提高成像精度和收敛速度的过程分为三个步骤：
[0007] S1调节螺旋高度调节架使LED阵列与被测样品之间的距离为h1，依次点亮LED阵列上的各个发光单元；对应于每个发光单元，不同角度的照明光束从LED发光单元发出，经被测样品散射后通过由显微物镜和成像透镜组成的4f系统在成像透镜的后焦面上成一个低分辨率的强度像Imi(x,y)，并由相机记录。
[0008] S2通过调节螺旋高度调节架使LED阵列与被测样品之间的距离为h2，重复步骤S1，将相机在成像透镜后焦面上记录的低分辨率强度像记为Imi′(x,y)。
[0009] S3利用再现算法对记录到的低分辨率强度像Imi(x,y)和Imi′(x,y)进行重建。重建过程分为以下四个步骤：
[0010] S3.1在高度h1下，将LED阵列中心处发光单元的坐标记为(ξ0,η0),选择该发光单元照明下记录到的低分辨率强度像Im1(x,y)并用插值法扩大，生成猜测的高分辨率的初始光强分布Ih(x,y)，乘以猜测的随机相位 生成一幅猜测的样品高分辨率复振幅分布：
[0011]
[0012] 将该高分辨率复振幅分布作傅里叶变换得到猜测的扩展频谱分布Uh(kx,ky)：
[0013]
[0014] S3.2在高度h2下LED阵列中心发光单元(ξ0′,η0′)照明所记录的低分辨率强度像Im1′(x,y)，其中h2大于h1并将两个照明高度下拍到的所有低分辨率强度像Imi(x,y)和Imi′(x,y)按入射角从小到大顺时针排序,得到Imk(x,y)，k＝1,2,3,……2i-1，对应的入射角度为αk。
[0015] S3.3选择入射角为αk，此时k＝1，对应的频谱区域(-fc,fc)，作逆傅里叶变换得到猜测的低分辨率复振幅Ul(x,y):
[0016]
[0017] 其中fc＝NA/λ为成像系统的截止频率，NA为显微物镜的数值孔径(NumericalAperture,NA)，λ为LED发光单元的中心波长。保持相位 不变，将猜测的低分辨率复振幅Ul(x,y)的振幅Ilk(x,y)用实验记录的强度像Imk(x,y)替换，得到替换后的复振幅Ulm(x,y):
[0018]
[0019] 再对其进行傅里叶变换，填回到对应的频谱区域(-fc,fc)中，更新扩展频谱的中心区域。
[0020] S3.4依次选择入射角为αk，此时k＝2,3,……2i-1，对应的频谱区域(-fc+fx,fc+fy)，其中fx、fy表示入射角为αk的照明光在频域kx,ky方向形成频移量fx、fy：
[0021]
[0022] 其中，αkx和αky表示立体的入射角αk与x、y坐标轴形成的夹角。与重复步骤S3.3，更新扩展频谱的其他区域。
[0023] 重复步骤S3.3和步骤S3.4，直到频谱相邻区域重叠部分连续，达到收敛从而得到更新的扩展频谱。将这个扩展频谱作逆傅里叶变换就得到被测样品的高分辨率的复振幅分布。
[0024] 本发明的典型实施例的试验结果表明，通过改变样品与LED阵列之间高度，在LED阵列大小、密度一定时，通过对两个高度下记录到的低分辨率强度像共同进行重建迭代重建，有效增大频谱中低频区域的交叠率和数据冗余度，进而在保持其它成像系统参数不变情况下，进一步提高FPM的提高成像精度和收敛速度。
[0025] 与现有技术相比，本发明提出的一种双平面照明LED阵列多角度照明提高成像精度和收敛速度的方法，通过对两个高度下记录到的低分辨率强度像共同进行重建迭代，不仅通过较近的高度照明保证了入射角的范围，从而保证了可恢复的频域大小和最终分辨率；而且通过较远高度的照明，可以在不改变LED发光单元阵列排布的前提下，有效增大频谱中低频区域的交叠率和数据冗余度，在保持其它成像系统参数不变情况下，进一步提高FPM的提高成像精度和收敛速度。
附图说明
[0026] 图1是一种基于双平面照明傅里叶叠层显微成像方法的系统光路。
[0027] 图中：1、螺旋高度调节架，2、32×32LED发光阵列，3、被测样品，4、显微物镜，5、成像透镜，6、科学级sCMOS相机，7、光学显微镜。
具体实施方式
[0028] 如图1所示，一种双高度照明傅里叶叠层显微成像方法，其特征在于：一种双高度照明傅里叶叠层显微成像方法，其成像系统光路包括螺旋高度调节架1，32x32发光单元的LED阵列2，被测样品3，显微物镜(4×、0.1NA)4，成像透镜5，科学级sCMOS相机6，显微镜7。螺旋高度调节架1用来固定32x32发光单元的LED阵列2和调节LED阵列2的照明高度h1，h2；32x32发光单元的LED阵列2依次点亮发光单元用于为被测样品3提供不同角度的照明光，其发光单元间距为5mm，波长为625nm；被测样品3被置于LED阵列2和显微物镜4之间，处于显微物镜4的焦平面上；显微物镜4和成像透镜5共同组成一个4f系统，照明光束从LED阵列发出，经被测样品3散射后通过该4f系统在成像透镜5的后焦面上成像，并由科学级sCMOS相机6记录；科学级sCMOS相机6分辨率为2560 x 2160，像元尺寸设置为6.5μm；用来记录被测样品在h1，h2高度照明下的低分辨率的强度像Imi(x,y)和Imi′(x,y)(i＝1，2,3…N，N表示LED总个数)；分辨率为2560 x 2160，像元尺寸设置为6.5μm；整个实验系统基于显微镜7搭建，其载物台用来固定样品2。
[0029] 该方法包括在两个照明高度下的各个LED发光单元在同一高度下照明点光源，分别拍摄低分辨率的强度像Imi(x,y)和Imi′(x,y)，将两个高度下得到的强度像根据入射角依次增大且顺时针方向进行排序编号，再通过再现算法按照照明入射角依次增大的顺序进行迭代重建，得到恢复出的高分辨率强度和相位像。
[0030] 一种双平面照明傅里叶叠层显微成像方法，其提高成像精度和收敛速度的过程分为三个步骤：
[0031] S1调节螺旋高度调节架1使LED阵列2与被测样品3之间的距离为h1，依次点亮LED阵列2上的各个发光单元；对应于每个发光单元，不同角度的照明光束从LED发光单元发出，经被测样品3散射后通过由显微物镜4和成像透镜5组成的4f系统在成像透镜5的后焦面上成一个低分辨率的强度像Imi(x,y)，并由科学级sCMOS相机6记录。
[0032] S2通过调节螺旋高度调节架1使LED阵列2与被测样品3之间的距离为h2，重复上述步骤S1，将科学级sCMOS相机6在成像透镜5后焦面上记录的低分辨率强度像记为Imi′(x,y)。
[0033] S3利用再现算法对记录到的低分辨率强度像Imi(x,y)和Imi′(x,y)进行重建。重建过程分为以下四个步骤：
[0034] S3.1在h1高度下，将LED阵列1中心处发光单元的坐标记为(ξ0,η0),选择该发光单元照明下记录到的低分辨率强度像Im1(x,y)并用插值法扩大,生成猜测的高分辨率的初始光强分布Ih(x,y),乘以猜测的随机相位 生成一幅猜测的样品高分辨率复振幅分布：
[0035]
[0036] 将该高分辨率复振幅作傅里叶变换得到猜测的扩展频谱分布Uh(kx,ky)：
[0037]
[0038] S3.2舍去较远高度h2下LED阵列1中心发光单元(ξ0′,η0′)照明所记录的低分辨率强度像Im1′(x,y)，并将两个照明高度下拍到的所有低分辨率强度像Imi(x,y)和Imi′(x,y)按入射角从小到大顺时针排序,得到Imk(x,y)(k＝1,2,3,……2i-1)，对应的入射角度为αk。
[0039] S3.3选择入射角为αk(k＝1)对应的频谱区域(-fc,fc)，作逆傅里叶变换得到猜测的低分辨率复振幅Ul(x,y):
[0040]
[0041] 其中fc＝NA/λ为成像系统的截止频率，NA为显微物镜4的数值孔径(Numerical Aperture,NA)，λ为LED发光单元2的中心波长。保持相位 不变，将猜测的低分辨率复振幅Ul(x,y)的振幅Ilk(x,y)用实验记录的强度像Imk(x,y)替换，得到替换后的复振幅Ulm(x,y):
[0042]
[0043] 再对其进行傅里叶变换，填回到对应的频谱区域(-fc,fc)中，更新扩展频谱的中心区域。
[0044] S3.4依次选择入射角为αk(k＝2,3,……2i-1)对应的频谱区域(-fc+fx,fc+fy)，其中fx、fy表示入射角为αk的照明光在频域kx,ky方向形成频移量fx、fy：
[0045]
[0046] 其中，αkx和αky表示立体的入射角αk与x、y坐标轴形成的夹角。与重复步骤S3.3，更新扩展频谱的其他区域。
[0047] 重复步骤S3.3和步骤S3.4，直到频谱相邻区域重叠部分连续，达到收敛从而得到更新的扩展频谱。将这个扩展频谱作逆傅里叶变换就得到被测样品3的高分辨率的复振幅分布。
[0048] 本发明的典型实施例的试验结果表明，通过改变样品2与LED阵列1之间高度，可以在LED阵列大小、密度一定时，通过对两个高度下记录到的低分辨率强度像共同进行重建迭代重建，有效增大频谱中低频区域的交叠率和数据冗余度，进而在保持其它成像系统参数不变情况下，进一步提高FPM的提高成像精度和收敛速度。
